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The Anti-inflammatory Effects of Probiotic-produced Exopolysaccharide
The Anti-inflammatory Effects of Probiotic-produced Exopolysaccharide
Journal of Life Science. 2015. Jun, 25(6): 709-714
Copyright © 2015, Korean Society of Life Science
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  • Received : March 16, 2015
  • Accepted : June 15, 2015
  • Published : June 30, 2015
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승훈 이
민정 권
형택 강
정욱 정
병오 김
종식 김
jsk@anu.ac.kr

Abstract
본 연구에서는 다양한 식품원으로부터 7종류의 프로바이오틱스를 분리하여 16S rDNA 염기서열 분석을 통해 동정하였으며, 그 결과 Bacillus sp.와 Lactobacillus sp.로 확인되었다. 먼저 LPS로 활성화 된 RAW 264.7 세포주에 7종의 균주 배양액을 처리한 후, nitric oxide (NO) 생성을 측정하였다. 처리한 균주의 배양액 중 Bacillus sp. FG-1과 Lactobacillus sp. FG-6 균주의 배양액 처리군에서 현저하게 NO 생성이 저해되었다. 또한, 이들의 처리에 의해 COX-2 , iNOS 그리고 TNF-α 와 같은 pro-inflammatory 유전자의 발현이 감소되었다. 균주가 생산하는 여러 물질중 exopolysaccharide (EPS)가 항염증 활성과 관련이 있는지를 검증하기 위하여 두 균주로부터 EPS를 분리하여, 이들이 NO 생성에 미치는 영향을 연구하였다. 그 결과, 두 균주가 생산하는 EPS가 NO 생성을 농도의존적으로 저해하였고, pro-inflammatory 유전자의 발현도 현저하게 감소시켰다. 이러한 연구결과는 EPS가 프로바이오틱스가 생산하는 여러 물질 중 항염증 활성의 핵심물질 중의 하나가 될 수 있음을 시사한다.
Keywords
서 론
인간의 소화기관에는 약 100여종의 장내세균이 존재하며 일부 미생물은 장내에 유입되는 유해균의 생장을 억제하고 [12] 가수분해 효소 분비를 통해 음식물을 분해하는 등의 정장 효과가 있음이 알려져 있다. 하지만 숙주의 식습관과 환경조건에 따라 장내 미생물 분포의 균형이 붕괴되면 유해균의 침입 및 번식, 그에 따른 세균성 질환과 소화불량 등 생체에 다양한 악영향을 끼치게 된다 [18 , 19] . 이러한 균형 붕괴를 예방하기 위해 간편하게 건강유지에 도움이 될 수 있는 미생물제제로서 프로바이오틱스의 개념이 등장하게 되었다.
프로바이오틱스란 2001년 WHO에서 “살아있는 미생물로서 적정량을 섭취하였을 때, 숙주에게 유익한 영향을 미치는 것”으로 정의한 이래 현재까지 사용되고 있다. 프로바이오틱스의 활성에 대한 연구에 의하면 항균활성 [11] , 항암효과 [5] , 숙주의 영양흡수 증진 [2] , 면역력 강화 [1] , 활성산소 소거 [14] 등 다양한 생리 활성을 가지고 있는 것으로 보고 되었다. 또한, 프로바이오틱스를 구성하는 다양한 성분에 의한 생리활성 연구가 진행되고 있으며, 대표적으로 유산균의 세포벽을 구성하는 polysaccharide moiety 및 muramic acid와 배양산물이 항암 효과를 가진다는 사실이 in vivo 모델을 통해 보고 되기도 하였다 [13 , 22] .
미생물을 구성하는 3종류의 다당체는 세포 내 다당체(intra-cellular polysaccharide), 구조다당체(structural polysaccharide) 그리고 세포 외 다당체(extracellular polysaccharide)이다. 이중 세포 외 다당체(extracellular polysaccharide)는 미생물의 대사산물로서 [10] slime, capsular, microcapsular등 3가지의 형태로 분류되며 exopolysaccharide (EPS) 라고도 한다 [20] . EPS는 인과 무기염류 등이 다당체와 결합한 형태를 가지며 [4] , 다양한 환경 스트레스로부터 미생물을 보호하는 것이 가장 주된 기능으로 알려져 있다 [8] . 또한, 최근 연구에 의하면 EPS가 염증반응의 한 경로인 MAPK pathway에 관여하여 iNOS , COX-2 등 pro-inflammatory 유전자의 발현을 감소시키는 것으로 보고되었다 [4] .
대식세포와 같은 면역세포에서lipopolysaccharide (LPS)의 자극에 의해 발현되는 iNOS 는 nitric oxide (NO)를 합성하며, 이러한 NO는 혈관계, 골격계 그리고 신경계 등에서 다양한 신호전달 및 방어물질로 알려져 있어 염증반응 정도를 측정하는 중요한 척도로 이용되고 있다 [3 , 6 , 15] .
본 연구에서는 다양한 식품원으로부터 프로바이오틱스를 분리 및 동정하고, 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포주에서 프로바이오틱스 배양액에 의한 항염증 활성을 확인하였다. 또한, 유용세균 배양액으로부터 EPS를 분리 및 정제하여 이들의 항염증 활성 및 활성 기전을 연구하였다.
재료 및 방법
- 유용세균의 분리 및 동정
각 미생물은 막걸리, 김치 및 시중에 유통되고 있는 유산균 음료를 Bromo Cresol Purple 배지(Difco, USA)에 배양하여 특징적인 변색을 나타내는 7종을 선별하였다. 선별된 균주는 Lactobacilli MRS (Difco, USA) 배지에서 순수 배양한 후 MRS 액체 배지에서 48시간 동안 현탁 배양 하였다. 배양된 균주로부터 G-spin kit (iNtRON, Korea)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였으며, 8F (F: 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'), 1492R (R: 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') universal primer를 사용하여 16S rDNA 부분을 polymerase chain reaction을 통하여 증폭하였다. PCR product는 pGEM T-easy vector로 cloning 한 후 16S rDNA염기서열을 분석하였다. 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST program을 이용하여 세균을 동정하였다.
- RAW 264.7 세포의 배양
본 연구에 사용된 세포주는 마우스 대식세포 RAW 264.7 세포주를 사용하였고 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 구입하였다. 세포주의 배양은 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA)에 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco, USA), 1% penicillin 및 streptomycin (WelGene, Korea)을 첨가하여 사용하였다. 배양은 37℃, 5% CO 2 조건의 배양기에서 실시하였다.
- Nitric oxide assay
균주 배양액 및 exopolysaccharide (EPS)가 lipopolysaccharide(LPS)로 활성화된 대식세포 RAW 264.7 세포주의 nitric oxide (NO) 생성에 미치는 영향을 측정하기 위하여 NO assay를 수행하였다. 즉, RAW 264.7 세포를 96 well plate의 각 well에 1×10 5 개의 세포를 접종한 후, 18시간 동안 배양하였다. 그 후 LPS (Sigma, USA)를 0.2 μg/ml 농도로 한 시간 처리하고, 균주 배양액 혹은 EPS를 처리하여 16시간 동안 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약[1% sulfanilamide, 0.1% naphylethylenendiamine in 2.5% phosphoric acid]을 이용해 측정하였다. 세포 배양 상등액 100 μl와 Griess 시약 100 μl를 1:1로 혼합하여 96 well plate에서 15분간 반응시키고 Nano-Quant Plate™ (Tecan Trading AG, Switzerland)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과 수치는 4개의 독 립적인 well에서 수행한 값을 Microsoft EXCEL program을 이용하여 분석한 후 mean±SD 값과 그래프로 나타내었다.
- 세포 생존율 측정
EPS가 마우스 대식세포 RAW 264.7 세포주의 성장에 미치는 영향을 연구하기 위해 cell viability assay를 수행하였다. 먼저 96 well plate에 1×10 5 개의 RAW 264.7 세포를 접종한 후, 18시간 동안 배양하였다. 그 후 EPS를 처리한 후 16시간 배양하여 MTS (3-(4,5-dimethylthi-azol-2-yl)5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)용액 (Promega, USA)을 각 well 당 20 μl씩 첨가하여 37℃, 5% CO 2 배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 Nano-Queant Plate™ (Tecan Trading AG, Switzerland)를 사용하여 580 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과 수치는 4개의 독립적인 well에서 수행한 값을 Microsoft EXCEL program을 이용하여 분석한 후 mean±SD 값과 그래프로 나타내었다.
- Reverse transcription-PCR
RT-PCR을 수행하기 위해 RAW 264.7 세포로부터 RNeasy mini kit (Qiagen, USA)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하여 Total RNA를 분리하였다. 분리한 total RNA 2 μ g을 주형으로 PrimeScript™ RT-PCR Kit (TaKaRa, Japan)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 유전자 특이적인 oligo primer를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction) 과정을 수행하였다. PCR에 사용된 primer는 Table 2 와 같고, primer는 Bioneer사 (Korea)에 주문 제작하였다. PCR은 TaKaRa Ex Taq (TaKaRa, Japan)을 이용하여 수행하였다.
Sequences of oligonucleotide primers used for RT-PCR
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Sequences of oligonucleotide primers used for RT-PCR
- 균주 배양액의 분리 및 배양액으로부터 EPS의 분리
각 균주의 배양액은 동일한 조건을 설정하기 위해 OD 660 값을 0.6±2.5% 범위에서 배양 한 후 2,000 rpm에서 20분간 원심분리 후 0.2 μm micro filter (Sartorius Biotech, Germany)로 여과하였다. 배양액으로부터 EPS의 분리는 선별된 균주가 EPS를 충분히 생산하도록 MRS 액체 배지에 1% Lactose와 1% Sucrose를 추가 첨가하였으며, OD 660 값 0.6으로 조정된 유산균 배양액을 1% 첨가하여 48시간 배양하였다. 배양액은 2배 volume의 D.W를 이용해 3배 희석하고 NaOH를 투여하여 volume 대비 0.1 N 농도로 조정한 뒤 High Speed Tube (NalGene, USA)에 나누어 담아 12,000× g, 4℃에서 30분간 원심분리하여 균체를 분리하였다. 분리한 배양액을 수거하여 배양액 2배 volume의 95% ethanol을 첨가 한 후 24시간 동안 EPS를 결정화하였다. EPS가 충분히 결정화 된 후 3,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 70% ethanol을 이용해 세척하였다. 70% ethanol 용액에 0.1N 농도의 HCl을 이용하여 pH 7.0으로 보정하고 다시 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액을 제거하고 5 ml의 70% ethanol 첨가하여 2차 세척 후 탈수 및 건조하여 최종적으로 EPS를 분리 하였다.
- 통계처리
NO assay와 세포생존율 실험은 3회 반복실험을 실시 하였으며, 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 각 실험결과의 유의성 검토는 시료가 포함되지 않은 대조구와 비교하여 Student’s t -test에 의해 판정하였으며 p값이 0.05 미만일 때 유의성이 있다고 판단하였다.
결과 및 고찰
- 다양한 식품원으로부터 프로바이오틱스의 분리 및 동정
프로바이오틱스는 막걸리 4종, 유산균 음료 2종, 김치 1종으로부터 Bromo Cresol Purple 및 MRS 배지를 이용하여 최종적으로 7종의 균주를 분리하였다. 순수 분리된 균주는 16S rDNA sequencing을 통해 얻은 염기서열을 NCBI BLAST DB에서 검색한 결과 96±1%의 상동성을 보이는 Lactobacillus sp. 4종과 Bacillus sp. 3종으로 동정되었다. Table 1 에서 보는 바와 같이 식품원과 동정된 균주명을 나타내었고, 임의적으로 7균주에 대해 strain명을 FG1 ~FG7로 명명하였다.
List of probiotics isolated from various food sources
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- 균주 배양액이 RAW 264.7세포주에서 nitric oxide (NO) 생성에 미치는 영향
NO는 패혈증 및 감염성 질환에서 중요한 매개 인자로서 [16] , LPS에 의한 염증 유도 시 억제능을 나타내는 균주를 선별하는데 있어 중요한 지표물질로 이용될 수 있다. 따라서, 순수 분리한 균주 배양액의 항염증 활성을 측정하기 위하여 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포주에 각 유산균 배양액을 100 μl/ml의 농도로 처린 한 후, NO 생성에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, Fig. 1 에서 보는 바와 같이 7종류의 균주 중 Bacillus sp. strain FG-1 배양 상층액과 Lactobacillus sp. strain FG-6의 배양 상층액에 의한 NO 생성량 감소가 가장 두드러지게 나타났으며, NO 생성 억제율은 LPS 만 처리한 대조군과 비교하여 FG-1과 FG-6처리군에서 각각 34.2%와 38.9%로 가장 높은 억제율을 보여주었다( Fig. 1 ). 최근 Kawahara et al .의 보고 [10] 에 의하면 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서 3종류의 다른 유산균의 배양액의 처리에 의해 NO 생성이 억제되었다. 이러한 연구결과는 균주는 다르지만 유산균 배양액에 의해 NO 생성이 저해된다는 점에서 본 연구결과와 유사하다고 판단된다.
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Effects of culture supernatants of identified microbes on nitric oxide (NO) production and cell viabilities in mouse RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were plated at 1×105 cells/well in a 96-well plate and incubated with 100 μl/ml of culture supernatants of seven microbes for 16 hr. After treatment, NO production was measured by NO assay. Values indicate means±SD (n=4). ***p<0.001.
- 균주 배양액에 의한 pro-inflammatory 유전자의 발현 감소
선별된 7종의 균주 가운데 NO 생성을 가장 높게 억제하는 균주 2종( Bacillus sp. strain FG-1, Lactobacillus sp. strain FG-6) 의 배양 상층액을 100 μl/ml의 농도로 LPS로 활성화된 RAW 264.7세포주에 처리 한 후, pro-inflammatory 유전자인 COX-2 , iNOS 그리고 TNF-alpha 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, LPS에 의해 염증이 유도된 대조군의 경우 pro-inflammatory 유전자들의 발현이 크게 증가한 반면 균주 배양액을 함께 처리한 실험군에서는 pro-inflammatory 유전자의 발현이 현저하게 감소됨을 확인하였다( Fig. 2 ). Pro-inflammatory 유전자인 COX-2 , iNOS 그리고 TNF-alpha 등은 MAPK pathway 및 NF-kappa B에 의해 조절되며 NO 및 PGE2 생성 등을 포함하는 염증반응을 매개하는 것으로 알려져 있다 [7 , 21] . 따라서, 이러한 결과는 프로바이오틱스 배양 상층액에 포함된 생리활성물질이 NO 생성을 억제하고 염증 반응의 신호전달 체계에 관여하고 있음을 시사한다.
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Down-regulation of COX-2, iNOS and TNF-± genes by culture supernatants of FG-1 and FG-6 strains. Mouse macrophage RAW 264.7 cells were treated with 100 μl/ml of culture supernatants of FG-1 and FG-6 strains and then total RNA was prepared from treated cells. RT-PCR was performed with COX-2, iNOS and TNF-± genes specific primers.
- 균주 배양액으로부터 exopolysaccharide (EPS) 분리 및 EPS에 의한 항염증 활성
선별된 2종의 균주인 Bacillus sp. strain FG-1과 Lactobacillus sp. strain FG-6 배양 상층액 100 ml로부터 재료 및 방법에 명시한 방법에 따라 EPS를 분리하였다. 분리한 EPS를 광학현미경 하에서 100배, 400배 배율로 관찰한 결과 Bacillus sp. strain FG-1 균주의 EPS의 경우 비교적 성분이 heterogenous한 형태로 구성되어 있었으며, Lactobacillus sp. strain FG-6 균주의 EPS 는 비교적 homogenous 한 물질로 구성된 것으로 판단되었다( Fig. 3 ). LPS를 처리한 RAW 264.7 세포주에 EPS를 0.75, 1.0, 1.25, 1.5 mg/ml의 농도로 처리한 후, NO 생성 저해율 및 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, 두 균주가 생산하는 EPS가 세포생존율에는 큰 영향 없이 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하였다( Fig. 4 ). Fig. 4A 에서 보는 바와 같이, 두 균주가 생산한 EPS의 처리 농도가 증가할 수록 NO 생성 억제 효과가 증가함을 확인하였다. 또한 두 균주가 생산하는 EPS는 세포 생존율에 큰 영향을 미치지 않았으며( Fig. 4B ), 이러한 연구결과는 균주가 생산하는 EPS 및 EPS와 결합된 형태의 생리활성물질이 항염증 활성을 나타내는 것임을 알 수 있다. 최근 연구에 의하면 Bacillus sp. 가 분비하는 EPS 성분이 RAW 264.7과 같은 대식세포의 염증반응 초기 신호전달 단계에 관여하여 과도한 염증 반응을 억제한다는 연구결과가 보고되었다 [4] . 이는 비록 균주는 다르지만 EPS가 항염증 활성의 유효성분이 될 수 있다는 것을 시사한다.
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Preparation of exopolysaccharide (EPS) from culture supernatant of probiotics. EPS was isolated and purified from culture supernatant of strain FG-1 and FG-6 by ethanol precipitation and pictured under optical microscope.
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Effects of EPS isolated from FG-1 and FG-6 strains on NO production and cell viabilities in mouse RAW264.7 cells. RAW 264.7 cells were plated at 1×105 cells/well in a 96-well plate and incubated with 0.75, 1.0, 1.25 and 1.5 mg/ml of EPS from FG-1 and FG-6 strains for 16 hr. After treatment, (A) NO production was measured by NO assay and (B) cell viability was measured using MTS proliferation assay kit. Values indicate means±SD (n=4). **p<0.01 and ***p<0.001.
- EPS에 의한 pro-inflammatory 유전자의 발현 감소
EPS에 의한 항염증 활성을 유전자 발현 수준에서 확인하기 위해 선별된 EPS 2종을 1 mg/ml의 농도로 처리한 후, pro-inflammatory 유전자인 COX-2 , iNOS 그리고 TNF-alpha 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, 두 가지 EPS 처리군 모두 유의적인 pro-inflammatory 유전자의 발현 감소를 확인하였으며, 특히 Lactobacillus sp. strain FG-6 균주가 생성한 EPS를 처리한 경우 pro-inflammatory 유전자의 발현이 전반적으로 크게 감소되는 것을 확인 할 수 있었다( Fig. 5 ). 반면, Bacillus sp. strain FG-1 균주가 생산한 EPS를 처리한 경우 COX-2를 제외한 iNOS , TNF-α 유전자의 발현이 감소됨을 확인 할 수 있다. 이러한 연구결과는 두 균주가 생산하는 EPS는 다른 종류이며, 항염증 활성 기전도 조금 다를 것으로 생각된다. 또한, 이러한 결과는 균주가 생성하는 EPS 종류에 따라 다른 경로에 의해 면역 조절 기능에 관여할 수 있음을 보고 [17] 한 것과 유사한 것으로 판단된다.
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Down-regulation of COX-2, iNOS and TNF-± genes by EPS. Mouse macrophage RAW 264.7 cells were treated with 1 mg/ml of EPS and total RNA was prepared from EPS treated cells. And then, RT-PCR was performed with COX-2, iNOS and TNF-± gene specific primers.
본 연구에서는 다양한 식품원으로부터 7종의 프로바이오틱스를 분리 및 동정하고 이들의 배양액 및 균주가 생산하는 EPS가 항염증 활성을 가지고 있음을 보여주었다. 프로바이오틱스는 균주마다 다양한 종류의 EPS를 생산하고, 이들의 구성이나 구조에 따라 다양한 생리활성을 보여준다. 따라서, 본 연구에서 분리한 EPS의 구성성분과 구조를 규명하는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
Acknowledgements
이 논문은 2012학년도 안동대학교 산학연구비에 의하여 연구되었으며, 이에 감사드립니다.
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