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Therapeutic Effect of Hydrocolloid Membrane Containing Liriope platyphylla Extracts on the Burn Wounds of SD Rats
Therapeutic Effect of Hydrocolloid Membrane Containing Liriope platyphylla Extracts on the Burn Wounds of SD Rats
Journal of Life Science. 2015. May, 25(5): 523-532
Copyright © 2015, Korean Society of Life Science
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
  • Received : February 24, 2015
  • Accepted : April 27, 2015
  • Published : May 30, 2015
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은혜 이
준 고
지은 김
은경 고
성화 송
지은 성
찬규 박
현아 이
대연 황

Abstract
맥문동( Liriope platyphylla )은 염증(inflammation), 당뇨(diabetes), 신경퇴행성질환(neurodegenerative disorder), 비만(obesity), 변비(constipation), 아토피질환(atopic dermatitis) 등의 다양한 임상질환에 매우 우수한 치료효과를 나타내는 것으로 알려져왔다. 또한, 하이드로콜로이드막(hydrocolloid membranes, HCM)은 피부경화증 피부궤양(scleroderma skin ulcers), 피부궤양(cutaneous ulcers), 영구적 고막천공(permanent tympanic membrane perforations), 욕창(pressure sores), 욕창궤양(decubitus ulcers)과 같은 피부질환 치료에 많이 사용되고 있다. 따라서 본 연구에서는 기능성이 우수한 맥문동 추출물을 HCM에 혼합하여 맥문동 혼합 하이드로콜로이드막(HCM-LP)을 제조하고, 물리화학적 특성을 분석한 뒤 2도 화상을 유발한 SD 랫드에 14일 동안 처리하여 치료효과를 분석하였다. 그 결과, 일반 하이드로콜로이드막(HCM)에 비하여 HCM-LP에서 인장강도와 흡수성은 각각 38.4%, 46.3% 감소하였으나 표면거칠기는 38.1% 증가하였다. 화상을 유발한 SD 랫드에서 HCM-LP를 처리한 결과, 화상 유발 14일 후에 HCM-LP처리그룹은 GZ처리그룹에 비하여 유의적으로 화상크기 감소를 나타내었을 뿐만 아니라 흉터감소, 재상피화, 신생혈관형성 그리고 세포외기질의 침적을 유도하였다. 따라서 이러한 결과는 HCM-LP가 신생혈관형성과 연결조직형성 조절을 통해 SD 랫드에서의 화상 치료를 향상시킴을 의미한다. 또한, 본 연구는 HCM-LP가 피부상처의 치료에 적용할 수 있는 다른 기능성 물질을 포함하는 HCM의 개발에 대한 가능성을 제시하고 있다.
Keywords
서 론
하이드로콜로이드(hydrocolloid membrane, HCM) 드레싱제(dressing)는 여러 가지 형태의 궤양(ulcers), 조직이식부위(graft donor site), 외상(superficial wound), 화상(burns) 등의 상처치료를 위한 목적으로 사용되고 있다 [29] . 이러한 드레싱제는 일반적으로 내부 접착층(adhesive layer)과 반투과성재 질(semipermeable material)의 외부층으로 구성되어있으며, 내부 접착층은 감염위험성의 증가 혹은 기초조직(underlying tissue)에 대한 위험요인을 최소화하면서 상처부위와 인접 정상피부를 견고하게 결합시키는 역할을 한다 [12] . 또한, HCM 드레싱제는 원하는 모양이나 크기로 쉽게 절단할 수 있도록 쉬트형태로 만들어지기 때문에 이를 기반으로 새로운 우수한 효능을 갖는 제품을 개발하는 연구들이 활발히 진행되고 있다 [31] . 이러한 연구의 일환으로 HCM에 다양한 천연추출물을 첨가함으로써 화상치료를 촉진시키는 새로운 개념을 드레싱제를 개발하고 효능을 평가하기 위한 연구들이 진행되고 있다 [18] . 하지만 항산화능이 우수한 천연물을 활용한 드레싱제 개 발은 아직 이루어지지 않고 있다.
한편, 다양한 천연물 중에서, 맥문동( L. platyphylla )은 백합과에 속하는 다년생 상록 초본식물로 우리나라를 비롯하여 중국, 일본, 유럽 등에서 약용으로 재배되거나 관상용으로 사용되고 있다 [19] . 특히, 맥문동의 뿌리는 다양한 만성질환에 대해 우수한 치료효능을 갖는 것으로 알려져 있다. 먼저, 맥문동은 ovalbumin (OVA)로 천식을 유발시킨 동물에서 Th1과 Th2 사이의 사이토카인 불균형 관계를 조절함으로써 염증과 과민 반응성을 억제하여 항염증 및 항천식 효과를 나타내었다 [20] . 또한, 맥문동이 첨가된 Gyeongshingangjeehwan (GGEx)은 비만 및 당뇨모델동물인 Otsuka long-evans Tokushima fatty (OLETF) 랫드에서 peroxisome proliferator-activated receptor-α(PPARα)에 작용하여 지방세포 내 포도당 흡수를 감소시켜 비만과 고지혈증을 개선하였다 [11] . 맥문동 열수추출물은 제2형 당뇨병 모델동물의 간 세포에서 당 흡수를 촉진하고 췌장 β-세포에서 인슐린 분비를 유도하였다 [14] . 더불어 맥문동은 신경퇴행성질환에도 우수한 치료효능을 나타내었다. 맥문동의 스테로이드 사포닌 성분중의 하나인 spicatoside A는 ERK1/2와 PI3K를 통해 TrkA 수용체 신호전달을 촉진함으로서 신경세포의 성장을 촉진하였으며 [9] , 맥문동의 증숙으로 제조된 홍문동(red L. platyphylla )는 NSE/hAPPsw 알츠하이머질환 모델동물에서 nerve growth factor (NGF) 분비능, NGF 수용체 신호전달과정 활성화, Aβ-42 펩타이드 침적의 감소, γ-secretase 구성요소의 변화를 유도하였다 [6] . 최근 연구에 따르면, 맥문동은 아토피 모델동물인 NC/Nga 마우스에서 외형적인 증상뿐만 아니라 귀두께 감소, 비만세포 침윤의 감소, IgE 농도의 감소 등의 측면에서 매우 우수한 효과를 나타내었다 [16] . 맥문동 열수추출물은 loperamide-유도 변비모델동물에서 배변량 증가, 소변량 증가, 장조직의 회복, M2수용체 신호전달과정의 변화, paneth세포와 goblet세포의 회복 등을 유도하여 유의적으로 변비증상을 완화시키는 효과를 나타내었다 [15] . 그러나, 맥문동을 화상치료에 적용하고 작용기전을 분석하기 위한 연구는 현재까지 보고되고 있지 않다.
따라서 본 연구는 기능성이 우수한 맥문동 추출물을 HCM에 혼합하여 맥문동 혼합 하이드로콜로이드막(HCM-LP)를 제 조하여 물성을 분석하고, 이를 SD 랫드의 피부에 유발된 2도 화상에 14일 동안 처리하여 치료효능을 분석하고자 하였다. 이러한 결과는 HCM-LP가 우수한 화상치료용 드레싱제로 개발될 가능성을 제시하는 새로운 과학적 근거를 제공하고 있다.
재료 및 방법
- HCM-LP의 제조
HCM-LP를 제조하기 위해, 먼저 하이드로콜로이드 반응기(Youngchemical LTD, Korea)에 석유수지 200 g을 넣고 충분 히 녹인 후 고무 200 g와 테트라키스메탄 6 g을 넣고 1시간 30분간 교반하여 예비중합체를 제조하였다. 준비된 예비중합 체에 셀룰로오스검 210 g, 유동파라핀 70 g을 넣고 충분히 분산시켜 점성복합체를 제조하였으며, 복합체 용량의 10%의 양에 해당하는 맥문동 유수추출물분말을 분산시켜 HCM-LP 복합체를 제조하였다. 제조된 복합체는 실리콘이 코팅된 이형지(release paper) 위에 나이프-코터기로 450 μm두께로 도포하고, 그 위를 폴리우레탄 필름(polyurethane film)으로 덮어 최종적으로 폴리우레탄을 지지체로 한 HCM-LP를 제조하였다.
- HCM-LP의 흡수성 분석
HCM-LP의 흡수성을 분석하기 위하여, HCM과 HCM-LP를 각각 1.8 cm × 2 cm의 크기로 절단하여 phosphate buffered saline (PBS) 용액에 침전시킨 후, 24시간 간격으로 3주간 무게 변화를 전자저울(Mettler Toledo, Plainview, NY, USA)을 이 용해 측정하고 단위 부피당 중량변화로 환산하였다.
- 원자력현미경(Atomic Force Micros-copy) 분석
HCM-LP의 표면상태를 분석하기 위하여, 각 시료를 2 cm × 2 cm로 절단하여 준비한 후 표면에 3곳의 동일한 면적(30 μm × 30 μm)을 설정하여 AFM (XE-100, Park systems Corp., Santa Clara, CA, USA)을 이용하여 표면형태(surface morphology)와 표면 조도(surface profile)를 측정하였다. 또한, 표면거칠기는 표면조도 값을 이용하여 Root mean square (RMS) 값으로 환산하였다.
- 인장강도와 신장률
HCM과 HCM-LP를 1 cm × 7 cm의 크기로 절단하여 인장강도 측정기(United Calibration Corp., Huntington Beach, CA, USA)를 이용하여 제조사의 권장법에 따라 측정하였다. 필름을 측정기 사이에 고정 시킨 후 필름의 파단이 일어나기 직전까지 위로 당겨 5 kg Load에서 30.000 mm/min의 속도로 3번 측정하여 평균값을 이용하였다.
- X-ray diffractometer (XRD) 분석
먼저, HCM과 HCM-LP를 10 mm × 15 mm로 절단한 후 X-ray diffractograms은 Wide–angle X-ray Diffractometer (WAXD; Rigaku Dmac 2,000 V)(Rigaku, Tokyo, Japan)의 Cu KR방사선(●=1.5406 Å)을 이용하여 40 kV, 30 mA조건에서 2θ = 5-40°의 범위로 측정하였다 [33] . 또한, HCM-LP의 결정 화도(crystallinity)는 이전에 제시된 방법에 따라 X-ray diffractograms으로부터 결정하였다 [30] . 결정화도 지수(Crystallinity index, CrI)는 다음의 식을 이용하여 계산하였으며, 여기서 h ct 는 crystalline height이고, h am 은 amorphous height이다
CrI = 1 - h am / h ct = 1 - h am /( h tot h am )
- 동물실험 설계
본 연구는 부산대학교 동물윤리위원회(PNU-IACUC)로부터 과학성과 윤리성에 대한 심사를 거쳐 승인(승인번호: PNU-2013-0458)받아 수행하였다. 실험에 사용된 SD랫드(6주령, 수컷)는 Samtako (Osan, Korea)로부터 구입하였으며, 물과 사료를 자유급식하도록 하였다. 모든 동물실험은 12시간의 조명주기(08:00~20:00)로 specified pathogen-free (SPF) 상태에서 온도 22±1℃, 상대습도 50±5%의 조건으로 관리되고, 국제실험동물인증협회(AAALAC International, 인증번호: 001525)의 인증을 획득한 부산대학교 청정실험동물센터(PNU-Laboratory Animal Resources Center)에서 사육하였다
먼저, 실험동물(n=20)은 거즈만을 처리한 그룹(GZ처리그룹, n=10)과 HCM-LP를 처리한 그룹(HCM-LP처리그룹, n=10)의 2개로 분리하고, 각 그룹은 다시 7일 동안 처리그룹과 14일 처리그룹으로 세분하였다. 2도 화상을 유발하기 위해 실험동물은 Zoletil (VirBac, Corros cedex, France) (50 mg/kg body weight)로 마취한 후 등쪽에 털을 제모기를 이용하여 제거하고 70% 에탄올로 소독한 뒤 약 90℃의 metal plate (diameter 1.5 cm)를 10초 동안 피부에 접촉하였다. GZ처리그룹은 화상부위를 멸균된 거즈로 처리하였으며, HCM-LP처리그룹은 소독 처리된 HCM-LP를 각각 7일과 14일 동안 처리하였다. 화상부위의 회복 정도는 7일과 14일 경과 후 육안으로 관찰하였고, 상처크기(wound size)는 사진기로 촬영된 화상부위의 지름을 Leica Application Suite (Leica Microsystems, Solms, Germany)로 측정하였다. 거즈와 HCM-LP의 교체는 7일에 화상부위를 관찰한 후 1회 실시하였다. 실험종료 후 랫드는 이산화탄소(CO 2 ) 가스를 이용하여 안락사한 뒤 혈액과 피부조직을 적출하여 분석에 사용하였다.
- 조직학적 분석
HCM과 HCM-LP를 처리한 각 실험 군의 SD랫드로부터 채취된 화상피부조직은 10% 포르말린 용액에 48시간 동안 고 정한 뒤, 적절한 크기로 절단하여 카세트에 넣고 조직처리기(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 탈수, 투명화, 파라핀 침투과정을 거쳤다. 고정된 조직은 paraffin embedding station (Leica Microsystems GmbH)에서 카세트에 고정하고, Leica microtome (Leica Microsystems GmbH)을 이용하여 4 μm절편으로 박절하여 슬라이드글라스 위에 부착시켰다. 조직절편은 탈파라핀 및 함수 과정을 거친 뒤 hematoxylin 및 eosin (H&E, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)으로 염색을 하고 탈수과정, 투명화 과정 후에 봉입되었다. 표피와 진피의 두께 등은 Leica Application Suite (Leica Microsystems GmbH)를 이용하여 측정하였다.
또한, 피부절편 내 비만세포(mast cell)는 toluidine blue를 사용하여 이전의 논문에서 제시된 방법에 따라 염색하였다 [13] . 절편된 화상피부조직은 paraffin 제거와 탈수과정을 거친 후, 0.25% toluidine blue 용액(Sigma-Aldrich Co.)으로 피부조직을 염색하여 광학현미경으로 비만세포의 침윤 정도를 관찰하였다. 비만세포는 지정된 범위(2.5×10 -2 mm 2 )에 분포된 수를 Leica Application Suite (Leica Microsystems)를 이용하여 측정하였다.
- Western Blot analysis
피부조직으로부터 준비된 단백질을 SDS-PAGE gel에 전기영동 한 후 enhanced chemiluminescence (ECL) membrane (GE healthcare, Little Chalfont, UK)에 전이한 뒤 blocking을 실시하였다. 단백질이 전이된 막은 anti-vascular endothelial growth factor (VEGF, Pepro Tech., Rocky Hill, NJ, USA), anti-collagen (Abcam, Cambridge, UK), anti-matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), Santacruz Biotechnology, Santacruz, CA, USA), anti-beta-actin (Sigma-Aldrich Co.) 등의 1차 항체로 4℃에서 밤새 배양한 후, HRP-conjugated된 secondary antibody를 첨가하여 2차 반응을 시켰다. 반응이 끝난 membrane을 충분히 세척하여 ECL detection Kit (GE healthcare)로 발현을 확인하였다.
- 통계학적 분석
HCM처리그룹과 HCM-LP처리그룹 간에 통계적 유의성은 일원배치분산분석(SPSS for windows, Release 10.10, Standard Version, Chicago, IL, USA)을 사용하여 분석하였고, 모든 값은 평균±SD로 표기하였으며, p <0.05를 유의성으로 간주하였다.
결과 및 고찰
- HCM-LP의 물성
HCM-LP의 물성을 분석하기 위해, HCM과 HCM-LP에 대한 흡수성, 인장강도, 신장률을 측정하였다. HCM-LP의 인장 강도는 HCM에 비하여 41% 감소하였으나 신장률은 405-406%로 HCM과 유사하게 측정되었다(Fig. 1A). 결정화도 분 석결과에서, HCM의 X-ray diffractograms에서는 예리한 피크가 26.3 (2θ)에서 관찰되었으며, HCM-LP의 X-ray diffractograms에서는 광범위하게 넓은 피크가 18.54 (2θ)에서 관찰되었다. 이러한 결과로부터 계산된 결정화도는 HCM이 HCMLP보다 높게 측정되었다( Fig. 1B ). 또한, 수분흡수율 실험에서, HCM의 무게는 2일까지 817%로 급속히 증가한 이후 점진적으로 감소하여 20일에는 210%수준까지 감소하였다. HCM-LP의 무게는 전체적으로 HCM과 유사한 변화의 양상을 나타내었다. 그러나 최대무게는 1일에 637%로 증가한 이후 점진적으로 감소하여 20일후에는 105%로 정상수준으로 회복되었다. 무게감소율은 HCM (30.7%)보다 HCM-LP (37.2%)가 높게 측정되었다( Fig. 1C ). 따라서 이러한 결과는 LP의 혼합으로 제조 된 HCM-LP는 인장강도, 결정화도, 흡수성이 감소하지만 신장률은 유지됨을 제시하고 있다.
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Physico-chemical properties of HCM and HCM-LP. (A) Physical properties including tensile strength and strain rate were analyzed using three to five HCM and HCM-LP samples in triplicate. (B) The crystallinity was calculated from X-ray diffractograms. In HCM, two peaks observed at 10-30 (2θ) indicated the well-defined principal peak corresponding to cellulose I and cellulose II. (C) The water absorptivity of HCM and HCM-LP was determined by a gravimetric method, and three to five membranes were assayed in duplicate. The values shown are the means ± SD. *, p<0.05 compared to the HCM treated group.
한편, 피부조직의 재생을 위해 사용되는 소재는 드레싱 부착기간동안 습윤상태를 유지하고 삼출물(exudates)를 흡수할수 있어야 한다 [8] . 비록 상처표면을 건조시키고 제거에 따른 트라우마(trauma)를 유발함에도 불구하고 피부재생 소재로서 거즈는 오랫동안 사용되어 오고 있다 [8] . 그러나 최근에는 수분보유력이 높고, 강한 기계적 강도, 우수한 생체적합성을 갖으며, 치유효과가 우수한 새로운 바이오소재를 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 이러한 연구의 일환으로 우수한 항산화능을 갖는 새로운 소재를 첨가한 HCM을 제조하고자 하였으며 이들의 물성을 분석한 결과 화상치료 드레싱제로서 적합성이 높은 것으로 평가되었다.
- HCM-LP의 표면구조
HCM-LP의 표면구조 및 형태분석을 위해 원자력현미경으로 관찰한 결과, HCM-LP의 표면 형상은 HCM에 비하여 불균일하였으며, 표면거칠기가 38.1% 더 높게 측정되었다( Fig. 2 ). 이러한 결과는 HCM-LP가 표면거칠기의 증가로 상처부위와 접촉 면적을 높여 줄 가능성이 있음을 제시하고 있다.
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AFM phase image of HCM and HCM-LP. (A) 3D-images of BCM on the wet form were analyzed by AFM using a 25 μm2 scan size (3×3 μm). Three to five samples were assayed in duplicate by AFM analysis. (B) The surface roughness of HCM-LP was determined as described in the Materials and Methods. The values shown are the means ± SD. *, p<0.05 compared to the HCM treated group.
- 화상크기 감소율(wound close rate)에 미치는 HCM-LP의 효과
화상은 열, 전기, 화학물질, 마찰(friction), 방사선(radiation)등 다양한 원인에 의해 피부에 발생하는 외상성 손상 (traumatic injuries)으로서 열이 가장 큰 원인으로 알려져 있다 [27] . 실제, 임상적인 치료대상인 2도 화상은 진피와 표피부분에 손상이 발생하며, 표면에 섬유성 삼출물(fibrinous exudates)과 회저성 조직파편(necrotic debris)이 침적될 뿐만 아니라 물집(blisters)이 생성된다 [5 , 23] . 이에 따라서 화상을 유발하기 위해서는 다양한 방법이 적용되었다. 이전연구에서, 2 cm지름과 314 mm 2 표면적의 작은 원판을 110℃로 가열하여 10초 동안 피부에 접촉하여 2도 화상을 유발하거나 [24] , 90℃의 전기가열기(electrical scalding machines)를 8초 동안 피부에 접촉하거나 [22] , 전기용접인두의 막대에 1 cm 지름의 둥금판을 부착하여 200℃에서 20초 동안 접촉하여 유발하였다 [3] . 본 연구에서는 90℃로 가열된 금속막대를 10초간 SD랫드의 등쪽 피부에 접촉하여 성공적으로 2도화상을 유발할 수 있었다. 화상유발조건은 이전의 연구와 차이가 있으나 피부에 나타나는 표현형과 조직의 변화는 전형적인 2도화상의 특성을 나타내었다.
따라서, HCM-LP가 2도 화상크기 감소율에 미치는 영향을 평가하기 위하여, hairless 마우스의 등에 직경 15 mm의 금속 막대로 90℃에서 10초간 2도 화상을 유발시킨 후 2주간 HCM-LP를 처리하면서 화상부위의 지름을 측정하였다. 그 결과, GZ처리그룹의 화상부위 외부형태는 딱지(scab)가 심하게 형성되었고 부어오름(swelling)이 관찰되었으며, 출혈(bleeding)도 일부 관찰되었다. 그러나, HCM-LP처리그룹의 화상부위 외부형태는 진물, 딱지, 부어오름이 발견되지 않았고 7일차에서 화상부위의 가장자리에 약간의 출혈이 관찰되었다( Fig. 3A ). 또한, 상처크기는 7일차까지는 GZ처리그룹과 HCM-LP처리그룹 사이에서 유의적인 차이를 나타내지 않았지만 14일 차에는 GZ처리그룹의 상처크기가 거의 줄어들지 않은 반면에 HCM-LP처리그룹의 경우는 절반 이상 축소된 양상이 관찰되어 두 그룹간의 유의적인 차이를 나타내었다( Fig. 3B ). 따라서 이러한 결과는 HCM-LP의 처리는 2도 화상부위에 딱지, 붓기, 진물의 형성을 막아주어 화상크기를 빨리 감소시켜주는 효과가 있음을 제시하고 있다.
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Healing pattern of burn wound skin as time passes. (A) A burn wound in the dermis was created by contact with a steel rod at 90℃ on the back skin of SD rats, then covered with GZ or HCM-LP. At each time point, images of burn wound skin of rats of each group were taken, and the morphological features were evaluated. (B) The diameter of wound was measured in photoimage using Leica Application Suite. (C) The total score for skin severity was defined as the sum of the individual scores, graded as 0 (none), 1 (mild), 2 (moderate), and 3 (severe) based on erythema, edema, hemorrhage, and scar formation. Five or six wounds were assayed in triplicate using wound area analysis. The values shown are the means ± SD. *, p<0.05 compared to the GZ treated group.
- HCM-LP의 화상회복 효능에 대한 조직학적 분석
HCM-LP가 화상회복에 미치는 조직학적 변화를 관찰하기 위하여, 화상부위 피부조직에서 표피와 진피의 두께, lipid pore의 수, 딱지의 두께 등의 변화를 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 진피에 lipid pore의 수는 7일차의 두 그룹에서 급격하게 증가하였으며, HCM-LP처리그룹(55.2개)이 GZ처리그룹(31.2개)에 비하여 76.9% 높게 관찰되었다. 그러나, 14일차로 시간이 경과함에 따라 그 수가 감소하는 경향을 나타내었으며, HCM-LP처리그룹에서는 14일차에 lipid pore의 수가 7일차에 비하여 97.8% 감소하여 정상상태와 유사하게 회복되었지만 GZ처리그룹에서는 lipid pore의 수가 58%만 감소하였다. 또한, 시간의 경과에 따라서 lipid pore의 분포도 두 그룹간에 차이를 나타내었다. GZ처리그룹에서는 lipid pore가 시간경과에 따라 진피의 아랫부분에서 윗부분으로 이동하였으나 HCM-LP처리그룹에서는 초기에는 GZ처리그룹과 동일하게 아랫부분에 분포하였고 시간경과에 따라 진피조직에 균등하게 분포되었다( Fig. 4A and B ).
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Histological analysis after HCM-LP application. (A) H&E stained sections of subcutaneous tissue surrounding the HCM-LP applied to SD rats at different time points were observed using a light microscope at magnifications of 40× (left panel), 100x (middle panel) and 400× (right panel). (B) Thickness of the epidermis and dermis and number of blood vessels at the indicated time points in GZ and HCM-LP treated rats were measured using Leica Application Suite as described in the materials and methods. Data represent the means ± SD from three replicates. *, p<0.05 compared to the GZ treated group. ND ; not detected.
더불어, 재상피화(reepithelialization)와 혈관생성(vascularization)도 유의적인 차이가 관찰되었다. GZ처리그룹에서는 7일차에 형성된 딱지가 14일차까지 유지되었으며, 재상피화와 혈관생성은 거의 관찰되지 않았다. 그러나, HCM-LP처리그룹은 7일차에 딱지는 관찰되지 않았으며 14일차에 재상피화뿐만 아니라 혈관생성이 많이 관찰되었다( Fig. 4 ). 또한, 표피두께는 14일차에 HCM-LP처리그룹이 GZ처리그룹에 비하여 유의적으로 크게 증가하였지만, 딱지 두께는 반대로 GZ처리그룹이 HCM-LP처리그룹에 비하여 증가되었다( Fig. 4B ). 이러한 결과는 HCM-LP처리는 화상부위의 lipid pore 수의 감소, 피부 재상피화, 혈관생성, 상피생성 등을 촉진함으로서 화상조직의 회복을 촉진시킴을 제시하고 있다. 한편, 화상이나 창상조직에서 재상피화를 촉진하는 다른 식물자원으로는 쌀에 대한 효능이 일부 알려져 있다. 쌀가루(rice flour)는 진정(soothing)과 냉각(cooling)효과를 갖고 있기 때문에 화상이나 열상에 의해 손상된 피부의 염증반응에 우수한 치료효과를 나타내었으며 [32] , 탄소화된 외피왕겨(carbonized rice husk)는 landolin기름과 함께 창상모델에 처리하였을 때 상처의 재상피화를 촉진하였다 [2] . 따라서 본 연구결과는 HCM-LP가 화상치료에 우수한 조직재생효과를 나타내는 새로운 소재로서 개발 가능성에 대한 과학적 근거를 제공하고 있다.
또한, HCM-LP가 화상조직에서 염증반응에 미치는 영향을 평가하기 위해 화상피부 조직에 대한 toluidine blue 염색을 실시하여 비만세포수의 변화를 관찰하였다. 비만세포의 기능은 제 1형 과민반응 시 중요한 역할을 하는 것으로 널리 알려져 있으며 [28] , 특히 창상치유에 있어 비만세포의 활성화는 염증단계를 조절하여 결합조직 내 세포들이 새로운 지지조직을 합성하는데 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 [26] , 화상 창상의 치유 단계에서 비만세포수의 증감이 치유 과정과 관련 있는 것으로 보고된 바 있다 [25] .
비만세포수의 분석에서, 7일차에 HCM-LP처리그룹(8.2개)은 GZ처리그룹(58.2개)에 비하여 비만세포의 수가 85.9% 낮았으며, 14일차로 시간이 경과함에 따라 점진적으로 감소하였다. 그러나 14일차에도 HCM-LP처리그룹(5.4개)은 GZ처리그룹(44.6개)에 비하여 비만세포의 수가 87.8% 낮게 유지되었다( Fig. 5 ). 따라서 이러한 결과는 HCM-LP는 화상조직에서 염증반응을 억제하는 효과가 있음을 제시하고 있다.
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Infiltration of mast cells in the burn wound treated with HCM-LP. After final treatment, skin tissues were collected from GZ or HCM-LP treated rats. The slide sections of skin tissue were stained with toluidine blue and then observed at 40× (left panel), 100x (middle panel) and 400× (right panel) magnification. The arrow indicates the infiltrated mast cells in the dermis of the skin. Data shown are the means ± SD (n=5). *, p<0.05 compared to the GZ treated group.
지금까지 2도 화상의 치료를 위해 하이드로콜로이드 형태의 드레싱제를 직접 화상부위에 적용하는 연구는 수행된바 없지만 일부 변형된 형태의 하이드로겔이나 복합막이 화상치료 연구에 적용되었다. DMEM/F12배지를 포함하는 chitosan 하이드로겔은 Wistar 랫드의 피부화상에서 상처의 크기를 유의적으로 감소시켰고, granulation과 상피의 두께를 증가시키고, 신생혈관의 수를 증가시킴으로써 화상회복을 촉진시켰다 [17] . 또한, 재조합 거미줄단백질(recombinant spider silk protein)을 포함하는 복합막은 2도 화상에서 5일 이후부터 화상의 회복속도를 촉진시켰으며, 14일부터 새로운 표피세포와 피하조직을 두꺼워지게하고, 염증세포의 침윤을 억제하는 효과를 나타내었다 [4] . 본 연구에서 사용된 HCM-LP도 이전에 보고된 형태의 막과 유사하게 화상의 granulation과 신생혈관의 생성을 촉진하고, 염증세포의 침윤억제와 상피재생을 촉진하는 효과를 나타내어 하이드로콜로이드 드레싱제가 화상 치유에 효과적임을 제시한다.
- HCM-LP가 화상회복 관련 단백질 발현에 미치는 영향
2도화상이 유발된 피부조직의 회복에 관련된 단백질의 발현에 미치는 HCM-LP의 영향을 분석하기 위하여, GZ처리그룹과 HCM-LP처리그룹의 피부조직에서 MMP-1, Collagen, VEGF 단백질 발현변화를 Western blot 분석을 통해 관찰하였다. 그 결과, MMP-1의 발현량은 두 그룹 모두에서 7일차에 비해 14일차에서 증가하는 경향을 나타내었으나, HCM-LP처리그룹이 GZ처리그룹에 비하여 유의적으로 증가하였다( Fig. 6A and B ). 하지만 MMP-1의 기질인 collagen의 발현량은 MMP-1과 반대경향을 나타내었다. 실험에 사용된 모든 시기에서 HCM-LP처리그룹은 GZ처리그룹에 비하여 유의적으로 낮은 collagen발현을 유지하였다( Fig. 6A and C ). 한편, VEGF 단백질의 발현량은 GZ처리그룹에 비하여 HCM-LP처리그룹에서 전체적으로 높게 나타났으며, GZ처리그룹의 발현량이 시간 경과에 따라 유의적인 변화가 없는 것과는 반대로 HCMLP그룹의 발현량은 14일차에 더욱 증가하였다( Fig. 6A and D ). 이러한 결과를 종합적으로 보았을 때, HCM-LP는 MMP-1 발현 조절을 통해 상처회복을 촉진시키고 VEGF 발현 촉진을 통해 신생혈관형성을 자극함을 제시하고 있다.
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Expression of proteins related with angiogenesis and the formation of connective tissue in the burn wound skin. After the final treatment, the expression levels of MMP-1, collagen and VEGF were measured with specific antibodies in the burn wound skin collected from rats of each group at different time points. Data represent the means ± SD from three replicates. *, p<0.05 compared to the GZ treated group.
한편, collagen은 세포의 모양, 분화, 이동, 단백질의 합성과 같은 많은 세포적 기능의 조절에 참여하고 상처의 회복에 참여하는 중요한 구성성분이다 [1 , 10 , 21] . 여러 가지 콜라겐 중에서 Type I과 III collagen은 화상치료 효능의 평가에서 중요한 지표로 사용된다. Endogenous cytokine의 발현을 조절하는 Imiquimod을 처리한 화상 Wistar 랫드에서 Type I collagen의 발현은 saline 처리그룹에 비하여 7일부터 유의적으로 발현양이 감소하였으나 Type III collagen은 유의적 변화가 없었다 [7] . 본 연구에서도 HCM-LP를 처리한 랫드의 피부조직에서 Type I collagen의 발현은 GZ처리그룹에 비하여 유의적으로 감소하여 이전에 발표된 논문과 유사한 결과를 나타내었다.
결 론
본 연구에서는 맥문동을 이용하여 새로운 화상치료용 드레싱제를 개발하고, 이들의 효능을 평가하고자 하였다. 이를 위해 먼저 맥문동 추출물이 포함된 HCM-LP의 물성을 분석한 결과 비록 인장강도, 흡수성, 결정화도는 HCM에 비하여 감소하지만 표면거칠기는 증가됨을 확인하였다. 더불어 14일 동안 실험동물의 2도 화상에 적용한 결과, 조직재생, 결합조직 형성, 신혈관생성 등을 포함한 화상치료를 촉진하는 효과가 있음을 제시하고 있다. 또한, 본 연구는 HCM-LP가 피부상처의 치료에 적용할 수 있는 다른 기능성 물질을 포함하는 HCM의 개발에 대한 가능성을 제시하고 있다.
Acknowledgements
본 연구는 교육부의 산학협력선도대학지원사업(LINC)과 한국연구재단의 일반연구자지원사업의 지원에 의해 수행되었습니다.
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