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Anti-cancer Potentials of Rhus verniciflua Stokes, Ulmus davidiana var. japonica Nakai and Arsenium Sublimatum in Human Gastric Cancer AGS Cells
Anti-cancer Potentials of Rhus verniciflua Stokes, Ulmus davidiana var. japonica Nakai and Arsenium Sublimatum in Human Gastric Cancer AGS Cells
Journal of Life Science. 2015. Aug, 25(8): 849-860
Copyright © 2015, Korean Society of Life Science
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  • Received : June 07, 2015
  • Accepted : August 03, 2015
  • Published : August 30, 2015
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일성 백
nugabis@naver.com
령해 임
철 박
영현 최
nugabis@naver.com

Abstract
본 연구에서는 한약재로 널리 사용되는 건칠, 유근피 및 신석 추출물의 항암 활성을 조사하였다. 생쥐 유래 정상세포(RAW 264.7 대식세포 및 C2C12 근아세포)에서는 건칠, 유근피 및 신석 단독 및 복합 처리에 의하여 유의적인 세포생존율의 억제 현상은 관찰 할 수 없었다. 그리고 건칠, 유근피 및 신석의 복합 처리는 단독 처리군에 비하여 AGS 위암세포의 생존력을 유의적으로 억제하였으나, 폐암(A549), 대장암(HCT116), 간암(Hep3B) 및 방광암(T24) 세포에서는 그 효과가 미비하였다. 아울러 이러한 AGS 위암세포 선택적 생존 억제력은 apoptosis 유도와 밀접한 연관성이 있음을 염색질의 응축 현상, DNA 단편화 및 annexin-V 염색에 의한 flow cytometry 분석을 통하여 확인하였다. 건칠, 유근피 및 신석의 복합 처리는 Fas 및 Fas legand의 발현을 증가시켰으며, XIAP, cIAP-1 및 survivin과 같은 IAP family 단백질과 anti-apoptotic Bcl-xL의 발현은 저하시켰다. 복합 처리는 또한 mitochondrial membrane potential의 손실과 caspases (-3, -8 및 -9)의 활성에 PARP 단백질의 분절화를 유도하였다. 그러나 이러한 복합 처리에 의한 AGS 세포에서 관찰된 세포독성 및 apoptosis 유도 효과는 pan-caspases inhibitor인 z-VAD-fmk의 선처리에 의하여 차단되었다. 이상의 결과는 건칠, 유근피 및 신석의 복합 처리에 의한 AGS 위암세포 선택적 apoptosis 유도가 caspase 의존적으로 일어나고 있음을 보여주는 결과이며, in vivo 모델을 이용한 후속 연구가 진행되어야 할 것이다.
Keywords
서 론
난치성 질병으로 분류되고 있는 암을 치료하는 전통적인 방법으로는 외과적 수술, 화학요법 및 방사선요법 등이 있지만 외과적 수술을 시행하더라도 화학요법 및 방사선요법을 병행하는 경우가 대부분이다. 하지만 화학요법 및 방사선요법을 시행하였을 경우 골수세포와 소장 상피세포에 심각한 영향을 주는 등 정상세포에도 영향을 미치게 되어 많은 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있다 [7 , 10] . 특히 화학요법에 사용되는 다양한 종류의 항암제들은 개개인에 따라서 약리작용이 다르게 나타나고 독성에 의한 부작용이 유발되기 때문에 최근에는 부작용이 거의 없는 천연물에서 효과적인 생리활성을 지닌 물질을 발굴하여 분자 및 세포 수준에서의 기전을 밝힘으로서 정상세포에는 영향을 주지 않고 암세포의 선택적인 죽음을 유발시키는 연구가 활발하게 진행되고 있다.
암을 치료하기 위하여 사용되는 여러 가지 방법 중에서 가장 효율적인 치료방법은 암세포의 분열과 증식을 억제하고 선택적으로 암세포를 제거하는 것이다. 특히 조직화된 세포의 죽음으로서 세포자가사멸 기전으로 알려진 apoptosis는 태아의 형태형성, 난자의 배란, 신경세포의 시냅스 형성 등과 같은 개체의 발생단계에서 정상적인 발달과 분화에 관여할 뿐 만 아니라 DNA 손상, 바이러스 감염 등에 의한 체내 비정상적인 세포들을 제거하는 생리학적 과정으로서 유전적 조절 하에서 일어나는 정교한 개체의 생존을 위한 방어기전이며 손상된 세포들의 제거를 위한 중요한 수단이다 [9 , 28] . 이러한 apoptosis의 유발은 세포의 종류와 손상된 형태에 따라 다양한 유전자 산물의 활성 변화가 관여하며, 형태형성, 세포의 전환 및 손상된 조직이나 감염된 세포들의 제거 등과 같은 생물학적 현상과 건강을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져있다. 하지만 이러한 apoptosis 과정이 실패하게 되면 암을 포함한 여러 가지 질병의 원인이 되므로 apoptosis는 암화 과정의 여러 단계에서 암을 치료하는 중요한 표적이 되고 있다 [12 , 14] . 이러한 측면에서 최근 전통 한의학에 기반을 둔 다양한 한약재의 발굴은 천연 항암제 개발에 매우 유용하다고 할 수 있다.
비록 오랜 기간 동안 전통의학에서 암의 예방과 치료를 위한 다양한 약물들이 사용되어 왔으나, 이에 대한 과학적 근거가 미흡한 실정이다. 본 연구에서는 다양한 한약제를 이용한 항암 후보군을 발굴하고 이들의 조합에 의한 항암활성 증대 가능성을 지닌 새로운 처방전을 제시하고자 한다. 이를 위하여 그 동안 단일 약재로서 항암 효능이 확인된 건칠(乾漆), 유근피(楡根皮) 및 신석(信石)의 항암 활성을 비교하고, 이들의 조합을 통하여 항암활성을 극대화시킬 수 있는 비율을 선정하고자 한다. 즉 건칠, 유근피 및 신석 추출물의 단독 및 복합처리가 다양한 정상 및 암세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였고, 이들 중 증식억제 효과가 가장 뛰어난 시료가 apoptosis 유발에 어떠한 영향을 미치는 지를 유전자 수준에서 조사한 결과 몇 가지 중요한 유전자들의 발현 변화에 대한 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
재료 및 방법
- 실험재료
본 실험에 사용된 건칠(Geonchil, GC), 유근피(Ugeunpi, UGP) 및 신석(Shinsok, SS)은 천보당제암한의원(대구)에서 제공받았으며 3차 증류수를 이용하여 100 mg/ml의 농도로 만든 다음 이를 적정 농도로 배지에 희석하여 사용하였다. 단백질 분석을 위하여 사용된 tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), death receptor 4 (DR4), DR5, Fas, Fas ligand (FasL), Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad, Bid, X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP), cellular inhibitor of apoptosis protein-1 (cIAP-1), cIAP-2, survivin, caspase-3, caspase-8, caspase-9, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), β-catenin, phospholipase C gamma-1 (PLCγ-1) 및 actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, immunoblotting을 위해 2차 항체로 사용된 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse 및 anti-rabbit 항체는 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. 또한 caspases의 in vitro 활성 측정을 위한 colorimetric assay kit는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였으며, caspases의 활성을 억제하기 위하여 사용된 pan-caspases inhibitor인 z-VAD-fmk는 CalBiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
- 세포배양
본 연구에 사용된 mouse 정상세포주인 RAW 264.7 대식세포 및 C2C12근아세포와 폐암(A549), 대장암(HCT116), 간암(Hep3B), 방광암(T24) 및 위암(AGS)세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양받았으며 90%의 RPMI-1640 및 DMEM 배지(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)에 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Gibco-BRL), 2 mM glutamine, 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin (Gibco BRL)이 포함된 배지를 사용하여 5% CO 2 , 37℃의 조건하에서 배양하였다. 배지는 매 48시간마다 교환해주었고, 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.05% trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA, Gibco-BRL)를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 적정수의 세포를 분주하여 재배양하였다.
- MTT assay에 의한 세포 증식억제 조사
건칠, 유근피 및 신석의 단독 및 복합처리에 의한 증식억제의 정도를 확인하기 위하여 MTT assay를 이용하였다. 이를 위하여 준비된 정상 및 암세포에 적정농도의 건칠, 유근피 및 신석을 단독 및 복합 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 노란색의 soluble substrate인 tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma-Aldrich)를 0.5 mg/ml 농도로 희석하여 2 ml씩 분주하고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 1 ml씩 분주하여 well에 생성된 insoluble한 보라색의 MTT formazan을 모두 녹인 후 96 well plate에 200 μl씩 옮겨서 ELISA reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.
- 도립 현미경을 이용한 세포 형태의 관찰
건칠, 유근피 및 신석의 단독 및 복합처리에 따른 암세포의 형태변화는 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 시각적으로 확인하였다. 이를 위하여 세포 배양용 6 well plate에 암세포를 1×10 5 개/ml 정도로 분주한 후 건칠, 유근피 및 신석을 적정농도로 희석하고 단독 및 복합처리하여 배양하였다. 48시간 경과 후 시각적인 성장억제 정도와 형태변화 정도를 200배의 배율로 관찰한 다음 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다.
- DAPI staining에 의한 세포핵의 형태 관찰
Apoptosis 특징 중 하나인 apoptotic body의 확인을 위하여 준비된 세포를 모은 다음 37% formaldehyde 용액과 PBS를 1:9의 비율로 섞은 fixing solution을 처리하여 상온에서 10분 동안 고정하였다. 고정이 끝난 후 fixing solution을 제거하고 PBS에 부유시킨 다음 cytospin (SHANDON, UK)을 이용하여 slide glass에 세포를 부탁하였다. 세포가 부착된 slide glass를 PBS로 세척하고 0.2%의 Triton X-100 (Amresco, Solon, OH, USA)을 첨가하여 상온에서 10분간 반응시킨 후 2.5 μg/ml 농도의 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma-Aldrich) 용액을 처리하여 상온에서 15분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 형광 현미경(fluorescene microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 400배의 배율로 암세포의 핵의 형태 변화를 관찰한 다음 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다.
- Annexin V-Fluorescein Isothiocyanate (FITC) staining 에 의한 apoptosis 측정
Apoptosis 유발 정도의 정량적인 분석하기 위하여 세포들을 모은 다음 2,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. PBS를 이용하여 2~3회 정도 세척하고 10 mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl and 2.5 mM CaCl 2 가 포함된 annexin V binding buffer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 부유시킨 다음 annexin V-FITC 및 propidium iodide (PI, Becton Dickinson)를 처리하여 암실에서 15분 동안 반응을 시켰다. 반응이 끝난 후 35-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리하고 FACS Calibur (Becton Dickinson)를 적용시켜 apoptosis가 유발된 세포(V + /PI )를 형광반응에 따라 측정한 다음 CellQuest software 및 ModiFit LT 프로그램을 이용하여 분석하였다.
- DNA 단편화 분석
Apoptosis 유발에 의하여 나타나는 DNA 단편화를 확인하기 위하여 준비된 세포들을 모은 다음 lysis buffer [5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-100]를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 lysis 시킨 다음 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에 0.5 mg/ml 농도의 proteinase K solution (Sigma-Aldrich)을 처리하여 50℃에서 3시간동안 반응시키고 phenol : chloroform : isoamyl alcohol 혼합용액(25:24:1, Sigma-Aldrich)을 첨가하여 회전교반 시킨 다음 원심분리를 실시하여 다시 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액에 isopropanol (Sigma-Aldrich)과 5 M NaCl를 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 원심분리하여 고형화된 DNA pellet을 추출하였다. RNA 제거를 위하여 고형화된 DNA pellet에 RNase A가 적당량 들어있는 TE buffer를 이용하여 녹인 다음 6X gel loading dye (Bioneer, Daejeon, Korea)를 첨가하고 1.6% agarose gel에 적용시켜 50 V로 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 분리된 DNA를 포함하는 agarose gel을 ethidium bromide (EtBr, Sigma-Aldrich)로 염색하고 UV 하에서 DNA 단편화 현상을 확인하였다.
- Mitochondrial membrane potential (MMP, Δψm)의 분석
암세포의 MMP 변화 정도를 측정하기 위하여 상기와 동일한 방법으로 처리된 세포들을 모은 다음 10 μM의 5,5′, 6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide(JC-1, Sigma-Aldrich) 용액을 처리하여 20분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후 원심분리하여 상층액을 제거하고 차가운 PBS를 첨가하여 세포를 부유시킨 다음 35 mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리하였다. 이렇게 준비된 세포를 FACS Calibur에 적용시켜 MMP의 변화를 측정한 다음 CellQuest software 및 ModiFit LT 프로그램을 이용하여 분석하였다.
- Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석
Lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride(PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]를 세포에 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 원심 분리하여 상층액에 있는 총 단백질을 분리하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 정량하고 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 단백질 sample을 만든 다음 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 단백질을 분자량에 따라 분리하고 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 전이시켰다. 분리된 단백질이 전이된 nitrocellulose membrane을 5% skim milk를 이용하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 1차 항체를 처리하여 4℃에서 12시간 이상 반응 시킨 다음 PBS-T로 세척하고 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체를 사용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 enhanced chemiluminoesence(ECL) slution (Amersham Life Science Corp.)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 발현양을 분석하였다.
- In vitrocaspases activity 측정
Apoptosis 유발에 있어서 중요한 작용을 하는 것으로 알려진 caspases의 활성 정도를 확인하기 위하여 상기와 동일한 방법으로 단백질을 추출하고 정량한 다음 150 μg의 단백질이 함유된 50 μl의 sample에 기질 100 μM이 함유된 reaction buffer [40 mM HEPES (pH 7.4), 20% glycerol (v/v), 1 mM EDTA, 0.2% NP-40 and 10 mM DL-DTT] 50 μl를 혼합하여 각 sample 당 총 volume이 100 μl가 되게 하였다. 여기에 caspases 종류에 따른 기질(caspase-3 : Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA), caspase-8 : Ile-Glu-Thr-Asp (IETD)-pNA, caspase-9 : Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA)을 각각 5 μl 씩 첨가하여 37℃, 암실에서 3시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.
- 통계분석
상기의 모든 실험 결과는 SPSS ver. 18.0 통계 프로그램을 이용하여 평균(mean) ± 표준편차(SD)로 나타냈다. 각 실험군의 분석 항목별 통계의 유의성 검증은 분산분석(Analysis of Vatiance, ANOVA)을 한 후, Student t-test와 Duncan's multiple range test를 이용하여 p <0.05 수준에서 검증하였다.
결 과
- 정상 및 암세포의 증식에 건칠, 유근피 및 신석의 영향
정상 및 암세포를 대상으로 건칠, 유근피 및 신석 처리에 따른 증식억제 현상을 조사하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 먼저 위암세포(AGS)를 대상으로 확인한 결과 Fig. 1 에 나타낸 바와 같이 건칠 및 유근피를 24시간 동안 처리하였을 경우에는 최고농도인 40 μg/ml 농도까지 큰 변화가 나타나지 않았지만 신석 처리군에서는 신석 처리 농도의존적 증식억제 현상이 나타나 최고농도인 1 μg/ml 처리군에서 약 66%의 증식억제 효과가 있었다. 또한 3가지 약물을 복합 처리하였을 경우에는 신석 단독 처리군보다 증식억제 효과가 현저하게 증가되는 것으로 나타났다. 특히 이러한 증식억제 상승효과는 24 μg/ml의 건칠 및 유근피와 0.6 μg/ml의 신석 복합처리군에서 최고 높게 나타났다.
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Effects of geonchil (GC), ugeunpi (UGP) and shinsok (SS) extracts, and co-treatment with GC, UGP and SS on the cell viability in human gastric cancer AGS cells. Cells were seeded at 2×105 cells/ml in a 6-well plate and treated with variable concentrations of GC, UGP and SS alone, and co-treatment of GC, UGP and SS for 24 hr. The growth inhibition was measured by the metabolic-dye-based MTT assay. The data shown are means ± SD of three independent experiments. The statistical significance of the results was analyzed by Student’s t-test (*, p<0.05 vs. untreated control).
다음은 이러한 항암활성 효능이 다른 암세포에서도 유사하게 나타나는지, 그리고 정상세포에서도 독성 효능이 있는지의 여부를 조사하였다. Fig. 2 에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 대식세포 및 C2C12 근아세포에서는 3가지 약물 단독 및 복합 처리군에서 증식억제 및 상승효과가 관찰되지 않았다. 그리고 A549 폐암세포에서도 유의적인 증식억제 효과가 없었으며, HCT116 대장암세포, Hep3B 간암세포 및 T24 방광암세포에서 약간의 증식억제 및 상승효과가 나타났지만 AGS 위암세포에 비해서는 감수성이 현저하게 낮게 나타났다. 즉, 본 실험 조건에서 3가지 약물의 단독 및 복합 처리군에서의 항암활성이 AGS 위암세포 특이적인 현상임을 알 수 있었고, 이후의 AGS 세포를 이용한 실험에서는 24 μg/ml의 건칠 및 유근피와 0.6 μg/ml의 신석 단독 및 복합 처리군에서 유발되는 항암효능에 대해서 조사하였다.
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Effects of GC, UGP and SS extracts, and co-treatment with GC, UGP and SS on the cell viability in various mouse normal and cancer cell lines. The mouse normal cell lines (RAW 264.7 macrophages and C2C12 myoblasts) and human cancer cell lines (A549, HCT116, Hep3B, T24 and AGS cells) after treatment with GC, UGP and SS alone, and co-treatment of GC, UGP and SS for 24 hr. The growth inhibition was measured by the metabolic-dye-based MTT assay. The data shown are means ± SD of three independent experiments. The statistical significance of the results was analyzed by Student’s t-test (*, p<0.05 vs. untreated control).
- 암세포의 형태에 미치는 건칠, 유근피 및 신석의 영향
건칠, 유근피 및 신석의 단독 및 복합처리에 의한 AGS 세포의 형태변화를 관찰한 결과, Fig. 3 에 나타낸 바와 같이 건칠 및 유근피 단독 처리군에서는 큰 형태적 변화를 관찰할 수 없었지만 신석 단독 처리군에서는 다양한 형태적인 변형이 관찰되었으며, 3가지 약물 복합 처리군의 경우에는 이러한 형태적 변형 더욱 강하게 유발되었다. 특히 암세포의 밀도 감소와 더불어 길고 분지를 형성하는 듯한 dendrite-like한 구조의 형성 및 부착력을 상실하고 배지 위로 부유되는 경향성이 현저하게 증가하였다. 이상의 형태적 변형 결과는 건칠, 유근피 및 신석의 단독 및 복합처리에 따른 증식억제 정도와 잘 일치함을 알 수 있었다.
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Morphological changes of human gastric cancer AGS cells by treatment with GC, UGP and SS, and co-treatment with GC, UGP and SS. Cells were seeded at 2×105 /ml in a 6-well plate and treated with the indicated concentrations of GC, UGP and SS alone, and co-treatment of GC, UGP and SS for 24 hr. Cell morphology was visualized by inverted microscope. Magnification, X200.
- 핵의 형태변화에 미치는 건칠, 유근피 및 신석의 영향
건칠, 유근피 및 신석의 단독 및 복합처리에 따른 증식억제 및 세포의 형태변화가 핵의 형태에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 DAPI 염색을 실시하여 형광현미경하에서 관찰하였다. Fig. 4A 의 결과와 같이, 건칠 및 유근피 단독 처리군에서는 전체적인 핵의 밀도 감소나 형태의 변화가 관찰되지 않았다. 그러나 신석 단독 처리군에서는 전체적인 핵의 밀도 감소와 더불어 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 염색질 응축에 의한 apoptotic body가 관찰되었으며, 이러한 현상은 건칠, 유근피 및 신석 복합 처리군에서 더욱 증가되었다. 이는 신석 단독 처리와 3가지 약물 UHS 복합처리에 의하여 AGS 위암세포에서 apoptosis가 유발되었으며, 특히 복합 처리군에서 신석 단독처리 보다 apoptosis를 더욱 강하게 유발하였다는 결과이다.
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Effects of GC, UGP and SS extracts, and co-treatment with GC, UGP and SS on the induction of apoptosis in AGS cells. Cells were seeded at 2×105 /ml in a 6-well plate and treated with the indicated concentrations of GC, UGP and SS alone, and co-treatment of GC, UGP and SS for 24 hr. (A) To investigate the morphological changes of nuclei and apoptotic body formation, cells were stained with DAPI solution. Stained nuclei were then observed under fluorescent microscope using a blue filter. Magnification, X400. (B) The cells were collected and DNA was extracted. The DNA fragmentations were separated on 1.6% agarose gel electrophoresis and visualized under UV light after staining with EtBr. (C) Cells were stained with FITC-conjugated Annexin V and PI for DNA flow cytometry analysis. Apoptotic cells are determined by counting the % of annexin V+ /PI cells and the percent of annexin V+ /PI cells. Results shown are expressed as the mean of three independent experiments. The statistical significance of the results was analyzed by Student’s t-test (*, p<0.05 vs. untreated control).
- Apoptosis 유발에 미치는 건칠, 유근피 및 신석의 영향
이상의 결과에 기초하여 apoptosis 유발에 대한 직접적인 증거를 제시하기 위하여 두 가지 추가적인 실험을 실시하였다. 즉, apoptosis 유발의 또 다른 직접적인 증거인 DNA 단편화 현상을 관찰한 결과 Fig. 4B 에 나타낸 바와 같이 건칠 및 유근피 처리군에서는 DNA 단편화 현상이 나타나지 않았지만 신석 처리군에서는 약한 DNA 단편화 현상이 관찰되었으며, 복합 처리군에서는 DNA 단편화 현상이 강하게 관찰되었다. 다음은 apoptosis 현상의 정량적인 비교를 위하여 동일한 조건에서 배양된 AGS 세포를 대상으로 annexin V-FITC 및 PI를 처리하여 염색한 후 DNA flow cytometry 분석을 실시한 결과, 대조군에서의 자연적 apoptosis 유발 빈도는 약 4.14%로 나타났으며, 건칠 및 유근피 처리군에서는 각각 5.6% 및 5.36%로 나타나 정상배지에서 자란 암세포와 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 신석 처리군의 경우에는 약 15.54%의 세포에서 apoptosis가 유발된 것으로 나타났으며, 복합 처리군에서는 apoptosis가 유발된 세포의 빈도가 급격하게 증가하여 약 27.5%로 나타났다.
- MMP (Δψm)에 미치는 건칠, 유근피 및 신석의 영향
신석 단독 및 3가지 약물 복합 처리에 따른 apoptosis 유발에 미토콘드리아 손상 경로가 관여하는 지를 확인하기 위하여 MMP (Δ ψm )의 변화를 조사한 결과는 Fig. 5 에 나타난 바와 같다. 먼저 정상 배지에서 자란 AGS 위암세포의 경우에는 정상적인 MMP를 보이는 세포가 약 93.98%였으며, 건칠 및 유근피 처리군에서도 약 92.92% 및 93.16%로 나타나 미토콘드리아의 손상이 거의 유발되지 않았음을 알 수 있었다. 그러나 신석 처리군에서는 MMP 손실 정도가 약 39.06%로 증가하였으며, 복합 처리군에서는 약 71.2% 정도의 세포에서 MMP 손실이 유발된 것으로 나타났다. 이는 신석 단독처리와 복합 처리에 의한 AGS 세포의 apoptosis 유발은 MMP 교란을 통한 미토콘드리아 기능 손상이 관여하고 있음을 보여주는 것이다.
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Effects of GC, UGP and SS extracts, and co-treatment with GC, UGP and SS on the MMP (Δψm) values in AGS cells. Cells were treated with the indicated concentrations of GC, UGP and SS alone, and co-treatment of GC, UGP and SS for 24 hr. Then cells were incubated with JC-1 dye (10 μM) for 30 min in the dark and the loss of MMP was measured by flow cytometry. The data shown are means ± SD of three independent experiments. The statistical significance of the results was analyzed by Student’s t-test (*, p<0.05 vs. untreated control).
- Apoptosis 조절 단백질의 발현에 미치는 건칠, 유근피 및 신석의 영향
다음은 AGS 세포에서 건칠, 유근피 및 신석의 단독 및 복합 처리가 apoptosis 조절 관련 단백질들의 발현에 미치는 영향을 Western blot analysis 방법으로 조사하였다. 먼저 apoptosis 유발의 extrinsic pathway에 관여하는 단백질 중, Fas 및 Fas ligand (FasL)의 발현이 신석 및 복합 처리군에서 증가되었으며, intrinsic pathway와 연관성이 있는 Bcl-2 family member 중 anti-apoptotic protein인 Bcl-X L 의 발현이 복합 처리군에서 다소 감소되었다. 또한 extrinsic pathway 에 관여하는 활성화된 caspase-8에 의하여 단편화 현상이 유발됨으로서 미토콘드리아의 기능 이상을 유발하는 pro-apoptotic 유전자인 Bid의 경우, 복합 처리군에서 단편화된 형태의 tBid는 나타나지 않았지만 total Bid의 발현이 매우 감소되었다. 또한 caspases의 활성을 억제함으로서 apoptosis를 억제하는 유전자로 알려진 IAP family 중 XIAP, cIAP-1 및 survivin의 발현 감소가 복합 처리군에서 관찰되었다.
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Effects of GC, UGP and SS extracts, and co-treatment with GC, UGP and SS on the expression levels of apoptosis-related proteins in AGS cells. Cells were treated with the indicated concentrations of GC, UGP and SS alone, and co-treatment of GC, UGP and SS for 24 hr. The cells were lysed and then equal amounts of cell lysates were separated on SDS-polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose membranes. The membranes were probed with the indicated antibodies and the proteins were visualized using an ECL detection system. Actin was used as an internal control.
- Caspases 활성 및 기질단백질의 발현에 미치는 건칠, 유근피 및 신석의 영향
여러 종류의 caspases 중 apoptosis 유발에 중요한 조절인자로 알려진 caspase-3, -8 및 -9의 발현 및 활성에 미치는 건칠, 유근피 및 신석의 단독 및 복합 처리의 영향을 조사하였다. 먼저 Fig. 7A 에 나타낸 바와 같이 신석 단독처리와 3가지 약물복합처리에 의해서 불활성형 단백질의 발현감소와 더불어 활성형 단백질의 발현증가가 관찰되었다. 또한 활성화된 caspase-3에 의하여 단현화가 일어나는apoptosis 표적 단백질인 PARP의 경우, 신석 처리군에서 단편화 현상이 관찰되었으며, 복합 처리군에의 단편화 현상이 더 강하게 나타났다. 따라서 in vitro caspase activity assay를 통하여 이들 caspases의 활성정도를 정량적으로 분석한 결과, caspase-3, -8 및 -9의 활성증가 정도가 신석 단독처리군 보다는 복합 처리군에서 더욱 높게 나타났으나, 건칠 및 유근피의 경우는 유의적인 변화가 없었다( Fig. 7B ).
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Effects of GC, UGP and SS extracts, and co-treatment with GC, UGP and SS on the activation of caspases and the degradation of PARP protein in AGS cells for 24 hr. (A) The cells were lysed and then equal amounts of cell lysates were separated by SDS-polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose membranes. The membranes were probed with the indicated antibodies and the proteins were visualized using an ECL detection system. Actin was used as an internal control. (B) Aliquots (150 μg protein) were incubated with substrates, DEVD-pNA, IETD-pNA and LEHD-pNA, for in vitro caspase-3, -8 and -9 activity, respectively, at 37℃ for 3 hr. The released fluorescent products were measured. Results shown are expressed as the mean of three independent experiments. The statistical significance of the results was analyzed by Student’s t-test (*, p<0.05 vs. untreated control).
- 건칠, 유근피 및 신석 복합처리의 caspases 의존적 apoptosis 유발
다음은 상기 결과에서 관찰된 복합 처리군의 apoptosis 유발이 caspase 의존적인 현상인지를 여부를 조사하였다. 먼저 Fig. 8A 에 나타낸 바와 같이, 건칠, 유근피 및 신석 복합 처리군에서 관찰된 apoptotic body의 증가가 pan-caspases inhibitor인 z-VAD-fmk 선처리에 의하여 매우 감소되었다. 또한 이와 유사하게, 복합 처리에 의한 DNA 단편화 현상이 z-VAD-fmk 선처리에 의하여 거의 완벽하게 차단되었으며( Fig. 8B ), 세포의 생존율 회복과 연관성이 있었다( Fig. 8C ). 이는 복합 처리에 의한 AGS 위암세포의 apoptosis 유발은 caspase 의존적인 현상임을 의미하는 결과이다.
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Effects of pan caspases inhibitor, z-VAD-fmk, on the induction of apoptosis by the treatment of co-treatment of GC, UGP and SS in AGS cells. Cells were pretreated with z-VAD-fmk for 1 hr, and then treated with co-treatment GC, UGP and SS for 24 hr. (A) The cells were stained with DAPI for 10 min and photographed with a fluorescence microscope using a blue filter. Magnification, ×400. (B) DNA fragmentation was analyzed by extracting the fragmented DNA and separating it by electrophoresis in a 1.6% agarose gel containing EtBr. (C) The growth inhibition was measured by the metabolic-dye-based MTT assay. The data shown are means ± SD of three independent experiments. The statistical significance of the results was analyzed by Student’s t-test (*, p<0.05 vs. untreated control).
고 찰
본 연구에 사용된 건칠(乾漆)은 옻나무( Rhus verniciflua Stokes)의 줄기에 상처를 입혀 흘러나온 수액이 자연 건조된 덩어리로서 한의학에서 가장 오래된 본초학 서적으로 알려진 신농본초경(神農本草經)의 기록에서부터 동의보감(東醫寶鑑) 및 현재에 이르기까지 꾸준히 활용되고 있는 약재로서 주로 어혈(瘀血)을 풀어주고, 위장관의 적취(積聚)를 해소시키는 작용이 있어 어혈, 적취, 징가(癥瘕) 및 냉심통(冷心痛) 등에 활용되어 왔다 [16] . 최근 건칠 추출물 또는 주요 생리활성 물질이 항혈전작용 [22] 및 항산화작용 [24] 등이 있음이 보고되었으며, 암세포의 세포주기 교란 및 apoptosis 유도와 같은 항암 활성이 있음이 확인된 바 있다 [19 , 21] . 유근피(楡根皮, Ulmus davidiana var. japonica Nakai)는 느릅나무과에 속한 느릅나무의 코르크층을 벗긴 수피와 근피를 건조한 것으로 전통적으로 이수통림(利水通淋), 소종해독(消腫解毒)의 효능이 있어 옹저발매(癰疽發背), 개선(疥癬) 및 풍열종독(風熱腫毒), 항생나력(項生瘰瀝) 등의 병증에 사용되어 왔다. 최근 실험적 연구에 의하면 건칠은 다양한 항암효능이 있는 것으로 밝혀졌는데 [1 , 13 , 20] , 이는 아마도 건칠 추출물들의 강력한 항산화 [17] , 항염증 [34] , 면역증강효능 [23] 및 신생혈관 억제 작용 [15] 등에 의한 것으로 추정된다. 한편, 신석(信石, Arsenium Sublimatum)은 한의학에서 이미 2000년전부터 질병치료의 목적으로 사용해 온 광물성 약재인데 비석(砒石), 신비(信砒), 인언(人言) 등의 이명을 가지고 있다. 산화물류의 광물로서 비소화합물인 비화(砒華) arsenolite이며, 그 주성분은 As 2 O 3 로서 한담효천(寒痰哮喘), 학질(瘧疾), 휴식리(休息痢), 나력(瘰癧), 치질(痔疾), 궤양부육불탈(潰瘍腐肉不脫) 등의 치료에 사용되어 왔다 [2] . 비소화합물이 암치료와 관련해서는 2000년 미국 식품의약국에서 급성 전골수구성 백혈병(acute promyelocytic leukemia) 치료제로 공식 승인을 받았으며, 구조 변형된 비소화합물의 다른 혈액암이나 일부 고형암에서도 그 효과가 보고 되고 있다 [8 , 27 , 33] .
본 연구에서는 건칠(乾漆), 유근피(楡根皮) 및 신석(信石)의 단독 및 복합처리에 의하여 유발되는 항암활성 및 그와 연관된 분자생물학적 기전을 확인하기 위하여 여러 종류의 정상 및 암세포를 대상으로 각 한약재 추출물의 세포독성을 비교한 결과 정상세포에서 단독 및 복합처리에 의하여 유의적인 세포 독성을 나타나지 않았지만, 암세포의 경우에도 위암세포에서 특이적으로 높은 세포 독성을 보였다( Fig. 1 2 ). 이러한 위암세포(AGS)에서 복합처리군에 의한 세포독성은 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있음을 형태적 변화 및 DAN 단편화 현상 등으로 확인하였고, apoptosis 유발의 정량적 확인을 flow cytometry 분석을 통하여 제시하였다( Fig. 3 4 ).
일반적으로 apoptosis 과정은 extrinsic 및 intrinsic pathway로 구분되며, 이 과정들은 death receptors, Bcl-2 family 및 caspases 등과 같은 여러 유전자들의 발현 및 활성 변화에 기인한다. Extrinsic pathway는 death receptors인 DR4, DR5 및 Fas에 death ligands인 TRAIL 및 FasL가 결합하여 death receptors가 활성화되면 initiator caspase인 caspase-8의 활성화로 시작된다. 이러한 caspase cascade에 의하여 effector caspase인 caspase-3을 활성시키거나 Bid 의 단편화(tBid)의 형성으로 미토콘드리아의 기능 이상을 유발함으로서 intrinsic pathway를 통한 apoptosis을 유발에도 관여한다 [18 , 30] . Intrinsic pathway의 경우, 다양한 자극에 의하여 미토콘드리아 외막에 존재하는 Bcl-2 family의 발현변화와 연계된 미토콘드리아의 기능 이상이 동반되어 나타난다 [31 , 36] . Anti-apoptotic member와 pro-apoptotic member로 구성되어 있는 Bcl-2 family는 서로 dimer를 결합되어 있으며, 이들 사이에 균형이 깨어지게 되면 미토콘드리아의 기능 이상을 유발함으로서 하위의 여러 유전자들의 발현 변화가 동반되어 apoptosis가 유발된다 [25 , 35] . 따라서 AGS 위암세포에서 건칠, 유근피 및 신석의 단독 및 복합처리에 의한 apoptosis 유발에 있어서 extrinsic pathway가 관여하는 지를 확인한 결과, Fas 및 FasL의 발현이 증가되었으며, intrinsic pathway에 관여하는 Bcl-2 family 유전자들의 발현변화를 확인한 결과, anti-apoptotic member인 Bcl-X L 의 발현 감소와 함께 pro-apoptotic member인 total Bid의 발현도 감소하였으며, MMP의 손실이 증가하는 것으로 나타났다( Fig. 5 6 ). 이상의 결과에서 건칠, 유근피 및 신석의 단독 및 복합처리에 의한 apoptosis 유발은 death receptor 및 apoptotic lagand의 발현 변화와 Bcl-2 family 유전자들의 발현변화에 의하여 미토콘드리아의 기능 이상이 관여한다는 것을 알 수 있었다.
IAP family는 apoptosis 유발에 직접적으로 관여하는 효소인 caspases의 ubiquitination 및 degradation을 조절하는 RING finger domain과 protein–protein interaction 기능을 하는 caspase-recruitment domain (CARD)을 가지고 있으며, caspases와 직접적으로 결합하여 caspases의 활성을 억제함으로서 apoptosis 유발을 조절하는 것으로 알려져 있다 [3 , 6] . IAP family 중 XIAP는 caspases와 높은 친화력을 가짐으로서 caspase-9 및 -3와 결합하여 apoptosis를 직접적으로 억제하는 것으로 알려져 있으며, cIAP-1, cIAP-2 및 survivin도 각각 다양한 caspases와의 결합을 통하여 apoptosis를 억제하는 것으로 알려져 있다 [4 , 26 , 32] . 따라서 AGS 세포에서 건칠, 유근피 및 신석의 단독 및 복합처리가 IAP family 인자들의 발현에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인한 결과, XIAP, cIAP-1 및 survivin의 발현이 감소하였음을 확인하였다( Fig. 6 ).
Extrinsic 및 intrinsic pathway를 통하여 유발되는 apoptosis에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 cystein-containing aspartate-specific protease family인 caspases는 initiator caspases 및 effector caspases가 존재하며, 세포가 정상적으로 성장 및 생존할 경우에는 불활성인 pro-enzyme 형태로 존재하고 있지만 세포 내외부의 다양한 자극에 의하여 initiator caspases 활성화되면 하위단계에 존재하는 effector caspases를 활성화시켜 기질단백질들을 분해함으로서 apoptosis를 유발한다 [5 , 11 , 29] . 활성화된 effector caspases에 의하여 분해가 유발되는 대표적인 기질 단백질로는 DNA stability 및 repair에 관여하는 PARP 단백질이다. 따라서 AGS 세포에서 건칠, 유근피 및 신석의 단독 및 복합처리가 caspase의 발현 및 활성에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인한 결과, initiator caspases 중 extrinsic pathway에 의하여 활성화되는 것으로 알려진 caspase-8 및 intrinsic pathway에 의하여 활성화되는 것으로 알려진 caspase-9의 활성이 증가되었으며, initiator caspases 활성화에 따른 caspase cascade에 의하여 apoptosis에 직접적으로 관여하는 effector caspase인 caspase-3의 활성도 증가되는 것으로 나타났을 뿐 만 아니라 활성화된 caspase-3에 의하여 분해가 일어나는 기질단백질인 PARP의 단편화가 유발되었다( Fig. 7 ). 또한 복합처리군에서 유발된 apoptosis는 caspase 활성 의존적인 현상임을 pan-caspases inhibitor인 z-VAD-fmk를 이용하여 확인하였다( Fig. 8 ).
이상의 결과를 종합해 보면 인체 위암세포주인 AGS 세포에서 건칠 및 유근피의 단독 처리는 유의적인 세포독성을 보이지 않았지만, 신석 단독 및 복합처리군에서는 세포증식 억제와 연관된 apoptosis가 유발되었으며, 이는 extrinsic 및 intrinsic pathway를 모두 경유하는 multiple apoptotic pathway에 의한 caspases의 활성화가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 또한 신석 단독처리군과 비교하여 복합처리군에서 apoptosis 유발 정도가 더욱 강하게 나타났으므로 신석에 의하여 유발되는 apoptosis에 있어서 건칠과 유근피가 상승효과를 유발한 것으로 생각된다.
Acknowledgements
이 논문은 2015년도 정부(미래창조과학부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임(No. 2015R1A2A2A01004633).
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