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Production of Red-spotted Grouper Nervous Necrosis Virus (RGNNV) Capsid Protein Using Saccharomyces cerevisiae Surface Display
Production of Red-spotted Grouper Nervous Necrosis Virus (RGNNV) Capsid Protein Using Saccharomyces cerevisiae Surface Display
Journal of Life Science. 2014. Sep, 24(9): 995-1000
Copyright © 2014, Korean Society of Life Science
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  • Received : July 15, 2014
  • Accepted : August 22, 2014
  • Published : September 30, 2014
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About the Authors
미례 박
승석 서
진익 황
동균 김
종범 박
영재 정
택견 이
tklee@kiost.ac

Abstract
바이러스 분리 및 검출 측면에서의 해양바이러스 연구는 높은 빈도의 돌연변이와 유전적 다양성 때문에 한계가 있어 왔다. 현재 해양바이러스를 검출하기 위해 사용되고 있는 방법 중 ELISA를 기반으로 하는 혈청학적 방법이 가장 보편적이다. 혈청학적 방법은 항체의 질과 고도로 정제된 정확한 항원을 요구한다. 최근에 바이러스 외피단백질을 항원으로 이용하고자하는 새로운 실험시스템이 yeast surface display (YSD)를 사용하여 개발되었다. 이 연구에서는 붉바리 신경괴사 바이러스(RGNNV)의 외피단백질 유전자를 YSD와 HA-tagging 시스템을 이용하여 발현시키고 정제하였다. 2개의 RGNNV 외피단백질 유전자 조각(RGNNV1 및 RGNNV2)을 염기서열 데이터베이스에 기초하여 합성하였고, 효모 발현 벡터인 pCTCON로 클로닝하였다. 효모 strain EBY100에서의 RGNNV 외피단백질의 발현은 발현벡터에 의해 코드되는 C-말단의 c-myc tags를 인지하는 형광표지된 항체를 이용하여 flow cytometry로 검출되었다. 발현된 RGNNV 외피단백질은 β-mercaptoethanol 처리 후 Aga1과 Aga2 사이의 이황화결합 절단에 의해 효모표면으로부터 분리되었다. Anti-HA 항체를 사용한 Western blots을 수행하였을 때 각 RGNNV 외피단백질이 정해진 크기에서 검출되는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 YSD와 HA-tagging 시스템이 재조합 RGNNV 외피단백질의 발현과 정제에 적용가능함을 나타낸다.
Keywords
서 론
바이러스성 신경괴사(Viral nervous necrosis, VNN)는 노다바이러스과 내의 Betanodavirus 속에 속해 있는 어류 노다바이러스에 의해 유발된다 [14 , 27] . 이 질병은 유럽농어( Dicentrarchus labrax ) 뿐만 아니라 줄무늬잭( Pseudocaranx dentex ), 대서양 넙치( Hippoglossus hippoglossus ), 가자미( Scophthalmus maximus ) 및 그루퍼 등 경제적으로 중요한 해양어류에 영향을 미친다 [11 , 15 , 17 , 22] . VNN 질병은 주로 유생과 치어 단계의 어류에 영향을 미친다. 감염된 어류는 중추신경계 및 망막 손상으로 인하여 비정상적인 행동 및 시각기능 이상이 나타나며, 뇌와 척수에서의 액포형성과 괴사가 나타난다 [2] . VNN 질병을 유발하는 신경괴사 바이러스(NNV)는 크기가 약 30 nm이며, 비외피성 정20면체 RNA 바이러스이다 [9 , 21] . 어류 노다바이러스는 바이러스 외피단백질 유전자 가변부(T4)의 염기서열에 따라 줄무늬잭 NNV (SJNNV), 자주복 NNV (TPNNV), 노랑가자미 NNV (BFNNV) 및 붉바리 NNV (RGNNV) 등 4종류의 유전형으로 구분된다 [18] .
다양한 숙주범위와 경제적인 피해로 인하여 RGNNV를 동정하고 검출하기 위한 다양한 보고가 이루어지고 있다. 특히 혈청학적 방법은 특이성, 신속함 및 단순함 때문에 자주 사용된다 [7 , 23] . 혈청학적 방법은 항체의 질에 크게 의존한다 [24] . 고도로 정제되고 정확한 항원을 사용하는 것은 더 특이한 항체를 얻는데 있어서 가장 중요한 요소 중의 하나이다 [3] . 그러나 대상 단백질의 발현이 일어나지 않거나, 정제가 거의 불가능하여 대상 항원을 얻는 것이 어렵기 때문에 [26] , 전통적인 혈청학적 방법은 사용할 수 없는 경우가 많다. 따라서 virus- like particles (VLPs)을 어류에 주사하는 직접 면역법을 사용하거나 [14] , 곤충세포 및 대장균 발현시스템을 사용하여 VLPs를 생산하는 방법이 사용되어 왔다 [13 , 16] . 최근에는 RGNNV 외피단백질 유전자가 형질전환된 Saccharomyces cerevisiae 분쇄물로부터 VLPs를 분리하고, 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 방법이 보고되기도 하였다 [6] . 특이한 바이러스 항원을 정제하거나 백신생산을 위한 가장 좋은 접근 중의 하나는 효모의 세포표면에 대상 단백질을 표출하는 것이다 [20 , 25 , 28] .
본 연구에서는 RGNNV 항체 제작에 필요한 항원을 효과적으로 개발하기 위하여 효모표면발현(yeast surface display, YSD) 시스템을 이용하였다. 이를 위하여 RGNNV 외피단백질 유전자를 합성을 통해 준비하였으며, 효모표면발현 벡터인 pCTCON 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 pCTCON-RGNNVcp를 효모 발현세포인 EBY100에 형질전환을 수행하였으며, hemagglutinin (HA)-tagging 시스템을 이용하여 RGNNV 외피단백질의 발현을 확인하였다.
재료 및 방법
- RGNNV 외피단백질 유전자 클로닝
Saccharomyces cerevisiae 세포에서 바이러스 단백질을 발현시키기 위해 RGNNV 외피단백질 유전자(Gene Bank Number: EU391590.1)를 사용하였다. 유전자 염기서열상의 N-glycosylation 지역을 선별했고, 효모세포에서의 고도발현을 위하여 치환하였다(N-X-S/T→Q-X-S/T). 치환된 유전자 서열은 합성(Bioneer, Korea)하여 pGEMT easy vector에 클로닝하였다. YSD는 Aga2p와 GAL1-10이 포함된 pCTCON 벡터를 사용하여 수행하였다. RGNNV 외피단백질은 Nhe I와 Bam HI으로 절단하였고, pCTCON 벡터로 클로닝되었다. 발현벡터와 삽입유전자의 연결은 4℃, overnight 조건에서 T4 DNA ligase를 사용하여 수행하였다. Ligation 혼합물은 clone 증폭을 위해 competent E. coli DH5α 세포로 형질전환시키고, 50 μg/ml ampicillin이 포함된 Luria-Bertani (LB) agar 배지에서 배양하였다.
- 효모세포로의 형질전환
효모 형질전환은 Yeast maker TM (Clontech)의 시험방법에 따라 수행하였다 [10] . YSD를 위한 Saccharomyces cerevisiae strain은 EBY100 (a GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2Δ 1his3Δ200 pep4::HIS2 prb1Δ1.6R can1GAL)을 사용하였다 [5] . EBY100 strain은 YPD 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose)를 사용하여 배양하여 competent yeast cells을 만들었다. E. coli DH5a로부터 분리한 pCTCON plasmid (0.1 μg/μl) 5 μl 와 5 μl의 yeast maker carrier DNA(sheared salmon sperm DNA, 0.5 μg/μl) 및 50 μl의 competent cells를 1.5 ml E-tube에 넣고 부드럽게 섞어주었다. 500 μl의 PEG/LiAc 용액을 첨가한 후 30℃에서 30분간 배양하였으며, 매 10분마다 뒤집어 주었다. 20 ml의 DMSO를 첨가한 후 잘 섞고, 42℃에서 15분간 배양하였으며, 매 5분마다 뒤집어 주었다. 실온에서 3,800 g, 5분간 원심분리하고, pellet을 1 ml의 YPD broth에 재현탁하였다. 30℃에서 30분간 진탕배양한 후 3,800 g, 5분간 실온에서 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 pellet을 400 μl의 0.9% NaCl 용액으로 재현탁하였다. 형질전환된 효모세포는 20 g/l의 dextrose가 포함되어 있는 최소배지(SD-CAA)에서 배양하였으며, RGNNV 외피단백질 발현을 위해서는 dextrose 대신 20 g/l의 galactose가 포함된 최소배지(SG-CAA)에서 배양하였다 [8] .
- 효모세포의 발현유도 및 flow cytometry 분석
형질전환된 콜로니를 5 ml의 SD-CAA 배지에 접종하고, 30℃, 170 g의 조건으로 OD600 값이 4-6이 되도록 배양하였다. 세포를 원심분리하고, OD600 값이 1이 되도록 SG-CAA 배지에 재현탁하였다. 30℃, 170 g의 조건으로 OD600 값이 4-6이 되도록 배양하였다. 세포를 원심분리하여 모으고, 0.1% bovine serum albumin (BSA)이 포함된 PBS 배지에 OC600 값이 0.4가 되도록 재현탁하였다. 형질전환된 효모 세포는 최종부피가 50 μl가 되도록 mouse 9E10에서 생산된 monoclonal anti-c-myc 항체(1:4,000, Sigma-Aldrich)와 함께 배양하였다. 1시간 실온에서 배양 후 세포를 모으고 ice-cold PBS/BSA에서 2회 세척하였다. 세포는 goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate conjugate (1:4,000, Abcam)와 함께 4℃ 암처에서 1시간 배양하였다. 500 μl의 ice-cold PBS/BSA에 재현탁한 후 flow cytometry (Merck Millipore)로 옮겨 효모에서의 각 바이러스 단백질의 발현정도를 분석하였다.
- 효모세포 표면으로부터 RGNNV 외피단백질 정제
효모세포표면에 발현된 단백질의 disulfide 결합을 분리하였다. 200 μl의 효모세포를 원심분리하여 100 μl로 농축하였고, 50 μl의 β-mercaptoethanol을 혼합한 후 10 분간 가열하였다. 1 분간 100,000 g, 4℃에서 원심분리하여 상층액을 모았다. 상층액은 Pierce HA Tag IP/Co-IP kit (Thermo)를 사용하여 정제하였다. 단백질은 non-reducing 15% SDS-PAGE loading buffer로 분리하였으며, 분리된 단백질은 blotting buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris-base, 0.1% SDS, 20% methanol, pH 8.3)내에서 2시간 동안 실온에서 polyvinylidene fluoride membranes (GE Healthcare)으로 이동되었다. 멤브레인은 0.1% Tween가 들어 있는 1X Tris buffered saline (TBS) 용액에서 5% nonfat milk powder로 blocking 하였다. 멤브레인은 1:1,000으로 희석된 anti-c-myc antibody (Sigma-Aldrich)와 반응시켰고 3번 세척 후 goat pAb to mouse IgG (Cell Signaling Technology) secondary antibody (1:1,000)로 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.
결과 및 고찰
- N-glycosylation 치환
RGNNV 외피단백질을 발현시키기 위해서 효모시스템을 사용하였다. 효모시스템을 사용하기 위해서는 진핵세포의 특징인 glycosylation을 고려해야만 한다. 세포표면 단백질의 N-glycosylation은 정제를 위한 가수분해를 저해하기 때문에 [19] , 성공적인 발현단백질 정제를 위해서는 다른 아미노산으로 치환되어야 한다. 효모 당단백질은 탄수화물 사슬이 단백 질의 특이 아미노산 잔기와 결합되어 있는 구조를 갖는다. N-linked 올리고당의 경우 asparagine이며, O-linked 올리고 당의 경우 serine과 threonin이 결합되어 있다 [12] . RGNNV 외피단백질 유전자를 분석하였을 때, 총 6개의 N-glycosylation (Asparagine-X-Serine/ Threonine, N-X-S/T) 지역이 존재하였으며, asparagine (AAC 또는 AAT) 부분을 glutamine (CAG)으로 치환하였다( Table 1 ). 유전자 합성의 효율을 높이기 위해 open reading frame을 고려하여 339 bp 및 525 bp로 나누어 합성을 수행하였으며, 각각의 절편은 RGNNV1 및 RGNNV2로 명명하였다( Table 1 ). 이 두 절편을 각각 효모발현 벡터에 클로닝하기 위해 유전자의 5’ 말단에는 Nhe I 서열과 3’ 말단에는 Bam HI 제한효소 서열을 첨가하였으며, 최종적으로 pGEMT-easy vector에 클로닝하였다.
Substitution of N-glycosylation site on RGNNV CP gene
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The amino acid of N (asparagine) on ‘N-X-S/T’ was changed to Q (glutamine) on ‘Q-X-S/T’.
- RGNNV 외피단백질 발현
확보한 RGNNV 외피단백질 유전자를 효모 표면에 발현시키기 위해 pGEMT-easy vector에 클로닝되어 있는 RGNNV1과 RGNNV2를 각각 효모 표면 발현 vector인 pCTCON으로 옮겼다. 효모세포벽의 N말단이 공유결합된 형태로 존재하는 α-agglutinin의 특성을 응용한 방법이며, Aga1과 Aga2의 소단위체(subunit)로 구성되어 있다. Aga1 단백질이 β-glucan결합으로 세포벽에 고정되고, Aga2 (69개 amino acids)가 이황화결합을 하고 있다. Aga2 단백질로부터 HA tagging 단백질, 항원, c-myc 순으로 효모 표면에 발현한다 [1 , 4] . 본 연구에서 pCTCON-RGNNVcp 벡터 클론을 Aga1p 단백질을 발현하는 세포인 EBY100 세포에 형질전환을 수행하였다. pCTCON 발현벡터는 TRP (Tryptophan) nutritional marker를 지니고 있어 형질전환 후 세포들을 선택배지인 SC-TRP plates에서 형질전환 세포를 선별하였으며, 형질전환 효율은 각 플라스미드에서 10 4 형질전환체를 얻는 것으로 나타났다. 이러한 과정을 통해 선발된 형질전환체는 N-말단 부위에 Aga2p 단백질을 융합한 RGNNV 외피단백질은 세포벽에 발현되어 공유결합되어 있는 Aga1p와 이황화결합을 형성함으로써 RGNNV 외피단백질을 발현시킨다.
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Diagram of RGNNV CP gene cloning to pCTCON vector.
- FACS에 의한 발현단백질 분석
RGNNV 외피단백질 유전자가 고발현되는 형질전환 세포주를 확인하기 위해 FACS 분석을 수행하였다( Fig. 2 ). 세포벽에 발현되어 있는 RGNNV 외피단백질의 경우 C-말단 부위에 c-myc tag을 발현하고 있기 때문에 anti-c-Myc 항체를 이용하여 형광염색을 수행하였다. FACS을 이용하여 형광량을 측정함으로써 각각의 형질전환 세포주에서 RGNNV 외피단백질 발현량 차이를 측정하였다. 고발현 세포주를 측정하기 위하여 탄소원인 galactose가 포함된 SG-CAA 배지를 이용하여 발현을 유도하였으며, 벡터를 형질전환하지 않은 EBY100 세포를 대조군으로 하여 각 RGNNV 외피단백질마다 2개씩 총 4개의 형질전환 라인의 발현량 정도를 FACS 분석을 통한 상대적인 형광의 강도를 수치화하여 알아보았다( Fig. 2 ). 대조군의 FACS 평균값은 9.73이었으며, RGNNV1 형질전환 라인은 평균 16.70-16.75의 값이 측정되었으며, RGNNV2는 16.96-17.17 값이 측정되었다. 여기에서 RGNNV2의 평균 발현 정도가 RGNNV1보다 높게 나타났는데 이는 둘 사이의 뉴글레오 타이드 서열차이에서 발생한 현상으로 추측된다. 즉 RGNNV2와 RGNNV1의 서열이 각각 다르며, 이러한 차이는 두 단백질의 효모 표면에서의 발현에 영향을 줄 수 있다. 또한 일반적으로 FACS 분석과정 중 세포자체에서 발생하는 auto fluorescence가 측정되는데 이는 yeast display system의 전형적인 현상이다. 여기에서 대조군이 가지는 FACS 평균값이 세포자체에서 발생된 형광의 강도를 나타낸다. 결과적으로 측정된 4개의 형질전환 라인 중 RGNNV2의 2라인에서 가장 높은 발현량(평균: 17.17)이 검출되었다( Table 2 ).
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Flow cytometric analysis of RGNNV CP expression on yeast. The yeast cells were cultured on galactose containing medium, and then cells were labeled with anti c-myc antibody for fluorescence-activated cell sorting analysis. The gray background indicates non-induced cells. The black histogram represents the RGNNV CP expressing yeast cells.
FACS mean values from flow cytometry analysis.
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FACS mean values from flow cytometry analysis.
- RGNNV 외피단백질 정제
β-mercaptoethanol을 처리함으로써, Aga2와 결합된 발현된 RGNNV 외피단백질을 효모표면 상의 Aga1 단백질로부터 분리하였다. RGNNV 외피단백질은 상층액으로부터 anti-HA agarose로 정제하였다. 생산된 RGNNV 외피단백질 조각의 발현을 확인하기 위하여 anti-HA 항체로 Western blots을 수행하였으며, 대조구로는 RGNNV 외피단백질이 발현되지 않는 SD-CAA 배지 배양 세포 유래 단백질을 대조구로 사용하였다. Western blot 결과 전체 RGNNV의 절편인 RGNNV1과 RGNNV2 외피단백질이 대상 크기(22-36 kDa)에서 각각 검출되었다( Fig. 3 ). 여기서 RGNNV1 와 RGNNV2 사이의 뉴클레오타이드 서열길이의 상대적인 차이로 인한 이들의 발현단백질의 크기 또한 차이를 보였다. 즉, 상대적인 긴 서열을 지닌 RGNNV2 외피단백질의 크기(33.65 kDa)가 작은 서열을 지닌 RGNNV1 (26.75 kDa)보다 크기가 컸다.
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Purification of RGNNV CP by western blot using anti- HA antibody.
결 론
바이러스 외피단백질을 항원으로 사용하기 위해서는 해당 바이러스를 농축하고, 이들을 항원으로 사용하여 항체를 개발하는 방법이 일반적으로 사용된다. 본 연구에서는 알려진 바이러스 유전자를 YSD 시스템에 적용하여 발현시키고, 정제하여 항원으로 사용할 수 있는 기법을 개발하였다. Gene Bank에서 확인된 RGNNV 외피단백질 유전자를 합성하고, pCTCON 벡터를 이용하여 효모세포로 형질전환한 후, 형질 전환 여부를 FACs를 이용하여 확인하고, 발현된 RGNNV 외피단백질을 β-mercaptoethanol을 처리함으로써 확보하였다. 이러한 결과는 YSD와 HA-tagging 시스템이 RGNNV 외피단백질의 발현 및 정제에 적용 가능하다는 것을 의미한다.
Acknowledgements
본 연구는 한국해양과학기술원(과제번호: PE99193)의 연구사업의 지원에 의해 이루어진 것임.
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