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Purification and Characterization of Fish Oil Obtained from Hydrolysates of Mackerel (Scomber japonicus) By-products
Purification and Characterization of Fish Oil Obtained from Hydrolysates of Mackerel (Scomber japonicus) By-products
Journal of Life Science. 2016. Sep, 26(9): 1049-1055
Copyright © 2016, Korean Society of Life Science
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  • Received : May 12, 2016
  • Accepted : July 27, 2016
  • Published : September 30, 2016
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성훈, 김
지영, 신
현정, 김
진희, 김
지영, 양
jyyang@pknu.ac.kr

Abstract
본 연구에서는 고등어 부산물의 활용을 위해 가수분해된 고등어 부산물을 사용하였고, 분리된 유지를 시료로 하여 정제조건과 그 특성을 분석하였다. 탈검은 6% citric acid 수용액으로 시행하였을 때, 인의 함량이 45 mg/kg에서 5.8 mg/kg으로 감소하여 가장 효과적이었으며, 탈산은 8% sodium hydroxide수용액으로 처리하여 산가와 과산화물가가 각각 18.03 mgKOH/g에서 1.19 mg KOH/g과 30.25 meq/kg에서 3.18 meq/kg으로 감소하였다. 탈색은 activated charcoal을 5%로 사용하였을 때 산가와 과산화물가가 각각 0.17 mgKOH/g과 1.21 meq/kg으로 감소하였다. 색도의 변화는 탈산을 거쳤을 때 0.488 nm에서 0.057 nm로 감소하였는데 이후 탈색과정에서는 큰 변화를 보이지 않았다. 불포화 지방산의 조성 증가를 위해 냉침을 행하여 docosahexaenoic acid (DHA)와 eicosapentaenoic acid (EPA)의 함량의 합이 228.83 mg/g으로 측정되었으며, 오메가-3 지방산 함유 유지의 기준에 적합하게 정제하여 제품으로 활용이 가능함을 나타내었다.
Keywords
서 론
일반적으로 수산물 중에는 유용한 기능성 성분이 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 수산물의 처리에서 생성되는 부산물은 높은 지방함량으로 인해 산화가 빠르게 진행되어 기능성 성분이 다량 함유되어 있으나 일부만 낮은 품질의 사료나 어분 등으로 사용되며 높은 비율로 폐기되고 있다.
세계적으로 양식업 생산량은 1990년대 이후 정체된 어로어업생산량에 비해 급격히 증가하고 있으며 이에 따라 수산물 소비는 지속적인 증가세를 보이고 있다 [13 , 25] . 우리나라에서도 1인 수산물 소비량이 증가하는 추세이며 이로 인해 발생하는 수산부산물의 발생량은 80만 톤 전후로 추정되고 있다 [1] .
이러한 수산부산물로 발생하는 폐기물을 저감화하기 위해 여러가지 활용법이 사용되고 있는데, 사료나 어류양식에 쓰이는 어분으로 활용하거나 비타민이나 아스타잔틴 등은 약용으로 사용된다. 대부분의 어유는 어분의 제조공정에서 자숙, 압착 시 침출되는 자숙액과 압착액으로 제조를 한다.
어유는 단백질, 색소 등의 불순물을 포함하고 있으므로 직접 식용이나 식품가공의 원료로 이용하기에는 어려움이 있기때문에 정제를 필요로 하는데 일반적으로 탈검, 탈산, 탈색, 탈취 등이 사용된다. 탈검은 인지질 등의 검질을 제거하여 이 후 정제 단계를 수월하게 하고 탈산은 유리지방산을 제거하는 목적으로 알칼리 처리하여 유리지방산염의 형태로 분리시키며 탈색은 색소를 제거하기 위하여 주로 흡착법이 이용된다 [15] .
고등어( Scomber japonicus )는 4대 등푸른 생선 중 지질함량이 가장 높으며 특히, eicosapentaenoic acid (EPA) 및 docosahexaenoic acid (DHA)와 같은 고도 불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid)이 풍부하다 [9] . 고등어의 지질은 암예방 [11] , 심혈관 질환의 예방, 혈중 cholesterol 수치를 낮추어 주는 것으로 알려져 있으며 [25] , EPA는 순환기 계통의 질환방지 [19] , DHA는 뇌기능향상 및 심혈관 질환방지의 기능이 있는 것으로 보고된바 있다 [17] . EPA와 DHA는 체내에서 합성됨이 보고되어 있으나 [13] , 전구체는 체내합성이 되지 않으며 전환되는 효율 또한 매우 낮기 때문에 EPA와 DHA 효능을 기대하기 위해서는 전구체를 함유한 식품보다 DHA와 EPA를 많이 함유하고 있는 식품을 직접 섭취하는 것이 효과적이다 [12] .
일반적으로 어유는 어분의 제조공정에서 취하지만 본 연구에서는 고등어 부산물로 액비를 제조하기 위한 과정에서 가수분해시 상층에 분리되는 지질을 활용하기 위해 정제를 행하였으며 기준에 적합하게 하는 각 정제공정의 최적조건과 특성을 분석하였다. 또한 기능성지표성분 중 하나인 DHA와 EPA의 함량을 분석함으로써 건강기능식품 원료인 오메가-3 지방산으로 사용가능성을 연구하였다.
재료 및 방법
- 실험재료
본 실험에 사용한 고등어 부산물은 수산물 가공 업체인 (주)삼다(Jeju, Korea)로부터 가수분해되어 있는 상태로 제공받았으며, 그 중에서 상층에 분리된 유지를 이용하였다. 4℃ 이하 냉장고에 보관하면서 실험을 진행하였다. 그리고 사용된 시약은 실험용 특급 시약을 사용하였다.
- 탈검
탈검 과정을 위해 식품첨가물로 사용되는 citric acid를 사용하였으며 원료유지에 60℃로 가열한 citric acid 수용액을 각각 농도를 달리하여 첨가 후 60℃에서 300 rpm으로 20분간 교반하였다. 그 후 1,500 rpm에서 15 분간 원심분리하여 인지질을 포함한 검질을 분리하였다. 검질이 분리된 유지는 인의 함량을 분석하여 인지질의 제거율이 가장 높은 탈검 조건을 조사하였다.
- 탈산
탈검유에 각 농도별로 제조된 sodium hydroxide 수용액을 첨가한 후 60℃에서 200 rpm으로 20 분간 교반하여 반응시켰으며 그 후 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 유리지방산염이 분리된 상층의 유지를 취하였다. 그 후 가온한 동량의 물을 첨가하고 혼합한 뒤 분획여두에 방치하고 하층의 액을 제거하는 과정을 반복하여 수세한 후 여과하여 잔여 유리지방산염과 sodium hydroxide를 제거하였다. 그 후 산가, 과산화물가, 수율 등을 측정하여 가장 효과적인 탈산 조건을 조사하였다.
- 탈색
탈산 후 수세한 유지에 대해 각각 첨가량을 달리한 activated charcoal을 첨가한 후 60℃에서 20분간 감압 하에서 탈색하였다. 그 후 탈색제의 제거를 위해 감압여과를 통하여 여과필터를 통과시키고 과산화물가, 요오드가, 색도변화, 수율 등을 측정하였다.
- 냉침
포화지방산의 감소와 오메가-3 지방산 조성의 증가를 위하여 저온결정법으로 냉침을 하였다 [10] . 시료대비 10배의 핵산과 탈색유를 혼합한 후 -70℃에서 12시간 방치하여 결정화하였고 그 후 buchner funnel을 이용한 흡입여과로 결정을 신속히 여과하여 분리하였다. 여과지에 남은 여액은 저온으로 유지된 hexane을 부어 다시 여과한 후 합하였고 이 후 회전식 감압 농축기로 핵산을 제거하고 지방산 분석을 하여 냉침 과정을 거치지 않은 정제유지와 비교하였다.
- 인의 함량 측정
시료 20 g을 도가니에 취한 후 예비 탄화를 거쳐 회화로에서 500~550℃로 건식회화 하였다. 회화 후 회분에 0.5 N nitric acid를 가하고 가온하여 녹인 후 여과하였고 0.5 N nitric acid로 정용하여 inductively coupled plasma (ICP, Optima 3300XL, Perkin Elmer, USA)로 인의 함량을 분석하였다.
- 산가의 측정
산가는 유지 1 g중에 함유되어 있는 유리지방산을 중화시키는데 필요한 KOH의 mg수로 glyceride의 결합형태로 있지 않는 유리지방산의 양을 측정하는 것이며 정제된 식용유에서 산가는 보통 1.0 이하로 측정된다. 시료 5 g을 250 ml 삼각플라스크에 취한 뒤 ethyl-ether : ethanol (2 : 1) 혼합용액 100 ml와 혼합하여 완전히 용해시켰다. 그 후 phenolphthalein 지시약 3방울을 가하고 0.1 N KOH-ethanol 용액으로 연한 핑크색이 30 초간 지속될 때까지 적정한 뒤 식에 대입하여 산가를 측정하였으며 [14] , 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
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- 과산화물가의 측정
과산화물가는 유지 1 kg에 함유된 과산화물의 mg당량수로 과산화물은 유지의 산화가 진행됨에 따라 증가하다가 carbonyl화합물로 분해되어 결국에는 감소하는 특징이 있다. 이 값이 높을수록 식품으로서 부적당하며 보통 동물성 유지는 20-40 meq/kg일 때 산패발생시기로 본다. 시료 5 g을 acetic acid : chloroform (3:2) 용액 30 ml와 혼합하여 유지를 용해시키고 potassium iodine 포화용액 1 ml를 첨가한 뒤 강하게 흔들고 어두운 곳에 5분간 방치하였다. 그 후 30 ml의 증류수와 1% 전분지시액을 1 ml넣고 0.01 N sodium thiosulfate (Na 2 S 2 O 3 ) 용액으로 보라색이 무색이 되어 30초간 지속될 때까지 적정하고 다음 식에 대입하여 측정하였으며 [6] 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
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- 색도변화 및 수율의 측정
색도의 변화는 n-hexane에 시료를 2%로 녹인 후 469 nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였으며 [20] , 수율은 각각의 정제과정을 거친 시료와 거치기 전 시료의 부피에 대한 비로 나타내었다.
- 요오드가의 측정
요오드가는 불포화 지방산의 이중결합의 수를 나타내며, 이 값이 높을 수록 이중결합이 많음을 나타낸다. 시료 0.2 g을 chloroform 10 ml에 용해시킨 후 Wijs 시액 25 ml를 가하고 1시간 동안 암소에 방치하였다. 그 뒤 10% potassium iodine 용액 20 ml와 증류수 100 ml를 가하여 혼합하고 0.1N sodium thiosulfate 용액으로 적정 후 아래의 식에 대입하여 측정하였으며 [5] , 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
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- 지방산 조성 분석
지방산의 조성은 chloroform : methanol (2 : 1) 용액으로 지질을 용해하고 10% sodium chloride 용액과 증류수로 수세한 뒤 무수아황산나트륨과 filter paper로 탈수여과하고 [7] rotary evaporator (Eyela N-1000, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 용매를 제거한 후 분석하였다. 유지 0.1 g을 heptadexanoide acid 0.1% hexane solution 2 ml에 용해시키고 0.5 N sodium hydroxide methanol solution 3 ml를 가한 후, 105℃에서 5분 가열시키고 방냉하였다. 그 후 10% Boron trifluoride 3 ml를 가하고 105℃에서 5 분간 가열한 뒤 hexane 3 ml, 10% sodium chloride 1 ml를 가하여 methyl ester화 하였고 상층액을 취하여 0.45 um syringe filter에 통과시킨 후 gas chromatography로 분석하였다 [3 , 4] . Methyl ester mixture(Sigma-Aldrich Co., USA)를 표준지방산으로 하여 나타난 각 지방산의 retention time을 비교하여 동정하였으며 탈색후의 어유와 저온결정화 후의 어유에 대해 DHA와 EPA의 함량을 비교하였다.
결과 및 고찰
- 탈검 조건에 따른 인의 함량 변화
분리된 어유의 유지에 존재하는 인지질은 강한 유화성으로 탈산 공정에서 생성된 유리지방산염의 분리를 어렵게 하여 수율을 크게 감소시키고 열안정성이 적어 갈변 등 좋지 않은 영향을 미치기 때문에 유지의 정제 시 가장먼저 인산 등의 처리를 행하는 탈검 공정을 통해 제거된다 [16 , 24] . Citric acid 수용액의 처리에 따른 인의 함량변화는 Table 1 에 나타내었다. 원료의 인의 함량은 45 mg/kg을 나타내었고 2% 농도의 citric acid 수용액을 처리 시 잔존 인은 12.9 mg/kg으로 급격한 감소를 나타내었다. 4%의 경우에 인의 함량은 6.0 mg/kg을 나타내었고 4% 농도 이후에는 큰 변화를 나타내지 않았다. 6% 농도를 처리하였을 때 인의 함량은 5.8 mg/kg으로 가장 낮은 값을 보였고 이 후에는 감소를 나타내지 않아 6%로 처리하는 것이 가장 적절하다고 판단하였으며 이 조건에서 처리하여 다음 단계의 정제를 행하였다.
Changes of phosphorous contents affected by different concentration of citric acid solution
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Changes of phosphorous contents affected by different concentration of citric acid solution
- 탈산 조건의 설정 및 성상의 변화
유지의 산패가 진행됨에 따라 유리지방산이 생성되는데 이를 나타낸 값을 산가라고 한다. 산가가 높으면 탈색이나 탈취공정 중 유리지방산으로 인해 성상에 영향을 미치고 식용으로 부적합하기 때문에 알칼리수용액과 반응시켜 유리지방산을 유리지방산염의 형태로 만든 후 제거하는 공정을 거치게 되는데 이 과정을 탈산이라고 한다.
Sodium hydroxide 수용액의 농도에 따른 시료의 수율, 흡광도, 산가와 과산화물가는 Table 2 에 나타내었다. 산가와 과산화물가는 sodium hydroxide 수용액의 농도에 따라 비례적으로 감소함을 나타내었고 가장 높은 농도로 사용된 8% 수용액을 처리시 산가는 처리 전 18.03±0.04 mgKOH/g에서 1.11±0.01 mgKOH/g로 감소하였다. 과산화물가 또한 sodium hydroxide 수용액의 농도가 높을수록 감소율이 커졌으며 8% 처리시 3.15±0.03 meq/kg으로 가장 낮은 수치를 나타내었다. 산가는 대부분의 유지제품의 품질측정에서 쓰이고 있으며 과산화물가는 자동산화에 의해 생성된 과산화물의 양을 나타내는 것으로 이는 노화나 발암의 원인이 되므로 산가와 과산화물가를 가장 감소시킬 수 있는 조건으로 정제를 행하였다. 수율은 6% 농도이상부터 큰 차이가 없었으며 흡광도는 탈산 전 0.488에서 매우 큰 폭으로 감소하여 최대 0.058까지 감소하였는데 이는 다른 연구에서 대멸치유의 탈산시 흡광도가 0.398인 것과 큰 차이를 보였다 [18] .
Changes in yield rate, optical density, acid value and peroxide value affected by different concentration of sodium hydroxide solution
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Changes in yield rate, optical density, acid value and peroxide value affected by different concentration of sodium hydroxide solution
- 탈색 조건의 설정 및 성상의 변화
유지에 포함된 색소와 납 등의 중금속을 제거하기 위하여 탈색공정을 거치게 되는데 이때 주로 활성탄, 규산마그네슘, 활성백토 등이 탈색제로 사용되며 탈색의 주목적은 색을 제거하는 것이지만 이 외에도 탈산 공정 이 후 제거가 되지 않은 잔류 유리지방산염, 검질, 금속, 산화물이 제거되고 간접적으로 탈취에 영향을 준다. 탈산 공정에서 수세를 통하여 색도가 많이 향상됨을 볼 수 있었으나 추가적인 탈색 및 산가, 과산화물가의 감소를 위해 탈색공정을 행하였다. Activated charcoal을 탈색제로 사용하였으며 탈색제의 사용량에 따른 시료의 산가, 과산화물가, 요오드가, 수율 및 색도의 변화는 Table 3 에 나타내었다. 산가는 5% 처리시 0.18±0.02 mgKOH/g을 나타내었고 다른 농도로 처리시에도 모두 1 이하의 값을 나타내었지만 5% 보다 높은 양의 activated charcoal을 사용하였을 때 0.5 mgKOH/g 정도로 측정되어 유리지방산의 제거에는 5%의 activated charcoal을 사용하는 것이 가장 효과적인 것으로 나타났다. 다른 실험 공정을 사용한 경우와 비교해 보면, 대구를 SPD (Short-path distillation) system으로 정제한 결과 산가는 0.04-0.06 mgKOH/g을 나타내었는데 이는 부산물을 사용하지 않은 어류를 이용하였고 시스템에 의한 고순도의 정제과정임으로 본 실험과의 차이가 생겼을 것으로 판단된다[29]. 과산화물가는 activated charcoal의 사용량이 증가함에 따라 감소하였고 5% 처리시 1.58±0.23 meq/kg, 10% 처리시 1.21±0.02 meq/kg으로 측정되었다. 다른 연구에서 남방대구( Macruronus novaezelandiae )를 과산화물가는 2.32-2.38 meq/kg으로 본 연구와 차이가 있었다[29] 요오드가는 124.92±2.01에서 탈색 후 모두 100정도로 나타나 정제과정에서 감소함을 나타내었고 부산물에서 분리된 유지이지만 청어유와 비슷한 정도의 요오드가를 나타내어 불포화 지방산의 함량이 상당히 높을 것이라 알 수 있었다. 색도의 변화는 탈산 이후와 큰 차이를 나타내지 않았고 수율은 모두 70〜80%를 나타내었지만 사용량이 증가함에 따라 수율이 감소하였는데 이는 흡착제의 사용량의 증가로 인해 여과시 분리가 어려워지기 때문인 것으로 보인다. 탈산 후 0.067을 나타낸 색도는 탈색 시 0.04~0.06을 나타내어 탈산 과정에서 크게 감소한 후 탈색과정에서는 큰 변화를 나타내지 않았는데 가수분해를 거치면서 색소성분이 영향을 받아 탈산 과정에서 대부분의 색소가 제거되었기 때문인 것으로 보인다. 효과적인 산가의 감소를 위하여 activated charcoal을 5%처리하는 것이 가장 적합하다고 판단하였고 CODEX의 fish oil 기준이 산가 3 이하, 과산화물가 5 이하인 것을 고려하였을 때 [8] , 기준보다 매우 낮은 값을 나타내었다.
Changes of yields, optical density, acid value, peroxide value and iodine value affected by different concentration of activated charcoal
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Changes of yields, optical density, acid value, peroxide value and iodine value affected by different concentration of activated charcoal
- 정제에 따른 지방산 조성의 변화
원료 유지의 지방산 조성과 탈색, 냉침 후 지방산 조성은 Table 4 에 나타내었으며 일반적인 고등어 내장유의 지방산 조성과 비교하였다 [21] . 정제하지 않은 원료의 지방산 조성은 포화지방산 63.89%, 불포화지방산 35.8%로 나타났으며 일반적인 고등어 내장유와 가수분해 시 분리된 유지와 비교하였을 때, 포화지방산 조성이 일반 내장유에 비해 23.38% 높은 조성을 나타내었고 불포화지방산은 23.2% 낮게 나타났다. 다른 연구에서 SC-CO 2 와 속슬렛을 이용하여 측정한 결과 참치( Thunnus tonggol, Euthynnus affinis, Auxis thazard )의 포화 지방산이 39.7-48.5%로 나타났고, 단일 불포화 지방산조성이 21.9-26.6%, 고도 불포화 지방산이 24.1-27.9%로 나타났고, 고도 불포화지방의 경우 머리에서 17.0-19.9%, 피부에서 15.7-17.3%, 내장에서 14.3-16.1%로 나타나 고등어 부산물과 차이를 보였다 [24] .
Changes in fatty acid composition after bleaching and low temperature crystallization
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Changes in fatty acid composition after bleaching and low temperature crystallization
원료 유지의 불포화 지방산 중에 고도 불포화 지방산의 조성은 23.2%로 24.88%인 일반 고등어 내장유의 고도 불포화 지방산과 과 큰 차이를 나타내지 않았으나 단일 불포화 지방산은 12.6%로 나타나 34.12%인 내장유의 단일 불포화 지방산의 조성에 비해 21.52% 감소하였음을 나타내어 가수분해 후층 분리로 유지를 취하였을 때 단일 불포화 지방산이 영향을 가장 많이 받는 것으로 나타났다.
정제를 탈색과정까지 거쳤을 때의 변화는 고도 불포화 지방산이 23.83%에서 20.92%로 감소하였으나 단일 불포화 지방산과 포화 지방산은 변화가 크지 않았다. 저온결정화는 포화 지방산을 저온에서 결정화하고 여과를 통해 제거하는 과정으로 불포화 지방산의 증가를 위하여 행하였다. 저온결정화를 통해 포화 지방산이 10.5% 감소하였으며 불포화 지방산은 10.9% 증가하였다. 단일 불포화 지방산은 3.6%, 고도 불포화 지방산은 7.3% 증가하여 저온결정화를 행하였을 때 고도 불포화 지방산의 조성이 단일 불포화 지방산보다 더 영향을 많이 받는 것으로 나타났고 고도 불포화 지방산 중에 EPA와 DHA의 조성은 7.96%, 15.61%로 나타나 일반 고등어 내장유의 조성보다 더 높은 수치를 나타내었다.
- 정제 어유의 DHA, EPA함량변화
탈색 후와 냉침 후의 DHA와 EPA의 함량은 Table 5 에 나타내었다. 저온결정화전 EPA와 DHA의 합은 195.95 mg/g을 나타내었고 결정화 후에는 228.83 mg/g으로 결정화를 통해 32.1 mg/g이 증가함을 나타내었다. 이는 국내 기능성 식품 소재 중 어류 유래 원료를 사용한 오메가-3 지방산 함유 유지의 기준인 180 mg/g 이상을 만족하였으며 CODEX의 concentrated fish oil 기준인 40~60%를 미치진 못하였으나 이 기준은 유효성분을 증가시키기 위해 에스테르화 또는 가수분해 등의 공정을 거친 제품에도 해당되므로 가수분해시 상층에 층 분리되는 유지를 오메가-3 지방산 제품의 원료로 사용이 가능할 것으로 예상된다. 다른 연구에서 정어리 기름의 EPA와 DHA 함량이 냉침 전 후 1.78배 증가한 것과 비교하였을 때 큰 차이를 보이나 본 연구가 고등어 부산물인 것을 감안한 결과 연구성이 있다고 보인다 [22] .
DHA and EPA concentration after bleaching and crystallization
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DHA and EPA concentration after bleaching and crystallization
Acknowledgements
이 논문은 부경대학교 자율창의학술연구비(2015년)에 의하여 연구되었음.
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