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Optimization Mixture Ratio of Petasites japonicus, Luffa cylindrica and Houttuynia cordata to Develop a Functional Drink by Mixture Design
Optimization Mixture Ratio of Petasites japonicus, Luffa cylindrica and Houttuynia cordata to Develop a Functional Drink by Mixture Design
Journal of Life Science. 2015. Mar, 25(3): 329-335
Copyright © 2015, Korean Society of Life Science
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  • Received : December 02, 2014
  • Published : March 30, 2015
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About the Authors
해진 정
경필 이
헌식 정
동섭 김
한수 김
영환 최
동순 임
종환 성
영근 이
lyg5354@pusan.ac.kr

Abstract
호흡기계 질환에 효과적이라고 알려져 있는 식물성분들을 이용하여 기능성 음료를 개발하고자, 혼합물 실험계획법을 통해 혼합 최적 비율을 찾기 위한 실험을 수행하였다. 즉, 머위 30~70%, 수세미 10~30% 및 어성초 10~30%의 비율로 혼합하여 중앙점 반복을 포함하여 총 12개의 실험점을 설계하였고, 이 설계를 바탕으로 혼합물은 121℃에서 45분간 중탕 추출을 하여 anti-allergy activity 및 anti-microbial activity를 측정하였다. anti-allergy activity 효과는 Response surface와 trace plot을 보면 머위의 함량이 많을수록 좋은 효과를 나타내었고 수세미는 다소약한 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. 다중회귀분석 결과 상관계수 R 2 =82.10%이며 유의적인 회귀식으로 설명이 가능한 것으로 확인되었다. 따라서 최적비율은 머위 0.75, 수세미 0.14 그리고 어성초 0.11의 비율로 결정되었다. anti-microbial activity는 혼합비율에 따른 각 추출물들이 그람양성균인 Staphylococcus aureus (KCCM 40881), Staphylococcus epidermidis (KCCM 35494)에 대해서는 유효하나 그람음성균인 Escherichia coli (KCCM 11234), Pseudomonas aeruginosa (KCCM 11328)에 대해서는 미미하거나 효과가 나타나지 않았다.
Keywords
서 론
빠른 경제성장과 도시화로 인한 환경오염이 심각하고 그와 동시에 호흡기계 질병 발생이 급격하게 증가하고 있다. 건강 보험심사평가원이 최근 5년간(2009~2013년)의 건강보험 및 의료급여 심사결정자료를 이용하여 분석한 결과, 비염인 경우 진료인원은 2009년 약 549만명에서 2013년 627만명으로 5년간 약 78만명(14.2%)이 증가하였으며, 총 진료비 또한 2009년 1,616억원에서 2013년 1,995억원으로 5년간 약 380억원(23.5%) 이 증가하였다 [2 , 14 , 24] .
비염, 축농증, 천식 등과 같은 호흡기계 질병은 알레르기성 또는 세균감염에 의해 야기되고 대표적인 균 종은 Staphylococcus aureus , Staphylococcus epidermidis , Pseudomonas aeruginosa , Streptococcus spp. 등이 있다 [20] .
최근 2000년 이후로 웰빙 시대가 도래되는 만큼 건강에 대한 관심과 건강기능 식품에 대한 소비가 급격하게 증가하고 있다. 자연계에 존재하는 천연물의 유용성분에 대한 영양적측면과 약리적 측면에 대해 그 효능을 밝히려는 연구가 활발히 진행 되고 있으며 그에 따른 높은 부가가치를 가진 식품소재 개발이 주목 받고 있다 [7 , 11] .
머위(Petasites japonicas)는 중국 및 우리나라 등 아시아 지역에서, 햇볕이 잘 드는 곳에서 잘 자라는 국화과에 속하는 다년생 초본 식물이다 [21] . 머위는 오래 전부터 진해, 진정, 천식, 이뇨 및 풍한 등에 효능이 있는 것으로 알려져 민간요법으로 많이 사용되어 온 [6] Petasites 종으로서, petasin류와 bakkenolide류 등의 sesquiterpenoid를 비롯한 여러 가지 생리활성물질을 가지고 있어 혈압 강화 효과 및 anti-allergy activity 효과가 있는 것으로 보고되었다 [8 , 18 , 23] .
수세미( Luffa cylindrical ) 는 박과 식물로 덩굴성 1년생 초본이고 일본과 중국에서 유래 되었으며 따뜻하고 습한 지역에서 잘 자란다. 수세미는 saponin, coumaric acid, α-spinasterol 및 luteolin 등의 기능성분을 가지고 있어 한방에서는 지혈, 이뇨, 소종, 치통, 혈행부전 등에 이용된 기록이 있고, 최근에는 감기, 알레르기 비염 및 변비 등에 좋고 피를 맑게 하는 청혈작용을 한다고 알려져 있다 [4 , 5 , 12] .
어성초( Houttuynia cordata )는 삼백초과에 속하는 다년생 초본으로써 음습한 곳에 자라는 식물로서 잎과 줄기에서 독특한 냄새, 즉 생선비린내가 난다. 이 냄새로 인해 어성초라 불리며 약모밀, 취영단, 십약이라고도 불리어지고 있다 [25] . 어성초에는 quercitrin, kaempferol, aristolactam, decanyl acetaldehyde 및 capryl aldehyde 등의 다양한 생리활성 물질이 함유되어 있으며, 이들 성분은 약리학적으로 anti-allergy activity 증 작용, anti-microbial activity, 항암작용 뿐만 아니라 기관지염, 이뇨, 폐염 및 만성비염 등에 효능이 있는 것으로 알려져있다 [3] . 또한 최근 연구에서는 어성초의 열수 추출물이 항백 혈성효과, 항암효과 그리고 항산화 효과 등이 있다고 보고된 [9 , 17 , 22] 바 있다.
본 연구는 앞선 연구에서 비염, 천식 등의 호흡계 질환에 효능 있는 것으로 알려져 있는 머위, 수세미 그리고 어성초를 이용한 혼합물의 최적혼합비율을 찾기 위하여, 비염에 연관된균과 세포를 통한 anti-allergy activity 및 anti-microbial activity를 종속변수로 한 반응표면분석을 실행하므로써 식품학적 측면과 약리학적 측면에서 고부가가치가 있는 건강기능음료를 개발하는 기초자료를 얻고자 하였다.
재료 및 방법
- 실험 재료
머위 잎은 전라북도 장수군에서 2013년 수확한 것을 생머위로 구입하였고, 수세미는 경상북도 경주에서 그리고 어성초는 경상남도 진주에서 채취한 것을 건조 된 상태로 구입하여 사용하였다.
- 혼합 비율의 최적화를 위한 실험 디자인
MINITAB 17 (Minitab Inc, state college, USA) 을 이용하여 혼합 최적 비율을 알기 위해 혼합물 설계하였다. 머위, 수세미, 어성초의 각 혼합 비율을 Table 1 와 같다. 머위, 수세미, 어성초의 최소 및 최대 범위는 머위 30~70%, 수세미 10~30% 그리고 어성초 10~30%으로 하였고, 실험은 중심에 반복점을 더 하여 총 12개의 설계점( Fig. 1 )으로 수행하였다. 모든 실험 순서 (RUN)는 오차를 줄이기 위해 무작위로 실행하였다.
Experimental design of mixtures for finding the optimal mixture ratio
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A : Petasites japonicus B:Luffa cylindrica C:Houttuynia cordata Pseudo component=xi=(xi-li)/(1-=0lj),x1+x2+⋯+xp=1
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Plot of a modified distance design in the mixture region.
- 추출 제조
머위 잎, 수세미 그리고 어성초는 40℃에서 건조(DE/ULE 400, Memmert, Nuremberg, Germany)한 후 사용하였다. 모든 시료들은 분쇄기(HMF-3100S, Hanil Electric Co., Seoul, Korea)를 이용해서 마쇄하여 사용하였다. 설계된 조건( Table1 )을 바탕으로 원료의 비율대로 합하여(각 설계점의 총 원료량합 = 100 g) 중탕추출기(Dongnam Co., Daejeon, Korea)를 이용하여 121℃에서 45분간 증류수 500 ml 와 함께 열수 추출을 하였다. 이어 추출물은 Whatman NO.2를 사용하여 1차 여과를 한 후 Whatman GF/F 90 mm로 감압여과를 2차로 하였다.
- Cell 배양
Rat RBL-2H3 cell을 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)에서 분양 받았으며 5% CO 2 incubator (Forma-3110, forma scientific Inc., Ohio, USA)에서 37℃에 배양하였다. 그리고 RBL-2H3 세포를 열에 불활성화된 10% (v/v) fetal bovine serum(FBS), 100 units/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin, 2 mM glutamine 그리고 1 mM sodium pyruvate를 포함한 Dulbeco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 에 현탁 시켜 사용하였다 [10] .
- Anti-allergy activity 측정
혼합 추출물의 anti-allergy activity 효과는 이전에 Dearman의 연구를 바탕으로 RBL-2H3 세포로부터 β-hexosaminidase의 방출 억제 효과를 측정하였다 [10] . RBL-2H3 cell (2×10 5 cells/well)을 24 well plate에 접종하고, cell에 dinitrophenyl immunoglobulin E (DNP-IgE, 0.5 μg/ml)를 처리하여 5% CO 2 incubator에서 37℃에서 12시간 배양 하였다. 각 well의 세포들을 PIPES buffer (pH 7.2; 25 mM PIPES, 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 5.6 mM glucose, 0.4 mM MgCl2, 0.1% BSA and 1 mM CaCl 2 )로 DNP-IgE를 제거하기 위해 2회 수세하였다. 그런 후 각 well에 PIPES buffer 500 μl와 각 추출물 10 μl씩 로딩 후 5% CO 2 incubator에서 37℃로 60분간 반응시켰다. 이 때 각 추출물은 PIPES buffer로 20배 희석한 것을 사용하였다. 또 각 well에 degranulation 시키기 위해 10 mg/ml의 human dinitrophenyl serum albumin (DNP-HSA, A6661 Sigma, St. Louis, MO) 300 μl를 반응 시킨 후 1시간 20분 동안 37℃에서 배양하였다. 각 well의 상층액 50 μl를 96-well plate 에 옮겼고, 0.1 M sodium citrate buffer에 1 mM p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (N9376, Sigma,St.Louis)과 0.5% Triton X-100를 반응시킨 50 μl를 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 0.05 M sodium carbonate buffer (pH 10.0; 0.05 M Na 2 CO 3 /0.05 M NaHCO 3 ) 250 μl를 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 410 nm에서 흡광도를 측정 하여 β-hexosaminidase 방출량을 나타내었다. Degranulation(%)는 총 β-hexosaminidase activity 에 대한 방출된 β -hexosaminidase의 비율로 계산하였다.
- 사용 균주 및 배지
미생물은 한국미생물보존센터(KCCM, Seoul, South-Korea)에서 총 4개의 미생물을 분양 받았다. 그람양성균인 Stapylococcus aureus (KCCM 40881), Stapylococcus epidermidis (KCCM 35494)과 그람음성균인 Escherichia coli (KCCM 11234), Pseudomonas aeruginosa (KCCM 11328)이다. 각 미생물들의 배지는 Tripticase Soy Broth/Trapticase Soy Agar (TSB/TSA, Difco, USA)에서 배양하였고, anti-microbial activity은 Mueller Hinton Agar (MHA, Difco, USA)에서 측정하였다.
- Anti-microbial activity 측정
anti-microbial activity 검색을 위하여 well diffusion method법 [19] 을 변형하여 실험하였다. 각 균주를 TSB 배지에서 2회 계대 배양하여 사용하였으며 균의 활성은 UV spectrophotometer (Optizen POP, Mecasys co., Daejeon, Ltd, Korea)를 이용하여 650 nm에서 optical density (O.D) 값 0.4가 되게 맞춘 후 사용하였다. MHA 배지에 soft agar (0.8% agar)를 이용하였고, pour-plate 방법에 따라 배지가 분주 된 배양 접시에 균일하게 섞은 후 실온에서 응고 시켜 pasteur pipette을 이용하여 직경 6 mm의 well을 만들어 각각의 well에 추출물 70 μl과 negative control로 ether (99%, Junsei, Japan)을 주입하였다. 그런 후, 37℃에서 24시간 배양하면서 저해환의 생성 유무 및 직경의 크기를 확인 하였다. 각 추출물 350 ml에 99% ether를 사용하여 분액 깔때기로 3번 추출한 후 감압농축을 하여 3 ml로 정용한 후 사용하였다.
- 통계 분석
모든 설계점에서 랜덤으로 3반복 실시하였고, Degranulation와 anti-microbial activity 값의 통계 처리는 MINITAB 17 (Minitab Inc., State College, PA, USA)을 이용하여 mean±standard deviation (n=3)으로 나타내었다. Degranulation은 평균 값을 바탕으로 혼합물 설계와의 관계를 회귀분석을 하였고, 최적 혼합 설계점을 구축하였다.
결과 및 고찰
- Anti-allergy activity
혼합비율에 따른 각 추출물을 20배 희석하여 RBL-2H3 cell에 대한 anti-allergy activity 실험의 결과는 다음 Table 2 와 같다. Table 2 에 나타낸 값은 control 값인 16.77에서 각 추출물의 β-hexosaminidase 값(%)을 뺀 값을 바탕으로 혼합물 설계와의 관계를 분석하였다. Response surface와 trace plot ( Fig. 2 - 3 )를 보면 머위가 가장 큰 영향을 주었고, 수세미는 다소 약한 영향을 미친다는 양상을 알 수 있다. 다중회귀분석의 결과는 Table 3 에 나타내었는데 degranulation의 저해에 대한 상관계수 값은 82.10%이며, 전체 회귀분석의 결과는 p값 0.030( p <0.05)으로 유의성이 있다고 할 수 있다. 뿐만 아니라 1차회귀방정식에서는 p값이 0.009( p <0.05), 2차회귀방정식에서는 0.013( p <0.05) 으로 유의성 있는 것으로 나타났다. 그 모델식은 다음과 같다; Y=14.98A-14.63B+1,03C+23.22AB-0.76AC+74.12BC.
Inhibition effect of the mixtures on degranulation
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1A: Petasites japonicus B:Luffa cylindrica C: Houttuynia cordata. 2Inhibition effects are expressed as the remained number from that control value (16.77) minus β-hexosaminidase release rate (%).
Regression analysis of the inhibition effect on degranulation
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A : Petasites japonicus, B : Luffa cylindrical, C : Houttuynia cordata
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Response surface on the inhibition effect on degranulation.
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Contour map of the inhibition effect on degranulation.
최종적으로 최적의 혼합 설계점은 머위 0.75%, 수세미 0.14 %, 어성초 0.11% 의 비율이라는 것을 알 수 있었다( Fig. 4 - 5 ). 또한, 혼합 설계점의 대부분에서 anti-allergy activity 효과가 우수한 결과를 보이므로 알레르기성 호흡기계 질환에 대한 효과도 좋을 것으로 전망된다. 이전 연구에서 머위는 RBL- 2H3 cell에 대한 degranulation의 저해 활성 뿐만 아니라 염증물질인 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 와 Cyclooxygenase 2 (COX-2)을 저해하는 항염 활성도 좋다는 결과가 있었으며 [16 , 19] , 어성초 또한 degranulation의 저해 효과와 NF-κB의 항원 유도 활성화와 Reactive Oxygen Species (ROS)의 생산을 억제한다는 결과가 보고된 바 있다 [13] .
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Trace plot of the inhibition effect on degranulation.
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The optimal ratio of mixture design.
- Anti-microbial activity
Anti-microbial activity의 결과는 Table 4 와 같다. 전반적으로 모든 추출물에서 큰 차이를 보이진 않지만 대체적으로 모든 추출물은 negative control인 ether과 비교하여 그람양성균인 S. aureus S. epidermidis 에서 anti-microbial activity이 유효한 것으로 나타났다. S. aureus 는 No. 9 추출물에서 12.67 mm로 가장 크게 저해환이 나타났으며 그 다음 No. 1 추출물에서 12.00 mm, No. 11 추출물 11.33 mm의 순으로 활성이 작게 나타났다. S. epidermidis 는 No. 11 추출물에서 15.00 mm로 가장 큰 저해환이 나타났고 No. 8 추출물과 No. 9 추출물에서 12.33 mm로 비슷한 활성을 나타냈다. 반면에 그람음성균인 E.coli P. aeruginosa 에서는 No. 9 추출물에서 E .coli 는 10.00 mm와 P. aeruginosa 는 13.33 mm로 가장 뚜렷했으며 다른 추출물에서는 미미한 결과가 나타났다. 따라서 anti-microbial activity이 전체적으로 뚜렷하게 나타난 추출물은 No. 9이며, 각각 균에 대해 최대 활성을 나타내는 추출물은 다르지만 전반적으로 머위의 함유가 많이 되어 있는 추출물에서 anti-microbial activity이 강한 것으로 알 수 있다( Fig. 6 ). 비염, 천식 등 호흡계 질환은 중국의 황사 문제 뿐만 아니라 현대사회에서 대기오염과 관련하여 환경성 질환이 문제시되고 있으며 특히 소아·청소년기 유병률이 뚜렷이 증가되고 있다 [1 , 15] , 특히 Nenad Pandak et al의 연구에서 만성비염, 축농증 등의 환자들의 부비강에 대부분 Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus aureus , Klebsiella spp. 그리고 Streptococci 등의 병원성 미생물을 발견한 것으로 보고 [20] 하였다. 따라서 머위, 수세미 그리고 어성초의 혼합 추출물이 호흡기계 질환에 관련된 anti-allergy activity와 anti-microbial activity에 대한 효과 있는 것으로 보아 향후 고부가가치 기능성 음료의 개발 가치가 있는 것으로 사료된다.
Anti-microbial activity on the mixtures (unit=mm)
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Anti-microbial activity on the mixtures (unit=mm)
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Anti-microbial activity of extract No.9 (S. aureus, S. epidermidis, E. coli, P. aeruginosa).
Acknowledgements
본 연구는 농림수산식품부의 농림수산식품개발사업의 연구비로 수행되었음에 감사드립니다.
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