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Histological Changes in Reproductive Organs of Pubescent Male Mice in Response to ICI 182, 780 Treatment and Recovery of the Organs with Time
Histological Changes in Reproductive Organs of Pubescent Male Mice in Response to ICI 182, 780 Treatment and Recovery of the Organs with Time
Journal of Life Science. 2015. Dec, 25(12): 1415-1424
Copyright © 2015, Korean Society of Life Science
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
  • Received : July 31, 2015
  • Accepted : September 21, 2015
  • Published : December 30, 2015
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윤정 모
하야나 최
영국 조
미숙 박
현욱 조
hwcho@sunchon.ac.kr

Abstract
본 실험에서는 ICI 182, 780(ICI)을 사춘기의 생쥐에 투여하여 에스트로겐 수용체를 저해시켰을 때 수컷 생식계에 나타나는 변화를 관찰하였다. 더불어 해당 조직학적 변화가 시간이 지남에 따라 자연적으로 회복되는지 여부를 알아보기 위해 150일, 300일동안 회복시키는 실험군을 추가로 설정하여 관찰하였다. 그 결과, 가장 처음 희생한 실험군에서는 ICI의 투여에 따른 형태적 변화가 관찰되었다. 정소에서는 세정관과 생식상피의 위축이 관찰되었다. 더불어 세정관의 단면에서 측정한 세르톨리 세포의 개수가 줄어드는 것이 관찰되었다. 부정소의 initial segment(IS) 부분과 꼬리 부위의 상피세포 높이 또한 변화하였다. IS 부분은 상피세포의 평균 높이가 증가하였고, 꼬리 부위는 상피세포의 평균 높이가 감소하였다. 투여군 수출소관의 경우, 상피세포의 평균 높이가 감소하였고, 내강의 직경이 증가되었다. 투여군 전립샘과 정낭의 경우, 상피세포의 평균 높이가 증가하였다. 정낭의 경우 상피세포의 높이 외에는 특별한 형태적 변화가 나타나지 않았으나, 전립샘의 경우 상피세포의 자유표면 쪽이 반듯한 선을 그리지 않고 흐트러진 형태를 보였다. 앞의 조직학적 변화는 150일간 회복기간을 둔 경우에 투여군이 대조군과 비슷한 수준으로 회복되었다. 150일째 희생시킨 그룹에서 회복되지 않은 조직학적 차이도 있었으나, 이는 300일째 희생시킨 그룹에서는 회복되는 것이 관찰되었다. 이 들 결과를 종합해 보면 ICI 투여는 사춘기 수컷의 생식기관에 조직학적 변화를 유발하였으나, 그 변화는 시간이 지남에 따라 자연스럽게 회복되었다.
Keywords
서 론
암컷호르몬으로 알려져 있는 에스트로겐은 암컷뿐만 아니라 수컷 내에서도 분비된다는 사실은 이미 1930년대에 밝혀져 있었다 [24] .에스트로겐이 수컷 생식계에서도 발달, 분화, 성장에 관여하는 중요한 조절인자로 작용한다는 것이 이제 연구를 통해 널리 알려져 있으며 [4] , 지금에 와서는 수컷 생식계에서 중요한 역할을 한다는 것이 많은 연구자들의 도움으로 밝혀져 있다 [5 , 12 , 16 , 23] .
더불어 단순히 리간드인 에스트로겐의 유무에 따라 수용체의 활동이 결정되는 것이 아니며, 에스트로겐 수용체의 리간드 매개, 혹은 비매개성 신호가 수컷 생식계에 미치는 기여도가 다르다는 사실 또한 실험을 통해 증명되었다 [19] . 수컷 생식계에서, 에스트로겐은 테스토스테론에서 P450 아로마타제(aromatase)와 같은 효소에 의해 에스트로겐으로 전환되는데 주로 P450 아로마타제 효소를 지니고 있는 세르톨리 세포(Sertoli cell), 라이디히 세포(Leydig cell), 그리고 생식 세포(germinal cell)에서 합성이 된다 [18] . 생쥐의 경우 에스트로겐을 합성하는 P450 아로마타제 효소가 라이디히 세포, 생식 세포, 정자 세포에 존재한다. 특이한 것은 정자 세포에 아로마타제 효소가 있다는 것이다. 부정소 머리 부위에 위치한 정자세포의 경우, 정자 두부의 바로 아래 쪽에 있는 세포질에 효소가 위치한다. 부정소의 꼬리 부위로 갈수록 정자에서 효소가 위치한 작은 세포질 방울은 점점 정자의 꼬리 쪽으로 내려가며 크기도 작아진다. 정자에서 합성되는 에스트로겐이 부정소 머리의 조절 작용과 중요한 연관 관계가 있다는 것을 추정할 수 있다 [7] . 수컷의 생식계에서는 아로마타제 효소뿐 아니라, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)도 관찰된다. 에스트로겐 수용체는 α와 β 두 가지 종류(ERα와 ERβ)가 존재한다. 최근 들어서는 ERα를 ESR1, ERβ를 ESR2라고 표기하기도 한다. 대부분의 생물 종의 수컷 생식계인 정소, 부정소, 수출소관에서 에스트로겐 수용체가 발현된다. 수컷 생식계 중에서도 특히 수출소관은 에스트로겐 수용체의 발현율이 가장 높으며 [22] , 에스트로겐의 주요 작용 표적 기관이다. 부속생식샘 또한 마찬가지로 에스트로겐 수용체의 존재가 확인되었다 [21] .
체내에서 에스트로겐에 대한 생물학적인 반응은 특별히 높은 친화력을 갖는 에스트로겐 수용체가 발현되는 세포에서만 일어난다 [11] . 즉 에스트로겐 수용체가 존재한다는 사실 그 자체도 수컷의 생식계에 에스트로겐이 영향을 미친다는 것이다. 더불어 에스트로겐 수용체의 양은 조직마다 일정한 것이 아니라 에스트로겐 양에 따라서 늘어나거나 줄어들게 되며, 조직내의 에스트로겐 수용체 발현율의 차이가 에스트로겐에 대한 반응성을 나타낸다고 하였다 [20] . 에스트로겐이 체내에서 어떤 역할을 하는 지 규명하기 위한 방법은 여러 가지가 있는데, 대표적으로 수용체의 작용을 방해하는 저해제를 투여하거나, 유전적으로 수용체가 결핍된 생쥐를 사용한다. 본 실험에 사용한 시약 ICI 182, 780 (ICI)는 ‘풀베스트란트(fulvestrant)’라고도 부르는 에스트로겐 수용체 저해제이다. 본래 진행성 유방암 치료제인 파슬로덱스의 성분으로서, 치료제로도 사용되지만 몇몇 포유류 종에서는 에스트로겐 수용체 녹아웃 효과를 이끌어내는 데 사용되기도 한다 [15] . ICI는 경쟁적 저해제로 에스트로겐이 수용체에 결합하는 것을 방해한다고 알려져 있으며, 이 외에도 에스트로겐 수용체 알파의 발현을 저해하는 효과가 있다. 그러나 경쟁적 저해제로서의 자세한 기작은 알려져 있지 않다.
본 실험은 ICI를 투여하여 사춘기의 에스트로겐 수용체를 차단시켰을 때 수컷 생식계에 나타나는 변화를 관찰하였다. 더불어, ICI의 에스트로겐 차단 효과로 나타난 조직학적인 변화가 시간이 지남에 따라 자연적으로 회복되는지 여부를 알아보기 위해, 아무런 처리를 하지 않고 150일 동안 회복시키는 실험군과, 300일 동안 회복시키는 실험군을 설정하여 광학현미경으로 생식기관 조직변화를 관찰하였다.
재료 및 방법
- 실험 동물 및 ICI 투여
실험동물은 4주령 된 수컷 생쥐 C57BL/6(㈜오리엔트 바이오)를 구입하여 1주일간 사육실 환경에 적응시켜 사용하였기 때문에 5주령 된 생쥐를 사용한 셈이다. 생쥐의 사춘기 구분은 기존의 보고 [2] 에 따랐는데, 생후 35일째를 이른 사춘기, 45일째를 중간 사춘기, 55일째를 늦은 사춘기로 하였다. 생후 35일째에 수컷 생쥐를 무작위로 대조군과 ICI 투여군으로 분류하고, ICI 투여군의 경우, ICI ((7a,17b)-7-[9-[(4,4,5,5,5pentafluoropentyl)sulfinyl]nonyl]estra-1,3,5(10)-triene-3,17-diol, Sigma-Aldrich) 5 mg을 castor oil 0.1 ml에 vortex로 희석하여 일주일에 한 번씩 총 4주간 등쪽 목덜미에 피하주사 하였다. 대조군 생쥐에는 castor oil 0.1 ml만 피하주사 하였다. 처음 투여할 때 생쥐의 평균 체중은 13g 이었으며, 실험기간 동안 고형사료와 증류수를 무제한으로 공급하였다. 사육실 환경은 22±2℃와 상대습도 50±5%를 유지하였으며, 조명은 12L: 12D를 주기로 하였다. 본 실험은 순천대학교 동물실험윤리위원회의 승인(SCNU IACUC-2013-14)을 받은 후에 실시하였다.
- 관류희생
대조군과 투여군의 생쥐는 4주간 4회의 투여 후 다시 무작위로 세 그룹으로 분류하였다. 첫 번째 그룹은 투여 종료 12일 후에, 두 번째 그룹은 투여 종료 150일 후에, 세 번째 그룹은 투여 종료 300일 후에 관류시켜 희생하였다. 첫 번째 그룹은 대조군 4마리, ICI 투여군 4마리로 총 8마리를 관류희생 하였다. 두 번째와 세 번째 그룹도 처음과 마찬가지로 대조군과 ICI 투여군, 각각 4마리씩 관류희생 하였다. 관류 실험 순서는 먼저 생쥐 한 마리마다 100 unit의 헤파린(heparin) 0.1 ml을 복강 투여한 후, sodium pentobarbital을 복강 투여하여 마취시켰다. 마취시킨 생쥐의 체중을 측정한 후에, 혈액을 제거하기 위해 링거액을 생쥐의 좌심실에 관류용 바늘을 찔러 넣어 peristaltic pump로 2분간 관류시켰다. 관류되는 동안에 정소, 부정소의 생식기관을 수월하게 적출하기 위해 음낭에서 생식기관을 핀셋으로 들어 내어 노출시켜 두었다. 그 후 0.1M cacodylate buffer (pH 7.4)에 용해한 4% glutaraldehyde 용액으로 치환하여 20분간 관류시켰다.
- 조직 처리
관류희생이 끝난 후 노출시켜 둔 정소와 부정소 및 수출소관을 적출하였다. 본 실험에서는 수컷의 부속 생식기관인 전립샘과 정낭도 적출하였다. 전립샘은 동물에 따라 형태가 다양하며, 생쥐의 경우 3개의 엽으로 구성되어 있다. 본 실험에서는 복부 전립샘만 적출하여 사용하였다. 이들 생식기관 조직을 절편으로 만들기 위해, 0.1M phosphate buffer (pH 7.4)로 4시간(3회), 12시간(1회) 간격으로 총 4회간 수세하였다. 그 후 vacuum을 이용하여 4℃의 ethanol에서 1시간 간격으로 탈수 과정을 거쳤다. 탈수 과정은 농도를 70%(2회), 80%(1회), 95%(2회), 100%(3회) 순서로 올려가며 진행하였다. 마지막으로, 역시 똑 같은 방식으로 vacuum을 이용하여 4℃의 infiltration solution에 24시간 동안 3회의 침투 과정을 거쳤다. 그 후 처리가 완료된 조직을 플라스틱 몰드에 넣어 JB-4로 포매하였다.
- 염색
완성 된 조직은 microtome을 이용하여 2.5 μm 두께의 절편으로 만들었다. 조직을 관찰하기 위해 PAS & hematoxylin 이중 염색을 하였다. 염색은 coplin jar를 사용하여 슬라이드를 증류수에 10분, periodic acid에 15분, 증류수에 10분, Schiff 용액에 45분, sulfurous acid에 5분씩 3회, 흐르는 증류수에 20분, hematoxylin에 35분, 마지막으로 흐르는 증류수에 10분 두었다가 꺼낸 후 35℃ slide warmer에서 건조시켰다. 염색이 완료된 슬라이드는 permount로 봉입하여 영구 프레파라트를 완성하였다.
- 사진촬영 및 분석
광학 현미경에 부착된 SPOT camera (Model N0. 11. 2 Color Mosaic, Diagnostic Instruments Inc.)를 이용하여 조직을 관찰, 촬영한 다음 Video Test Image Analysis System을 이용하여 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 정소의 경우, 세정관 직경의 변화 여부를 알아보기 위해, 한 마리당 30개의 사진 샘플을 선정하여 주로 stage VII 또는 VIII상태에 있는 세정관의 단경을 측정하였다. 더불어 세르톨리 세포 개수의 변화 여부를 알아보기 위해, 한 마리당 각각 무작위로 10개 세정관을 선정하여 그 세정관 단면에 있는 세르톨리 세포 개수를 측정하고 평균값을 구하였다.
부정소의 경우, 머리 부위인 initial segment (IS)와 꼬리 부위의 상피세포 높이의 변화 여부를 알아보기 위해, 부위당 각각 무작위로 사진 샘플을 선정하여 30개의 상피세포 기저막에서 자유표면까지 높이를 측정하였다. 수출소관의 경우, 상피세포 높이의 변화 여부를 알아보기 위해, 한 마리당 각각 무작위로 사진 샘플을 선정하여 30개의 비섬모세포(nonciliated cell)의 기저막 에서 솔가장자리(brush border)까지 높이를 측정하였다.
전립샘과 정낭의 경우, 분비물이 들어 있는 전립샘과 정낭샘의 내강을 둘러싸는 상피세포 높이의 변화 여부를 알아보기 위해, 한 마리당 각각 무작위로 사진 샘플을 선정하여 30개의 상피세포 기저막에서 자유표면까지 높이를 측정하였다. 실험결과의 통계학적 분석은 ANOVA Test 를 이용하여 p value 0.05 미만을 의미 있는 것으로 판별하였다.
결 과
- 정소
ICI투여에 따른 정소의 세정관 직경 변화와, 세정관 내 바닥에 위치하고 있는 세르톨리 세포의 수를 표로 나타내었다( Table 1 ). 대조군의 경우, 12일째 희생시킨 세정관 직경이188.9 μm, 150일째 직경은 203.8 μm로 증가되었다가 300일째 직경은 194.9 μm로 감소하는 경향을 나타내었다( Fig. 1 ). ICI 투여에 의한 정소의 조직학적 변화를 볼 수 있는 투여 후 12일째에 희생시킨 경우, 투여군의 세정관 직경이(179.7 μm) 대조군(188.9 μm)에 비해 유의하게 감소되었다. 투여군 15일째와 300일째의 경우 세정관 직경이 대조군에 비해 유의한 차이를 나타내지 않았다. 세정관 내 다양한 세포로 구성되어 있는 생식상피의 두께도 12일과 150일째 희생시킨 그룹에서는 대조군과 투여군에서 각각 유의한 차이가 있었으나 300일째에는 차이가 나타나지 않았다. 대조군의 정소 단면에서, 1개의 세정관 내 바닥에 위치하고 있는 평균 세르톨리 세포 수는 12일째, 150일째, 300일째에 각각 10.0, 10.3, 10.2로 나타나 거의 변화가 없었다( Table 1 ). 12일째 투여군의 경우, 세르톨리 세포 수는 7.8개로 나타나 대조군에 비해 유의하게 감소되어 나타났으며 300일째는 10.3개로 나타나 대조군과 유의한 차이가 없었다( Fig. 2 ).
Short diameter of seminiferous tubule, germinal epithelium thickness and the number of Sertoli cells from control and ICI treated groups
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Values represent means±SD*p<0.05 compared with control group.
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Photomicrographs of seminiferous tubules in testis from control (A-C) and ICI treated groups (D-F) of 12, 150 and 300 days post treatment. Double arrows indicate the short diameter of seminiferous tubules. The diameter of seminiferous tubule was decreased in treated group of 12 days post treatment. Bars size = 100 μm.
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Photomicrographs of Sertoli cells in testis from control (A), and ICI treated groups (B) of 12 days post treatment. Arrow heads indicate the Sertoli cells. Bars size = 20 μm.
- 부정소
ICI 투여에 따른 부정소의 부위별 상피세포 높이 변화를 표로 나타내었다( Table 2 ). 부정소와 수출소관이 연결되는 부위인 IS의 상피세포 높이는 투여 후 12일째 희생시킨 그룹의 투여군(63.0 μm )에서 대조군(57.3 μm )에 비해 유의한 수준으로 증가하였다( Fig. 3 ). 150일째 희생시킨 경우, 투여군(72.5 μm)상피세포 높이가 대조군(72.1 μm)과 거의 유사하게 나타났다. 300일째 희생시킨 그룹에서도 대조군과 비교해서 유의한 차이는 나타나지 않았다. 반대로, 정자가 운동성을 완전히 획득하여 머무르는 부위인 부정소 꼬리의 상피세포 높이는 12일째 희생시킨 생쥐의 투여군이(13.0 μm) 대조군에(15.3 μm) 비해 유의한 수준으로 감소하였다. 그러나 150일째와 300일째 희생시킨 생쥐에서는 데조군과 투여군의 유의한 차이를 볼 수 없었다.
Epithelial cell height of IS (initial segment) and cauda in epidydimis of control and ICI treated groups
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Values represent means±SD *p<0.05 compared with control group.
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Photomicrographs of initial segment in epididymis from control (A-C) and ICI treated groups (D-F) of 12, 150 and 300 days post treatment. Straight lines indicate the epithelial cell height. Bars size = 50 μm.
더불어 부정소 몸통 부분의 상피세포에서 발견되는 투명세포(clear cell)의 세포질 내에 있는PAS-양성 과립이, 투여 후 12일째 희생시킨 그룹의 투여군에서 대조군보다 많이 축적되는 것이 관찰되었다( Fig. 4 ).
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Photomicrographs of corpus area in epididymis from control (A-C) and ICI treated groups (D-F) of 12, 150 and 300 days post treatment. Arrow heads indicate the PAS positive granules (arrow heads) in clear cell of corpus epididymis. The density of granules in epithelial cell has increased in treated group of 12 days post treatment. Bars size = 20 μm.
- 수출소관
ICI 투여에 따른 수출소관의 상피세포 높이 변화를 표로 나타내었다( Table 3 ). 수출소관의 상피세포 높이는 투여 후 12일째 희생시킨 그룹의 투여군이 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 이 차이는 150일째 희생시킨 그룹에서 대조군과 거의 같은 수준으로 회복되었으며, 300일째 희생시킨 그룹에서도 대조군과 비교해서 유의한 차이는 나타나지 않았다( Fig. 5 ). 12일째 희생시킨 경우, 대조군 수출소관의 내강 직경36.9 μm에 비해 투여군의 내강 직경은 72.3 μm로 나타나 뚜렷하게 확대 되었다( Fig. 6 ). 이러한 차이는 300일째에 이르러 대조군과 투여군의 내강 직경 차이가 나타나지 않았다. 12일째 투여군 상피세포의 세포질 내 PAS염색에 양성을 나타내는 과립의 수가 대조군에 비해 현저히 감소하였으며, 300일째 투여군에서는 대조군과 유사한 밀도로 PAS염색의 양성 과립 수가 나타났다( Fig. 5 ).
Epithelial cell height and luminal diameter of efferent ductule from control and ICI treated groups
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Values represent means±SD *p<0.05 compared with control group.
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Photomicrographs of efferent ductule from control (A-C) and ICI treated groups (D-F) of 12, 150 and 300 days post treatment. Straight lines indicate the epithelial cell height of efferent ductule. Epithelial cell heights and PAS positive granules of efferent ductule were decreased in treated group of 12 days post treatment. Bars size = 20 μm.
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Photomicrographs of efferent ductule from control (A-C) and ICI treated groups (D-F) of 12, 150 and 300 days post treatment. Double arrows indicate the luminal diameter of efferent ductule. Luminal diameter of efferent ductule was increased in treated group of 12 days post treatment. Bars size = 50 μm.
- 전립샘
ICI 투여에 따른 전립샘의 상피세포 높이 변화를 표로 나타내었다( Table 4 ). 투여 후 12일째 희생시킨 그룹의 대조군에서 전형적인 분비샘의 구조를 잘 관찰할 수 있었다. 상피세포로 만들어진 엽에 분비물로 가득 채워져 있는 형태를 보이며, 반듯한 단층의 원주상피세포를 잘 관찰할 수 있었다. 그러나 투여군의 경우, 원주상피의 단층 구조가 뚜렷하지 않고, 서로 구불구불하게 겹쳐진 양상이 관찰되었다( Fig. 7 ).
Epithelial cell height of ventral prostate and seminal vesicle from control and ICI treated groups
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Values represent means±SD *p<0.05 compared with control group.
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Photomicrographs of ventral prostate from control (A-C) and ICI treated groups (D-F) of 12, 150 and 300 days post treatment. Structure of simple columnar epithelial cell of ventral prostate was rumpled in treated group of 12 days post treatment. Straight lines indicate the epithelial cell height of ventral prostate. Lu; Lumen. Bars size = 50 μm.
전립샘 상피세포 높이는 투여 후 12일째 희생시킨 그룹의 투여군이 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. 이 증가한 경향은 150일째 희생시킨 그룹에서 대조군과 거의 같은 수준으로 회복되었고, 300일째 희생시킨 그룹에서는 다시 첫 번째 그룹과 동일하게 투여군이 대조군에 비해 유의하게 증가하는 양상을 보였다.
- 정낭
ICI 투여에 따른 정낭의 상피세포 높이 변화를 표로 나타내었다( Table 4 ). 비교적 뚜렷하게 구조적인 변화가 관찰되었던 전립샘의 경우와는 다르게, 정낭에서 큰 조직학적 변화는 나타나지 않았다( Fig. 8 ).
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Photomicrographs of seminal vesicle from control (A-C) and ICI treated groups (D-F) of 12, 150 and 300 days post treatment. Straight lines indicate the epithelial cell height of seminal vesicle. Lu; Lumen. Bars size = 50 μm.
정낭의 상피세포 높이는 투여 후 12일째 희생시킨 그룹의 투여군이 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. 150일째 희생시킨 그룹에서는 대조군과 투여군이 유의한 차이가 없는 수준으로 되었고, 300일째 희생시킨 그룹에서는 12일째 희생시킨 그룹과는 반대로 대조군이 투여군에 비해 유의하게 증가하였다.
고 찰
본 실험에서는 사춘기의 수컷 생쥐에 에스트로겐 수용체 저해제인 ICI를 투여하여 생식기관의 조직학적인 변화를 관찰하였으며, 또한 해당 변화가 시간에 따라 회복되는지의 여부를 관찰하였다. 실험을 세 번에 걸쳐 진행하였으므로, ICI 투여가 끝난 후 가장 처음 희생한 12일째 그룹, 두 번째로 150일째 희생시킨 그룹, 세 번째로 300일째에 희생시킨 그룹 등, 총 3그룹으로 구분하여 관찰하였다.
정소의 경우, 대조군에서 세정관 직경이 12일째 희생시킨 그룹(사춘기에 해당)보다 150일째 희생시킨 그룹에서 증가하였다가 300일째 희생시킨 그룹에서는 다시 약간 감소하였다. 이는 150일째의 경우, 완전히 성숙한 정소를 대상으로 한 결과로 보이며, 300일째는 고령화로 인해 세정관 직경이 감소된 것으로 보인다. 이런 현상은 부정소 IS부위와 부정소 꼬리 부위에 있는 상피세포 높이에서도 나타났다. 또한 수출소관과 복부 전립샘샘의 상피세포 높이에서도 이런 양상을 볼 수 있었다.
12일째 ICI투여군에서 세정관이 유의한 수준으로 위축하였는데 이는 에스트로겐 수용체 α 녹아웃 생쥐(Estrogen receptor alpha knockout mouse, αERKO)에서 보이는 것과 비슷한 결과이다. 다만 본 실험에서는 어느 정도 나이가 든 αERKO 생쥐에서처럼 세정관 내 정조세포, 정모세포 및 정자세포 등으로 이루어져 있는 생식상피 두께가 극단적으로 얇아지는 변화는 보이지 않았으며, 비교적 어린 αERKO 생쥐와 비슷한 양상이 관찰되었다 [8] . 이것은 수용체가 저해 된 기간이 한달 정도의 비교적 짧은 기간이었기 때문으로 보인다. 더불어 세르톨리 세포의 개수 또한 유의한 수준으로 줄어들었다. 에스트로겐은 세르톨리 세포의 증식, 발달, 기능 등을 제어하는 역할을 하는 것으로 추정하고 있다 [12] . 에스트라디올을 세르톨리 세포에 처리했을 때, 세르톨리 세포의 증식을 일으킨다. 이는 아마 에스트로겐에 의존하는 어떤 경로가 세르톨리 세포내에서 활성화되어 증식을 일으킨 것으로 보인다 [10] . 더불어 이 과정은 에스트로겐이 단독으로 일으키는 것이 아니며, 에스트로겐 수용체와 연계하여 일어난다 [9] . 생후 15일된 흰쥐에서 얻은 세르톨리 세포를 배양하여 G protein-coupled estrogen receptor 1 (GPER) 의 유전자 발현을 RT-PCR 과 면역분석을 이용하여 확인한 결과에 의하면 [9] , 에스트로겐 수용체와 GPER 은 다른 종류의 하향신호 회로(downstream signaling pathway), 예를 들면 mitogen-activated protein kinase3/1(MAPK3/1)와 같은 회로를 통해 빠르게 신호를 매개할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이런 MAPK3/1의 경우, 세르톨리 세포에 에스트로겐 수용체 저해제인 ICI를 투여하고 10분 동안 배양을 하면 MAPK3/1의 인산화 상태가 10-18배 정도로 빠르게 증가되었다고 하였다. 이를 통해 에스트로겐 수용체와 GPER 이 Sertoli cell의 기능, 그리고 정상적인 정소 발생과 항상성 유지에 중요한 작용을 매개하는 것을 밝혔다. 본 실험의 경우 ICI 투여 후 12일째에 희생시킨 그룹에서는 세르톨리 세포의 수가 유의하게 감소하였는데 이는 ICI에 의해 GPER의 유전자 발현에 영향을 미쳤기 때문으로 보인다.
부정소 IS 부분의 경우, 상피세포의 평균 높이가 증가하였고, 꼬리 부분은 상피세포의 평균 높이가 감소하는 변화를 보였다. 그러나 부정소에서의 세포 높이가 변화하는 수준은 바로 인접한 수출소관에 비해 크지 않았다. 부정소의 IS 역시 수출소관과 유사하게 물의 통로 역할을 하는 아쿠아포린 단백질 패밀리 AQP9 (aquaporin 9)이 존재하지만, 수출소관과는 다르게 ICI를 처리한다 해도 발현이 감소한다거나 하는 반응이 나타나지 않는다 [13] . 이 사실은 본 실험에서, 수출소관의 변화가 컸음에도 IS 쪽에서는 그에 준하는 변화가 나타나지 않은 이유를 설명해 주는 근거로 볼 수 있다. 그리고 투여군의 경우, 부정소 몸통 부위에 있는 투명세포의 세포질 내 PAS양성 염색의 과립 수가 대조군에 비해 증가하였는데, 이런 과립의 변화에 미치는 ICI 영향은 추후 더 논의를 통해 밝혀져야 할 것으로 생각된다.
수출소관의 경우, 먼저 가장 처음 희생한 투여 후 12일째 희생시킨 그룹에서는 투여에 따른 형태적 변화가 관찰되었다. 에스트로겐 수용체 녹아웃 생쥐를 이용한 실험에서, 본 실험과 비슷하게 수출소관의 내강이 넓어지고 세정관의 직경, 생식상피가 얇아지는 등 거의 동일한 형태적 변화를 관찰할 수 있었다 [8] . 즉 ICI가 에스트로겐 수용체 α 녹아웃 효과를 불러와 실험 대상조직의 형태가 변화하였다고 할 수 있다. 수출소관에서는 눈에 띄는 형태적 변화와, 수치적 변화가 모두 나타났다. 수출소관은 정소와 부정소를 잇는 일종의 통로로, 여분의 정소액을 재흡수하는 곳이다. 먼저 수출소관은 ICI를 투여하면 에스트로겐에 감수성이 높은 유전자들의 발현 양상이 달라진다 [4] . 더불어 상피세포의 평균 높이가 확연히 감소하며, 내강이 눈에 띄게 넓어지고 섬모도 줄어든다 [6] . 에스트로겐 매개, 비매개성 신호가 수출소관에 미치는 기여도에 관한 보고 [19] 에 따르면, 수출소관은 에스트로겐 비의존적인 신호의 조절을 크게 받는 것으로 나타났다. 즉 에스트로겐 의존적인 수용체의 신호를 차단해도 수출소관에는 큰 조직학적 이상이 발견되지 않았다. 본 실험에서 ICI를 처리했을 때는 수출소관에 조직학적으로 변화가 나타났다. 둘을 종합해 보면 ICI 투여는 리간드 비의존적 신호를 차단시킨 것 내지는 그와 유사한 효과를 이끌어 낸 것으로 보인다. 본래 ICI는 순수한 항에스트로겐으로서, 경쟁적 저해제로 작용하는 동시에 에스트로겐 수용체 알파의 발현을 저해한다는 사실이 연구를 통해 알려졌다. 그러나 에스트로겐 수용체 베타와 안드로겐 수용체의 발현에는 영향을 미치지 않는다 [14] . 따라서 수출소관에서는 에스트로겐 수용체 알파의 리간드(=에스트로겐) 비의존적 신호가 중요한 조절 축으로 작용한다고 볼 수 있다. ICI는 실제로 많은 단백질의 발현을 증가 혹은 감소시킨다 [6] . 특히 수출소관과 부정소에서, 전사량 혹은 발현량이 감소하는 단백질 중에는 재흡수 작용의 표지자 역할을 하는 Clusterin, Cathepsin D가 포함되어 있다. 더불어 ICI를 처리한 생쥐나 ERKO(estrogen receptor knockout)생쥐에서는 아쿠아포린9(AQP9) 단백질이 수출소관에서 발현이 감소한다 [13] . 수출소관이 여분의 정소액을 흡수해주는 역할을 맡고 있기 때문에, 아쿠아포린 단백질의 발현 감소는 곧 수출소관의 기능 저하로 이어진다고 볼 수 있다. 역시 ICI를 처리한 생쥐나 ERKO 생쥐에서는 AQP9 단백질뿐 아니라 NHE3 (Sodium hydrogen exchanger3) 단백질 또한 감소한다. NHE3 단백질을 녹아웃시킨 생쥐는 수출소관에서 내강의 팽창 등 ICI를 처리한 생쥐와 유사한 양상을 보인다 [23] . 이들 사실을 종합하면 ICI 처리로 인해 재흡수 작용에서 중요한 역할을 맡는 단백질의 발현이 감소하며, 여분의 정소액을 제대로 재흡수하지 못한 수출소관에서 내강의 팽창이 나타난 것으로 볼 수 있다.
더불어 대사 스트레스를 가한 세포에서는 액틴 미세골격이 파괴된다. 액틴 미세골격은 세포의 형태를 유지하는 것뿐 아니라 선택성 투과성 단백질 장벽을 생산하는 등 기능적인 면에서도 중요하다. 액틴 미세골격이 파괴되면 조직 내에 심출액이 고여 부어 오르는 부종이나, 혈관의 혈전증 등이 생긴다. 대사 스트레스를 가한 세포에 17β-에스트라디올을 처리한 경우에는, HSP27 (Heat shork protein 27)의 작용과 연계하여 미세골격의 파괴를 방지한다 [17] . 이는 수정체의 내피 세포에산화 스트레스를 가한 경우에도 마찬가지로 에스트로겐이 세포 미세골격의 파괴를 방지하였다 [3] . 에스트로겐 수용체 저해제인 ICI를 처리하였을 때 수출소관을 비롯한 각 조직 상피세포들의 높이가 변화한 것은 미세골격의 파괴와 관련된 현상으로 추정된다. 12일째 투여군 상피세포의 세포질 내에 있는 PAS염색에 대한 양성을 나타내는 과립의 수가 현저히 감소하였는데, 이 경우는 ICI에 의한 수출소관의 재흡수 기능 저하와 관련 있는 것 같다. 300일째 투여군에서는 대조군과 유사한 밀도로 회복되어 나타났다.
다음으로 전립샘과 정낭은 상피세포의 평균 높이가 증가하였다. 더불어 정낭의 경우 세포의 평균 높이가 증가한 것 외에는 특별한 형태적 변화가 관찰되지 않았다. 반면 전립샘은 세포의 양상이 변한 것이 관찰되었다. 대조군의 상피세포가 깨끗한 단층상피 형태를 하고 있는 것에 반해 투여군의 상피세포는 자유표면 쪽이 반듯한 선을 그리지 않고 흐트러진 형태를 보였다. 에스트로겐은 종마다 차이는 있으나 전립샘 상피에 이상성장을 일으킨다고 [16] 보고된 바 있다. 수컷 생쥐에 에스트로겐 수용체 촉진제인 PPT (propyl pyrazole triol)를 투여한 실험 결과에서 [1] , 전립샘 상피세포가 본 실험과 유사하게 형태가 흐트러지는 것을 관찰할 수 있으나 그 정도가 훨씬 심하였다. 즉 에스트로겐 자극을 과하게 주는 것 보다는 정도가 약하지만, 에스트로겐을 수용체를 저해하는 경우에도 전립샘에 영향을 미쳐 전립샘 상피세포에 변화를 일으킨 것으로 추정된다. 전립샘과는 다르게 정낭은 에스트로겐 수용체를 저해했음에도 큰 형태적 이상이 발견되지 않았다. 이는 전립샘과 정낭의 에스트로겐 수용체 대한 감수성이 다르기 때문인 것으로 보인다.
결론적으로 보면, 사춘기에 1주일에 한번씩 4주 동안 에스트로겐 수용체 저해제 ICI를 투여하고 곧바로 12일째 희생시킨 경우, 수출소관의 상피세포 높이 감소, 수출소관 내강 확대 등의 뚜렷한 조직학적 변화가 유발되었다. 그리고 아무런 처리를 하지 않고 150일과 300일의 회복기간을 둔 경우에는 투여군 상피세포 높이가 대조군과 유의한 차이가 없을 정도로 회복되었으며, 또한 확장되었던 수출소관 내강도 300일째에서는 대조군과 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 정소의 세정관 직경, 부정소 IS와 꼬리 부위의 상피세포 높이 변화 등도 300일째에는 대조군과 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 투여군 전립샘과 정낭의 샘 내강을 둘러싸는 상피세포 높이 변화는 수출소관의 상피세포 높이 변화에 비하여 적은 것으로 나타났다. 따라서 ICI에 의한 조직학적 변화는 수출소관에서 가장 크게 나타났으며, 300일이 지난 다음에는 그 변화가 소실되어 자연스럽게 회복되는 것으로 나타났다.
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