Advanced
In vitro Anti-tumor Effect of an Engineered Vaccinia Virus in Multiple Cancer Cells and ABCG2 Expressing Drug Resistant Cancer Cells
In vitro Anti-tumor Effect of an Engineered Vaccinia Virus in Multiple Cancer Cells and ABCG2 Expressing Drug Resistant Cancer Cells
Journal of Life Science. 2016. Jul, 26(7): 835-846
Copyright © 2016, Korean Society of Life Science
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
  • Received : May 30, 2016
  • Accepted : July 18, 2016
  • Published : July 30, 2016
Download
PDF
e-PUB
PubReader
PPT
Export by style
Article
Author
Metrics
Cited by
About the Authors
지혜, 박
지수, 윤
정, 허
태호, 황
상모, 권
smkwon323@hotmail.com

Abstract
항암제 내성은 화학적 치료법의 가장 큰 난관의 하나로 효과적인 항암치료를 위해서 반드시 극복 되야 할 문제이다. ABCG2는 다약제 내성과 이를 특징으로 하는 암 줄기세포와의 연관성도 매우 높다고 보고되고 있다. 최근 암용해 바이러스가 다양한 암종과 항암제내성을 보이는 암 치료에 새로운 대안으로 대두되고 있다. 이에 본 연구에서는 항암제 내성 암 치료를 위해 새로운 암용해 백시니아 바이러스 SLJ-496을 개발하였다. 본 연구에서, cytophathic effect, plaque assay, viability assay를 통하여 야생형 바이러스에 비교하여 증가된 종양친화성을 확인하였다. 또한, invitro 환경에서 대장암 세포주(HT-29, HCT-116, HCT-8)를 비롯하여 위암 세포주(AGS, NCI-N87, MKN-28), 간암 세포주(SNU-449, SNU-423, SNU-475, HepG2) 그리고 난치성 암 종인 중피 세포종(NCI-H226, NCI-H28, MSTO-211h)에서 유의적인 세포독성효능을 입증하였다. ABCG2의 발현이 높은 HT-29세포의 3차원 구형배양을 통하여 ABCG2와 암줄기세포 특성의 연관성을 증명하였으며, 항암제 내성세포 모델에서 SLJ-496GFP가 유의한 세포독성을 나타내며 암세포내 복제능을 가지는 것을 입증하였다. ABCG2를 과발현 시킨 세포주 내 야생형 바이러스에 비교하여 유의적으로 낮은 세포 생존율을 증명하였으며, 바이러스의 복제능 또한 검증하였다. 또한, 지속적인 항암제 투여를 통하여 ABCG2의 발현이 높은 항암제 내성 세포주에서의 항종양 효능 또한 입증하였다. 이상의 결과를 토대로 ABCG2가 과발현 된 암 줄기세포 및 항암제 내성에 새로운 항종양 바이러스 SLJ-496 백시니아 바이러스 치료법이 새로운 치료 대안이 될 수 있을 것이라 제안한다.
Keywords
서 론
2007년 이후 현재까지 통계청에 발표에 의한 한국인의 사망 원인 1위가 암으로 나타났다. 암 치료법에 대한 이해의 증진에도 불구하고 암은 여전히 높은 사망률로 이어지고 있으며, 이러한 이유로 암의 정복을 위해 많은 연구 [11 , 37] 가 이루어지고 있는 실정이다. 화학적 치료법은 가장 흔히 사용되고 있는 항암요법 이지만 암선택성 결여 및 여러 부작용과 항암제 내성이 항암치료의 실패로 이어지고 있다. 때문에 새로운 암 치료법에 대한 기대가 높아지고 있으며 [28] , 최근 암 치료에 대한 새로운 대안으로 바이러스를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다 [1 , 5 , 8 , 33] .
백시니아 바이러스에서 종양 선택성이 보고된 이래로 이 바이러스의 유전자 조작을 통한 항 종양 바이러스치료는 임상 수준에서 [5 , 6 , 17 , 30] 많은 개발이 이루어지고 있다. 백시니아 바이러스는 이중나선의 DNA게놈을 가진 바이러스로 세포 밖 껍질을 보유하고 있어 항체에 의한 면역반응을 피할 수 있는 특징을 가진다 [20] . 암세포와 백시니아 바이러스 모두 DNA합성을 위해 Thymidine kinase (TK)라고 하는 효소를 이용하는데 백시니아 바이러스 내 이 TK 효소를 제거하여 암선택성을 높인 바이러스가 항 종양 치료에 주로 사용 되고 있다 [19 , 23 , 30] . 또한, 백시니아 바이러스를 사용하여 TK를 제거하고 GM-CSF를 발현하도록 조작한 JX-594는 현재 Pexa-Vec이라는 이름으로 희귀 의약품으로 지정되었으며 미국 FDA승인을 받아 글로벌 임상3상이 진행되고 있다 [7 , 12 , 17 , 31] . 요약컨데, 백시니아 바이러스를 이용한 항 종양 효능은 이미 입증되어 있으며 보다 효율적인 항 종양효능 증진을 위해 많은 연구가 이루어지고 있는 실정이다.
ABCG2는 포유류 세포막에 존재하는 ATP binding cassette (ABC) transporter 단백질군 중의 하나로, 세포 내 유입된 각종 대사산물이나 항암제와 같은 화합물들을 ATP를 소모하여 세포 밖으로 유출시키는 기능을 가지는 단백질로 알려져 있다 [15] . ABCG2 단백질은 간, 대장, 유방, 소장 등의 여러 조직에서 발현되며 [32 , 34] , 대장암 [9] 과 위암 [21] 을 비롯한 다양한 암 [18 , 38] 에서의 높은 발현이 보고된 바 있다. 또한 ABCG2는 일부 줄기세포 에서 특히 발현이 높은 것으로 알려져 있다 [40] . ABCG2는 화학적 항암요법에 사용되는 doxorubicin, irinotecan, mitoxantron 등의 여러 항암제를 기질로 하는 가장 중요한 multi-drug resistance transporter로 인식 [2 , 26 , 35] 되고, 항암제 내성 발생 기작과 관련 높은 것으로 알려져 있으며 [39] , 또한 자가 재생산능, 증식능, 항암제 내성과 같은 특징을 가지는 암 줄기세포 내 발현도 보고 되고 있다 [3] . 게다가 ABCG2는 대장암에서 암의 진행과 전이에 중요하다고 보고 된 바 있으며 [24] , 암 줄기세포의 마커와 화학적 암 치료에 새로운 타깃으로 제시된 바 있다 [3 , 14 , 27] .
이에 본 연구에서는 대장암과 위암에서 ABCG2를 과발현하거나 내생적으로 ABCG2의 발현이 높은 세포를 사용하여 암 줄기세포 특성 및 항암제 내성을 가지는 세포환경을 실험관 내 구현하고 새로운 백시니아 바이러스를 활용한 항종양 효능 분석을 위한 실험을 진행하였다.
재료 및 방법
- 세포 배양
인간 대장암 세포주 HT-29, HCT-8, HCT-116, 위암 세포주 (MKN-78, NCI-N87, AGS 그리고 간암세포주 HepG2, HeLa, U2O-S세포주는 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)로 부터 구매하여 사용하였다. 간암 세포주 SNU-475, SNU-423, SNU-449와 중피세포 종 NCI-H2452, NCI-H226, NCI-H28, MSTO-211h는 부산대학교 이상률교수님께 제공받아 사용하였다. 위암세포 SNU620 그리고 약물내성 위암 세포주 SNU-620 5FU100, SNU-620 ADR300 한국 세포주 은행으로부터 분양 받아 사용하였다. 암 세포주는 권장되는 RPMI-1640에 10% 소 태아혈청 그리고 1% penicillin/streptomycin 첨가된 배지에서 배양하였다. 바이러스 플라크 실험에 사용된 인간 골육종세포 U2O-S세포주는 DMEM high glucose (Welgene, Seoul, Korea) 배지에 10% 소 태아혈청(Gibco, Waltham, MA, USA) 그리고 1%penicillin /streptomycin (Welgene) 이 첨가된 배지에서 배양하였다. 모든 세포주는 5% CO2, 37℃환경에서 배양하였다.
- 세포의 3차원 구형배양
단층 배양한 인간 대장암 세포주 HT-29를 Trypsin/EDTA (Welgene)를 처리하여 탈착 하고 세포 수 계측을 통하여 Ultra low attachment 6well plates (Corning)에 600개의 세포(200세포/ml)를 분주 하였다. 3차원 구형배양을 위한 배지는 DMEM/F12 (Gibco)에 20 ng/ml EGF (R&D systems), 10 ng/ml of b-FGF (R&D systems, Minneapolis, MN, USA), 1% penicillin/streptomycin (Welgene)과 1 X B-27 supplement (Gibco)가 첨가된 배지를 사용하였으며, 5% CO 2 , 37℃환경에서 배양하였다.
- 암용해 백시니아 바이러스(SLJ-496 GFP)
실험에 사용된 백시니아 바이러스는 면역억제조건 하에 뉴질랜드 토끼 VX2종양모델의 혈관 내로 wyeth종 백시니아 바이러스를 주입하여 종양의 크기가 감소하는 시점에 혈청 내 바이러스를 단일 플라크 형태로 분리한 바이러스에(특허 10-2010-0064718) 암 선택성 증진을 위해 바이러스 내 thymidine kinase를 제거하고 추적을 위해 GFP를 삽입하여 제작하였다. 본 SLJ-496 바이러스는 ㈜신라젠과 황태호교수로부터 물질양도계약 (MTA)를 통하여 제공받아 본 실험에 사용하였다. 바이러스의 증폭에는 인간 자궁경부암 세포주 HeLa에 0.01 pfu의 바이러스를 2시간동안 감염시킨 후 새로운 배지로 교환하여 72시간 동안 5% CO 2 , 37 ℃환경에서 배양 한 후 세포를 배양한 배지와 감염된 세포를 수집하여 6,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거 한다. 바이러스성 pellet은 10 mM Tris (pH 9.0)에 현탁 한 후 고주파로 분해하여 36%sucrose 용액을 이용하여 12,000 rpm에 원심 분리 후 상층액 제거 후 pellet을 10 mM Tris (pH 9.0)에 현탁하여 -80℃에 보관한다. 바이러스는 플라크 분석을 통해 농도확인 후 실험에 사용하였다.
- 바이러스 플라크 분석
U2O-S 세포를 6 well plate에 well당 400,000 분주하여 24시간 배양한다. 단계 희석 된 바이러스 성 용액을 감염 후 2시간 후 2 XDMEM (Welgene)에 4% FBS (Gibco)와 1% Penicillin streptomycin (Welgene) 배지에 3% cardboxy methylcellulose (Sigma-Aldrich, St Luis, CA, US)를 1:1 혼합 한 용액으로 교환하고 72시간 배양 후 배지 제거 후 바이러스 플라크 정량을 위하여 0.2% crystal violet solution (Sigma-Aldrich)와 20% 에탄올로 염색한다. plaque수 × 희석배수 × ml로 환산하여 정량화한다.
- 세포 생존율 분석
바이러스에 의한 암세포 내 세포독성을 확인하기 위하여 96 well plate에 well당 10,000개의 세포를 분주하여 24시간 37℃, 5% CO 2 환경에서 배양하였다. 바이러스의 항종양 효능 확인을 위해 농축된 바이러스를 세포배양 배지에 농도 별로 단계 희석하여 희석된 바이러스를 각 well에 처리한다. 2시간 배양 후 혈청이 들어있는 세포배양 배지로 교환하여 준다. 항암제의 내성획득 확인을 위하여 96 well plate에 well당 10,000 개의 세포를 분주하고 배양 후 다음날 단계 희석된 각 농도의 항암제를 처리한다. 이후 72시간 동안 37 ℃, 5% CO2환경에서 세포 배양 후 Ez-cytox (Dail-lab, Seoul, Republic of Korea)를 세포배양 배지에 1:10으로 희석하여 2시간 배양 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 확인한다.
- 바이러스 복제능 확인
암 세포주 내 바이러스 복제 능 확인을 위하여 24well plate에 well당 100,000개의 해당 암 세포주를 분주하여 24시간 배양 후 0.1MOI SLJ-496GFP를 감염시킨다. 2, 24, 48, 96시간 세포와 배양액을 수득하여 -80℃ deep freezer에 보관 후 동결-용해를 3반복 및 고주파로 분해하여 세포 내 잔존 바이러스 수득 후 plaque실험에 사용한다. 단계 희석 된 바이러스성 용액을 U2O-S세포주에 감염시킨 후 바이러스 플라크 실험 후 생성된 플라크 수를 정량하여 바이러스 복제능을 검증한다.
- ABCG2 과발현 세포주의 구축
ABCG2 과발현 세포주의 구축을 위하여 PLVX-EF1α-IRES-mcherry vector에 ABCG2를 클로닝하여 과발현 vector제작 후 렌티 바이러스를 제작하였다. AGS, HCT-116 세포주 내 제작 된 렌티 바이러스를 감염 시켜 세포주 내로 형질주입시킨다. 계대 배양을 통하여 세포 수 획득 효율 및 안정화를 시킨 후 FACS AriaIII (BD, san Jose, CA)를 이용하여 ABCG2-m-cherry형광이 발현된 세포를 분리하여 배양한다. 분리된 세포주는 western blot을 통해 ABCG2 유전자의 과발현 여부를 확인하였다.
- Western blot 실험
ABCG2의 단백질 발현 양을 조사하기 위해 세포주를 PRO-PREP protein extraction solution (Intron Biotechnology, Seoul, Korea)에 용해하여 추출 후 BCA정량(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 하여 사용하였다. SDS-PAGE를 통해 단백질을 분리 후 PVDF (Millipore, Billerica, MA, USA) membrane으로 transfer 한 후 5% skim-milk로 blocking 하였다. 이후 ABCG2 항체(Protein Tech)과 β-actin (Santa Cruz, CA, USA)을 4℃에서 하룻밤 부착하고 다음날 TBST로 세척 후 상온에서 1시간 goat anti-mouse IgG-HRP (Santa Cruz )항체를 붙인다. ECL (Bionote, Hwaseong, Korea) detection reagent를 사용하여 단백질 발현 정도를 확인한다.
- 통계처리
모든 실험은 최소 3반복 이상 수행하였으며, 실험결과는 세포의 대조 군에 대한 백분율로 표시하였다. 통계학적인 유의 차는 independent t-test에 의한 p <0.05의 유의성으로 나타내었다.
결 과
- 새로운 자연형 종양친화 바이러스 SLJ-496GFP 바이러스의 구축
실험에 사용된 백시니아 바이러스 SLJ-496GFP의 구축 모식도를 Fig. 1A 에 제시하였다. SLJ-496GFP는 종양환경에서 진화를 통한 종양 친화성 바이러스로 면역 억제 하에 종양이 식립된 토끼에서 다계대 배양을 통해 선발하였다. 혈관 내 백시니아 바이러스 투여 후 종양의 크기가 감소되며 혈액에서 바이러스가 검출되는 시점에 토끼의 혈액을 채취하여 혈청에서 단일 플라크 형태로 분리하였다. 분리된 바이러스는 암에 대한 특이성 증대를 위하여 TK 유전자 부위를 결손 시키고 바이러스 추적을 위해 GFP를 삽입하여 새로운 자연형 암 용해 바이러스 SLJ-496GFP를 구축하였다. 야생 형 바이러스와 구축된 SLJ-496GFP의 바이러스의 효능 비교검증을 위하여 암 세포주에 0.1MOI의 바이러스를 감염시키고 3일 후 세포변성효과를 확인하였다. 야생 형 바이러스에 비교하여 SLJ-496GFP 바이러스 감염 후 세포변성효과가 증가하였다( Fig. 1B ). 바이러스 플라크 실험 결과에서도 동일한 농도의 바이러스 감염 후 SLJ-496GFP가 감염된 well 내 crystal violet의 염색의 정도가 감소한 결과를 확인하였다( Fig. 1C ). 암세포 내 세포 생존율 실험결과 마우스 대장 암 세포주 CT-26 ( Fig .1D )과, 중피세포 종 NCI-H226 ( Fig. 1D )에서 야생 형 백시니아 바이러스에 비교하여 세포생존율감소의 유의적인 차이를 입증하였다. 이를 통하여 야생 형 백시니아 바이러스에 비교하여 새로운 바이러스 SLJ-496GFP의 증가된 종양친화성을 검증하였다. .
PPT Slide
Lager Image
Development of SLJ-496GFP vaccinia virus. A. Scheme of SLJ-496GFP generation. B. Cytophatic effect of wild type vaccinia virus and SLJ-496GFP in HCT-8, HCT-116c. C. Viral plaque assay in HCT-8, HT-29, HCT-116. (WTVV: wild type vaccinia virus). D. Cytotoxicity of wild type vaccinia virus and SLJ-496 GFP in CT-26(upper panels), NCI-H226(lower panels) *,p<0.05 vs 0 MOI, **,p<0.01 vs 0 MOI.
- 다양한 암 세포주 내 SLJ-496GFP의 세포 독성
다양한 암 세포주 내에서의 SLJ-496GFP의 항 종양 효능 분석을 위해 세포생존율 분석을 수행하였다. 대장암 세포주 HCT-116은 0.01 MOI 이상 농도의 SLJ-496GFP 감염 후 유의적으로 세포생존율이 감소하였으며( Fig. 2A ), HCT-8, HT-29 에서도 0.1 MOI 이상 농도의 바이러스 감염 후 유의적으로 세포생존율이 감소한 결과를 보였다. 위암 세포주 NCI-N87은 0.01 MOI 이상에서 유의적으로 세포생존율 감소를 보였으며, MKN-78, AGS 세포주는 0.1 MOI 이상에서 유의적인 세포생존율의 감소를 확인하였다( Fig. 2A ). 또한, 간암세포주 SNU-449, SNU-475, HepG2에서 0.01 MOI 이상의 농도의 바이러스 감염 후 세포생존율의 유의적인 감소를 입증하였다( Fig. 2A ). 중피 세포 종 세포주 NCI-H2452, NCI-H226, NCI-H28, MSTO-211h 에서도 1MOI이상의 농도에서 유의적인 세포생존율의 감소된 결과를 나타내었다( Fig. 2A 오른쪽 아래). 감소된 세포 생존율을 통하여 여러 암세포주 내 SLJ-496GFP 항 종양효능을 증명하였다. 바이러스 감염 후 시간이 지남에 따른 바이러스 복제 능 확인을 위해 바이러스에 표지 된 GFP형광의 발현 정도를 형광현미경을 통해 관찰하였다( Fig. 2B ). HT-29와 HCT-116세포주 내 SLJ-496GFP감염 후 3일차까지 시간이 지남에 따라 암 세포주 내 감염된 바이러스 표지 평균형광강도가 유의적으로 증가하는 결과를 보였다. 특히, HCT-116 세포주 내 바이러스 감염 후 시간의존적으로 유의적인 평균형광강도의 증가를 확인하였다. 다음으로, 암세포주에서의 바이러스 증식 능력을 확인하였다. 그 결과 대장 암세포주 Lovo 세포에서 바이러스 감염 후 72시간째 유의적인 바이러스 증식( Fig. 2B )을 확인하였다. HT-29는 48시간째 바이러스의 유의적인 증가를 확인하였으며 HCT-116은 시간에 따른 바이러스 증식의 증가는 확인하였지만 유의적인 변화는 없었다. 정상세포 MEF (Mouse embryonic fibroblast)에서 바이러스 감염 후 암세포 특이적인 바이러스 복제 능을 검증한 결과 72시간 째 유의적으로 바이러스의 증가를 확인하였지만 암 세포주에 비교하여 극히 낮은 복제 능을 보였다( Fig. 2C ). 이를 통하여 SLJ-496GFP 바이러스의 암세포 특이적인 바이러스 복제 능을 입증하였다.
PPT Slide
Lager Image
Oncolytic effect of SLJ-496GFP in various cancer cell lines. A. Cytotoxicity of SLJ-496GFP in colorectal cancer, gastric cancer, hepatocellular cancer and mesothelioma. B. SLJ-496GFP replication assay in HT-29, HCT-116. Quantification of mean fluorescence intensity (MFI) in HT-29 and HCT-116. C. Viral replication assay in cancer cell lines. *,p<0.05 vs 0 MOI, **,p<0.01 vs 0 MOI.
- 항암제 내성모델 구축
세포주 내생의 ABCG2발현을 확인하기 위해 대장암 세포주 HT-29, Lovo, DLD-1, HCT-116, HCT-8 세포주 및 위암 세포주 MKN-28, NCI-N87, AGS 그리고 간암 세포주 SNU-354, SNU-423, SNU-449, SNU475, HepG2세포주의 단백질을 정제하여 ABCG2 단백질 발현을 western blot을 통하여 확인하였다( Fig. 3A ). 여러 암 세포 중 내생적으로 ABCG2의 발현이 가장 높은 HT-29세포주로 이후 실험을 진행하였다. HT-29세포의 3차원 구형배양을 시행하여 암 줄기세포의 특성인 자가 재생산 능을 검증 한 결과 3차원 세포구형의 반복적인 계대 배양을 통한 자가 재생산능이 효과적으로 확인되었다( Fig. 3B ). 또한 면역형광염색을 통하여 줄기세포 표지자 Sox2, Nanog, OCT3/4, c-Myc의 발현 정도를 확인한 결과 3차원 구형배양 시 Sox2와 c-Myc의 높은 발현을 확인할 수 있었으며, Nanog와 OCT3/4의 발현도 확인하였다( Fig. 3C ). 다음으로 ABCG2 과 발현 세포주에 항암제 Irinotecan과 Mitoxantrone을 처리하여 항암제 내성을 입증하고자 하였다. AGS세포주에 200 μM Iritnotecan 처리 후 ABCG2가 과발현된 세포주에서 3배 이상 유의적으로 높은 생존율을 보였다. HCT-116세포주 또한 ABCG2가 과발현되었을 때 세포생존율이 3배 이상 유의적으로 높게 나타났다. 특히 Mitoxantrone 100 μM처리 후 AGS 세포생존율 3.24±0.05%( p <0.001), AGS-ABCG2 세포생존율 67.86±8.48%( p <0.01)로 ABCG가 과발현된 세포주에서 20배 이상 유의적으로 높은 세포생존율을 확인하였다( Fig. 3D ). 또한, ABCG2의 과 발현을 통한 HCT-116세포주의 3차원 구형배양 능이 유의적으로 증가함을 확인하였다( Fig. 3E ). 이를 통하여 ABCG2의 과 발현 세포가 암 줄기세포의 특성을 가지는 것을 입증하였다.
PPT Slide
Lager Image
Assessment of ABCG2 overexpression cells. A. Expression of ABCG2 various cancer cell line. B. Sphere forming ability in HT-29 cells. a. 1st sphere, b. 2nd sphere, c. 3rdsphere, d.4th sphere. C. Immunostaining image. Expression of stemness markers c-Mye, SOX2, Nanog and OCT3/4 in HT-29 sphere cells. c-Myc (green). Sox2 (red), Nanog (green), OCT3/4 (red) and DAPI (blue). D. Chemo-resistance of ABCG2 overexpression cell lines. E. Sphere forming ability of ABCG2 overexpressed HCT-116 cells. (*,p<0.05, **,p<0.01, ***,p<0.001).
- ABCG2의 발현이 높은 암세포 내 SLJ-496GFP의 세포 독성
내생적으로 ABCG2의 발현이 높은 HT29 세포주를 3차원 구형 배양하여 암 줄기세포 유사 환경을 구축 한 후 SLJ-496GFP의 세포독성 효과를 확인하였다. 바이러스 감염 후 3일차에서 7일차까지 모니터링 한 결과 대조 군과 비교하여 바이러스 처리 군에서 3차원 구형 배양된 세포의 표면이 매끈하지 않고 깨지는 현상을 확인하였다( Fig. 4A ). 3차원 구형배양 세포의 형태학적인 분석을 통해 제시하였듯 농도의존적으로 구형배양이 깨지는 것을 확인하였으며( Fig. 4B ), 평균 구형배양 세포 면적을 정량화한 결과 1 MOI 농도에서 구형세포의 면적이 유의적으로 감소하였다. 또한 바이러스 감염 후 표지 된 평균 형광광도의 증가( Fig. 4C )를 통해 암 줄기세포 모델 내 SLJ-496GFP의 복제 능이 증가됨을 확인하였다.
PPT Slide
Lager Image
Oncolytic effect of SLJ-496GFP in HT-29 spheroid. A. HT-29 Spheroid formation in SLJ-496 infection. B. Single spheroid morphology after SLJ-496GFP infection and quantified average spheroid area. C. Fluorescence sensitivity image analysis after SLJ-496GFP infection.
- ABCG2 과발현시킨 세포모델 에서 SLJ-496GFP의 세포 독성
렌티 바이러스 시스템을 사용하여 ABCG2를 과 발현한 세포 에서 SLJ-496GFP의 세포독성 확인을 위하여 야생 형 백시니아 바이러스와 SLJ-496GFP를 각각 감염시킨 후 세포생존율을 분석하였다. 그 결과 SLJ-496GFP를 감염시킨 AGS-ABCG2와 HCT-116-ABCG2에서 농도의존적으로 세포독성이 나타남을 확인하였다( Fig. 5A ). 바이러스 복제 능을 확인한 결과 HCT-116ABCG2 세포주 내 바이러스성 평균형광강도가 유의적으로 증가하는 결과를 보였다( Fig. 5B ). 세포주 내 바이러스 농도 확인 실험에서 HCT-116ABCG2 세포주 내 유의적인 바이러스 농도의 증가를 확인하였다( Fig. 5C ).
PPT Slide
Lager Image
Oncolytic effect of SLJ-496GFP in ABCG2 expressing cells. A. Comparative cytotoxicity of SLJ-496GFP and wild type vaccinia virus in overexpressed ABCG2 cell lines. *,p<0.05 vs. 0 MOI, **,p<0.01 vs. 0 MOI. B. Fluorescence image of after infection SLJ-496GFP in HCT-116-ABCG2 cells (low panel-magnification) *,p<0.05 vs. 0 dpi. , **,p<0.01 vs. 0 dpi. (dpi: day of post infection). C. Analysis of SLJ-496 GFP viral replication in AGS-ABCG2 (left panel) and HCT-116-ABCG2 (right panel) *,p<0.05 vs. 0 hr control. ,**, p<0.01 vs. 0 hr control.
PPT Slide
Lager Image
Cytotoxicity of SLJ-496GFP in drug resistant ABCG2 expressing cells. A. ABCG2 expression analysis in SNU-620, SNU-620 5FU, SNU-620 ADR300. (SNU-620 5FU: 5-FU resistant cell line, SNU-620 ADR300: Adriamycin resistant cell line). B. Oncolytic effect of SLJ-496GFP in SNU-620, SNU-620 ADR300. **,p<0.01 vs. 0 MOI control.
- 항암제 내성 세포주 내 SLJ-496GFP의 세포 독성
5FU와 Adriamycin을 지속적으로 반복 투여하여 구축 된 SNU-620 세포주의 ABCG2 발현 정도를 western blot을 통해 확인한 결과 항암제 내성 세포주 SNU-620 5FU1000과 SNU-620 ADR300에서 ABCG2의 발현이 높음을 확인하였다. SNU-5FU와 SNU-620 ADR300은 SNU-620에 비교하여 해당 약물에 대한 상대내성이 각각 188과 7.1로 높은 약물내성이 알려져 있는 세포주이다. SNU-620세포주와 SNU-620ADR300 세포주 내 SLJ-496GFP의 세포독성을 증명한 결과 1MOI 이상에서 유의적인 세포독성을 확인하였다.
고 찰
정상세포에 비해 암세포에 대한 높은 선택성 획득에 대한 유전적인 메커니즘에 대한 연구가 이루어지면서 [22] 바이러스를 활용한 암 연구가 활발히 진행 되고 있다 [16 , 29 , 36] . 또한 면역작용으로부터 보호될 수 있는 이중막을 보유하고 있는 구조적인 특징 때문에 [20] 백시니아 바이러스의 새로운 암 치료제로서 가능성이 주목 받고 있다.
본 연구에서 새로운 백시니아 바이러스를 개발하여 항 종양 효능을 시험관 내 환경에서 입증하고자 하였다. SLJ-496GFP는 종양모델 내 바이러스 투여 후 혈청 내 분리정제를 통하여 암 친화성을 증진시켰으며, 야생형 바이러스와 비교한 Viral titer assay 결과 및 세포독성 비교분석을 통하여 이를 입증하였다( Fig. 1C ). 또한 마우스 배아 섬유아세포에 비교하여 암세포 내 유의적으로 높은 바이러스 복제를 통해 바이러스의 암세포 내 특이적인 증식능을 증명하였다. 또한 암세포 내 SLJ-496GFP의 증식능은 세포 내 바이러스성 형광 GFP 평균 형광감도의 증가와 증식능 확인실험결과를 통해서 암세포 내 유의적으로 바이러스의 증식이 유지됨을 확인하였다.
ABCG2는 다약제 내성을 가지는 세포 및 암 줄기세포에서 발현이 확인된 바 있으며 [9] , 이는 화학적 항암치료에 새로운 타겟으로 제시 되고 있다 [14] . 본 연구에서 ABCG2의 발현이 내생적으로 높은 HT-29 세포 3차원 구형배양의 유지를 통해 줄기세포의 특성인 자가 재생산 능과 줄기세포 표지자 Oct4, c-Myc, Nanog, Sox2 단백질 수준의 발현확인 및 ABCG2의 과 발현을 유도한 세포주 모델의 3차원 구형배양 능의 유의적인 증가를 통해 ABCG2와 암 줄기세포의 연관성을 제시하였다. 이는 다약제 내성과 암 줄기세포의 특성이 연관되어 있다는 이전의 보고와 [13] 부합하는 결과이며, ABCG2가 암 줄기 세포 마커로 활용될 수 있는 가능성을 [3 , 14] 뒷받침할 수 있는 결과이다.
ABCG2의 발현이 내생적으로 높은 약물내성 세포주 모델과 ABCG2가 과발현된 세포주 내 SLJ-496GFP의 농도의존적인 세포 독성 및 바이러스 증식의 유의적인 증가를 확인하였으며 또한 반복적인 항암제 투여를 통하여 구축된 항암제 내성 세포주 SNU-620 ADR300에서도 1MOI 이상의 농도에서 유의적인 세포독성을 확인하였다. 이를 통하여 다양한 항암제 내성 세포주 모델 내 SLJ-496GFP의 우수한 항종양 효능을 입증하였다.
본 연구에서는 세포수준 내 SLJ-496GFP의 효능을 우선적으로 검증하였기에 앞으로, 동물 종양 모델 내 바이러스의 투여를 통한 생존율 분석 및 종양 크기의 변화 등의 생체 내 검증실험이 더 필요할 것이다.
백시니아 바이러스를 활용한 항암연구는 활발히 진행되고 있으며 [4 , 10 , 25] , 이에 따른 항암치료제로서의 기대효과도 높아지고 있는 실정이다. 본 연구진은 새로운 백시니아 바이러스 SLJ-496GFP의 종양친화성을 야생형보다 유의적으로 증진시켰으며, 시험관내 수준에서의 항 종양효능을 검증하였다. 또한 ABCG2의 발현이 높은 항암제 내성 세포주 모델 내에서의 항종양 효능 및 바이러스 증식능을 입증하였다. 이상의 결과들을 토대로 ABCG2의 발현이 높은 약물내성 항암 치료에 새로운 대안으로 백시니아 바이러스 SLJ-496GFP의 가능성을 제시한다.
Acknowledgements
이 논문은 부산대학교 기본연구지원사업(2년)에 의하여 연구되었음.
References
Alemany R 2013 Viruses in cancer treatment Clin. Transl. Oncol. 15 182 - 188    DOI : 10.1007/s12094-012-0951-7
Ambudkar S. V. , Dey S. , Hrycyna C. A. , Ramachandra M. , Pastan I. , Gottesman M. M. 1999 Biochemical, cellular, and pharmacological aspects of the multidrug transporter Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 39 361 - 398    DOI : 10.1146/annurev.pharmtox.39.1.361
An Y. , Ongkeko W. M 2009 ABCG2: the key to chemoresistance in cancer stem cells? Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 5 1529 - 1542    DOI : 10.1517/17425250903228834
Bartlett D. L. , Liu Z. , Sathaiah M. , Ravindranathan R. , Guo Z. , He Y. , Guo Z. S. 2013 Oncolytic viruses as therapeutic cancer vaccines Mol. Cancer 12 103 -    DOI : 10.1186/1476-4598-12-103
Bell J. , McFadden G. 2014 Viruses for tumor therapy Cell Host Microbe 15 260 - 265    DOI : 10.1016/j.chom.2014.01.002
Breitbach C. J. , Arulanandam R. , De Silva N. , Thorne S. H. , Patt R. , Daneshmand M. , Moon A. , Ilkow C. , Burke J. , Hwang T. H. , Heo J. , Cho M. , Chen H. , Angarita F. A. , Addison C. , McCart J. A. , Bell J. C. , Kirn D. H. 2013 Oncolytic vaccinia virus disrupts tumor-associated vasculature in humans Cancer Res 73 1265 - 1275    DOI : 10.1158/0008-5472.CAN-12-2687
Breitbach C. J. , Moon A. , Burke J. , Hwang T. H. , Kirn D. H. 2015 A Phase 2, Open-label, randomized study of Pexa-Vec (JX-594) administered by intratumoral injection in patients with unresectable primary hepatocellular carcinoma Methods Mol. Biol. 1317 343 - 357
Burke M. J. , Ahern C. , Weigel B. J. , Poirier J. T. , Rudin C. M. , Chen Y. , Cripe T. P. , Bernhardt M. B. , Blaney S. M. 2015 Phase I trial of Seneca Valley Virus (NTX-010) in children with relapsed/refractory solid tumors: a report of the Children′s Oncology Group Pediatr Blood Cancer 62 743 - 750    DOI : 10.1002/pbc.25269
Candeil L. , Gourdier I. , Peyron D. , Vezzio N. , Copois V. , Bibeau F. , Orsetti B. , Scheffer G. L. , Ychou M. , Khan Q. A. , Pommier Y. , Pau B. , Martineau P. , Del Rio M 2004 ABCG2 overexpression in colon cancer cells resistant to SN38 and in irinotecan-treated metastases Int. J. Cancer 109 848 - 854    DOI : 10.1002/ijc.20032
Chernichenko N. , Linkov G. , Li P. , Bakst R. L. , Chen C. H. , He S. , Yu Y. A. , Chen N. G. , Szalay A. A. , Fong Y. , Wong R. J. 2013 Oncolytic vaccinia virus therapy of salivary gland carcinoma JAMA Otolaryngol. Head Neck Surg. 139 173 - 182    DOI : 10.1001/jamaoto.2013.1360
Choi J. W. , Lee J. S. , Kim S. W. , Yun C. O. 2012 Evolution of oncolytic adenovirus for cancer treatment Adv. Drug Deliv. Rev. 64 720 - 729    DOI : 10.1016/j.addr.2011.12.011
Cripe T. P. , Ngo M. C. , Geller J. I. , Louis C. U. , Currier M. A. , Racadio J. M. , Towbin A. J. , Rooney C. M. , Pelusio A. , Moon A. , Hwang T. H. , Burke J. M. , Bell J. C. , Kirn D. H. , Breitbach C. J. 2015 Phase 1 study of intratumoral Pexa-Vec (JX-594), an oncolytic and immunotherapeutic vaccinia virus, in pediatric cancer patients Mol. Ther. 23 602 - 608    DOI : 10.1038/mt.2014.243
Dean M. , Fojo T. , Bates S. 2005 Tumour stem cells and drug resistance Nat. Rev. Cancer 5 275 - 284    DOI : 10.1038/nrc1590
Ding X. W. , Wu J. H. , Jiang C. P. 2010 ABCG2: a potential marker of stem cells and novel target in stem cell and cancer therapy Life Sci 86 631 - 637    DOI : 10.1016/j.lfs.2010.02.012
Doyle L. A. , Yang W. , Abruzzo L. V. , Krogmann T. , Gao Y. , Rishi A. K. , Ross D. D. 1998 A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 15665 - 15670    DOI : 10.1073/pnas.95.26.15665
Freytag S. O. , Barton K. N. , Zhang Y. 2013 Efficacy of oncolytic adenovirus expressing suicide genes and interleukin-12 in preclinical model of prostate cancer Gene Ther 20 1131 - 1139    DOI : 10.1038/gt.2013.40
Heo J. , Reid T. , Ruo L. , Breitbach C. J. , Rose S. , Bloomston M. , Cho M. , Lim H. Y. , Chung H. C. , Kim C. W. , Burke J. , Lencioni R. , Hickman T. , Moon A. , Lee Y. S. , Kim M. K. , Daneshmand M. , Dubois K. , Longpre L. , Ngo M. , Rooney C. , Bell J. C. , Rhee B. G. , Patt R. , Hwang T. H. , Kirn D. H. 2013 Randomized dose-finding clinical trial of oncolytic immunotherapeutic vaccinia JX-594 in liver cancer Nat. Med. 19 329 - 336    DOI : 10.1038/nm.3089
Hu L. L. , Wang X. X. , Chen X. , Chang J. , Li C. , Zhang Y. , Yang J. , Jiang W. , Zhuang S. M. 2007 BCRP gene polymorphisms are associated with susceptibility and survival of diffuse large B-cell lymphoma Carcinogenesis 28 1740 - 1744    DOI : 10.1093/carcin/bgm113
Hwang T. H. , Moon A. , Burke J. , Ribas A. , Stephenson J. , Breitbach C. J. , Daneshmand M. , De Silva N. , Parato K. , Diallo J. S. , Lee Y. S. , Liu T. C. , Bell J. C. , Kirn D. H. 2011 A mechanistic proof-of-concept clinical trial with JX-594, a targeted multi-mechanistic oncolytic poxvirus, in patients with metastatic melanoma Mol. Ther. 19 1913 - 1922    DOI : 10.1038/mt.2011.132
Ichihashi Y. 1996 Extracellular enveloped vaccinia virus escapes neutralization Virology 217 478 - 485    DOI : 10.1006/viro.1996.0142
Jiang Y. , He Y. , Li H. , Li H. N. , Zhang L. , Hu W. , Sun Y. M. , Chen F. L. , Jin X. M. 2012 Expressions of putative cancer stem cell markers ABCB1, ABCG2, and CD133 are correlated with the degree of differentiation of gastric cancer Gastric Cancer 15 440 - 450    DOI : 10.1007/s10120-012-0140-y
Kirn D. , Martuza R. L. , Zwiebel J. 2001 Replication-selective virotherapy for cancer: Biological principles, risk management and future directions Nat. Med. 7 781 - 787    DOI : 10.1038/89901
Kirn D. H. , Thorne S. H. 2009 Targeted and armed oncolytic poxviruses: a novel multi-mechanistic therapeutic class for cancer Nat. Rev. Cancer 9 64 - 71    DOI : 10.1038/nrc2545
Liu H. G. , Pan Y. F. , You J. , Wang O. C. , Huang K. T. , Zhang X. H. 2010 Expression of ABCG2 and its significance in colorectal cancer Asian Pac. J. Cancer Prev. 11 845 - 848
Marchesi V. 2013 Immunotherapy: Oncolytic vaccinia virus shows promise in liver cancer Nat. Rev. Clin. Oncol. 10 182 -
Miyake K. , Mickley L. , Litman T. , Zhan Z. , Robey R. , Cristensen B. , Brangi M. , Greenberger L. , Dean M. , Fojo T. , Bates S. E. 1999 Molecular cloning of cDNAs which are highly overexpressed in mitoxantrone-resistant cells: demonstration of homology to ABC transport genes Cancer Res 59 8 - 13
Noguchi K. , Katayama K. , Sugimoto Y. 2014 Human ABC transporter ABCG2/BCRP expression in chemoresistance: basic and clinical perspectives for molecular cancer therapeutics Pharmgenomics Pers Med 7 53 - 64
Ortiz R. , Melguizo C. , Prados J. , Alvarez P. J. , Caba O. , Rodriguez-Serrano F. , Hita F. , Aranega A. 2012 New gene therapy strategies for cancer treatment: a review of recent patents Recent Pat Anticancer Drug Discov 7 297 - 312    DOI : 10.2174/157489212801820093
Parato K. A. , Breitbach C. J. , Le Boeuf F. , Wang J. , Storbeck C. , Ilkow C. , Diallo J. S. , Falls T. , Burns J. , Garcia V. , Kanji F. , Evgin L. , Hu K. , Paradis F. , Knowles S. , Hwang T. H. , Vanderhyden B. C. , Auer R. , Kirn D. H. , Bell J. C. 2012 The oncolytic poxvirus JX-594 selectively replicates in and destroys cancer cells driven by genetic pathways commonly activated in cancers Mol. Ther. 20 749 - 758    DOI : 10.1038/mt.2011.276
Park B. H. , Hwang T. , Liu T. C. , Sze D. Y. , Kim J. S. , Kwon H. C. , Oh S. Y. , Han S. Y. , Yoon J. H. , Hong S. H. , Moon A. , Speth K. , Park C. , Ahn Y. J. , Daneshmand M. , Rhee B. G. , Pinedo H. M. , Bell J. C. , Kirn D. H. 2008 Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial Lancet Oncol 9 533 - 542    DOI : 10.1016/S1470-2045(08)70107-4
Park S. H. , Breitbach C. J. , Lee J. , Park J. O. , Lim H. Y. , Kang W. K. , Moon A. , Mun J. H. , Sommermann E. M. , Maruri Avidal L. , Patt R. , Pelusio A. , Burke J. , Hwang T. H. , Kirn D. , Park Y. S. 2015 Phase 1b trial of biweekly intravenous Pexa-Vec (JX-594), an oncolytic and immunotherapeutic vaccinia virus in colorectal cancer Mol. Ther. 23 1532 - 1540    DOI : 10.1038/mt.2015.109
Raaijmakers M. H. , de Grouw E. P. , Heuver L. H. , van der Reijden B. A. , Jansen J. H. , Scheffer G. , Scheper R. J. , de Witte T. J. , Raymakers R. A. 2005 Impaired breast cancer resistance protein mediated drug transport in plasma cells in multiple myeloma Leuk Res 29 1455 - 1458    DOI : 10.1016/j.leukres.2005.04.013
Roth J. C. , Cassady K. A. , Cody J. J. , Parker J. N. , Price K. H. , Coleman J. M. , Peggins J. O. , Noker P. E. , Powers N. W. , Grimes S. D. , Carroll S. L. , Gillespie G. Y. , Whitley R. J. , Markert J. M. 2014 Evaluation of the safety and biodistribution of M032, an attenuated herpes simplex virus type 1 expressing hIL-12, after intracerebral administration to aotus nonhuman primates Hum. Gene Ther. Clin. Dev. 25 16 - 27    DOI : 10.1089/humc.2013.201
Sargent J. M. , Williamson C. J. , Maliepaard M. , Elgie A. W. , Scheper R. J. , Taylor C. G. 2001 Breast cancer resistance protein expression and resistance to daunorubicin in blast cells from patients with acute myeloid leukaemia Br. J. Haematol. 115 257 - 262    DOI : 10.1046/j.1365-2141.2001.03122.x
Schinkel A. H. , Jonker J. W. 2003 Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette (ABC) family: an overview Adv. Drug Deliv. Rev. 55 3 - 29    DOI : 10.1016/S0169-409X(02)00169-2
Stanziale S. F. , Fong Y. 2003 Novel approaches to cancer therapy using oncolytic viruses Curr. Mol. Med. 3 61 - 71    DOI : 10.2174/1566524033361663
Valdespino-Gomez V. M. , Valdespino-Castillo V. E. 2012 [Targeted epigenetic therapy of cancer. Achievements and perspectives] Cir. Cir. 80 470 - 480
Yoh K. , Ishii G. , Yokose T. , Minegishi Y. , Tsuta K. , Goto K. , Nishiwaki Y. , Kodama T. , Suga M. , Ochiai A. 2004 Breast cancer resistance protein impacts clinical outcome in platinum-based chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer Clin. Cancer Res. 10 1691 - 1697    DOI : 10.1158/1078-0432.CCR-0937-3
Zhou S. , Morris J. J. , Barnes Y. , Lan L. , Schuetz J. D. , Sorrentino B. P. 2002 Bcrp1 gene expression is required for normal numbers of side population stem cells in mice, and confers relative protection to mitoxantrone in hematopoietic cells in vivo Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 12339 - 12344    DOI : 10.1073/pnas.192276999
Zhou S. , Schuetz J. D. , Bunting K. D. , Colapietro A. M. , Sampath J. , Morris J. J. , Lagutina I. , Grosveld G. C. , Osawa M. , Nakauchi H. , Sorrentino B. P. 2001 The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype Nat. Med. 7 1028 - 1034    DOI : 10.1038/nm0901-1028