본 연구는 한국 고유의 전통주인 막걸리 제조시 생성되는 주박 추출물과 유기용매 분획물을 총 85종 분리하여, 이들의 대장암 세포주에 대한 항성장 활성과 활성기전을 연구하였다. 이들 중 세포생존율 연구결과에 따라 3가지 종류의 분획물(KSD-E1-3, KSD-E2-3, KSD-E4-3)을 선별하였다. 이 중 가장 활성이 높은 KSD-E1-3 분획물에 의한 유전체 수준에서의 유전자 발현변화를 확인하기 위하여 oligo DNA microarray 실험을 수행하였다. 그 결과, 2배이상 발현이 증가된 유전자들 가운데 항암 유전자인 NAG-1, ATF3, DDIT3 그리고 p21 을 선별하여 추가 실험을 진행하였다. 세포생존율 결과에 따라 선별된 3가지 종류의 분획물(KSD-E1-3, KSD-E2-3 그리고 KSD-E4-3)에 의한 4가지 종류의 유전자의 발현을 확인한 결과, KSD-E1-3에 의하여 모든 유전자의 발현이 높게 증가되었다. KSD-E1-3에 의한 유전자의 발현이 전사조절인자 p53 에 의존적인지 확인하고자 p53 null HCT116 세포주를 이용하여 RT-PCR한 결과, NAG-1, ATF3 , 그리고 DDIT3 유전자 p53 에 비의존적이었으며, 반면 p21 유전자는 p53 에 의해서만 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 이러한 연구 결과는 주박 추출물이 다양한 기작에 의해 항암 유전자의 발현을 유도함으로써 암 세포에 대한 항성장 활성을 보여주고 있음을 나타낸다. 막걸리는 찹쌀 등의 전분을 원료로 하고 있고, 발효제를 섞어 발효시킨 탁주를 혼탁하게 제성한 한국 고유의 전통주이다 [10] . 막걸리는 다른 주류에서는 볼 수 없는 당화와 발효라는 두 가지 이화학적, 미생물학적 변화를 혼합적으로 가지고 있다 [14 , 15] . 막걸리를 제조할 때 술을 걸러내는 과정에서 생성되는 찌꺼기를 “주박” 혹은 “술지게미”라고 하며, 주박은 단백질과 전분질이 주성분이며 [6] , 알코올, 당류, 효모, 유기산, 무기질 등을 함유하고 있다 [20] . 주박에 대한 생리활성 연구는 면역촉진물질 활성 [4] , 항산화 및 항균활성 등으로 보고되었다 [12] . 또한 누룩은 술을 빚을 때 사용하는 발효제로서 효소를 지닌 곰팡이를 곡류에 번식시킨 것이다 [11] . 누룩은 밀, 호밀, 조곡, 현미를 기본 원료로 제조되는데 이는 지방마다 다른 생산원료를 사용하기 때문이며 [2] , 같은 원료라도 제조시 온도, 습도 등의 환경요인에 따라 차이가 나는 것으로 알려져 있다 [25] . 더욱이 누룩은 생전분을 원료로 하기 때문에 미발효성당과 올리고당, 식이성 섬유질이 풍부하게 함유되어 있어 웰빙(well being) 술의 양조가 가능하다 [24] . 암은 비정상적인 세포가 통제되지 못하고 과다하게 증식을 통해 확산되는 질병이다 [16] . 국내의 경우 보건복지부 중앙등록본부의 암 등록 통계에 의하면 2011년도 기준 암 발생 현황이 갑상선암(17.8%), 위암(14.9%)에 이어 대장암이 세 번째(12.8%)이며, 암으로 인한 사망율은 위암(19.6%), 대장암(15.2%), 폐암(14.2%), 간암(11.5%) 순으로 보고되고 있다 [22] . 특히 대장암은 세계에서도 두 번째로 발병률이 높고 [3] , 우리나라에서도 상당히 발병률이 높다. 대장암의 유발 요인은 현대화로 인한 서구형 식생활 변화에 따른 과다한 동물성 지방 섭취 및 섬유질, 칼슘 부족 등의 환경요인 [9] 과 염증질환 및 대장 용종 등의 유전적 요인이다 [1] . 그러나 치료제로 사용되는 대부분의 항암제는 암세포의 apoptosis [8] 는 물론, 정상 세포도 사멸을 유발한다. 그렇기때문에 최근에는 식물로부터 추출한 천연재료를 활용한 면역향상과 암세포의 사멸을 유도하는 항암제에 대한 연구 [17 , 19] 가 진행 중이며, 이와 더불어 가족력이 있는 환자에게는 대장암 조기 발견을 위한 검사를 권장하고 있는 실정이다 [7] . 본 연구는 8종의 주박과 3종의 누룩을 유기용매로 분획한 총 85종에 의한 대장암 세포주의 성장 억제 활성 및 항 성장기전을 연구하고자 하였다. 즉, 인간 대장암 HCT116 세포주에서 주박 추출물이 세포생존율에 미치는 영향을 확인하고, oligo DNA microarray 실험을 수행하여 주박 추출물 처리에 의해 차별적으로 발현되는 유전자를 선별하였다. 그 중 4개의 유전자를 선별하여 전사조절인자 p53의 의존성에 대해서 연구하였다. 이러한 연구 결과는 주박 추출물 및 분획물에 의한 대장암 세포의 성장 억제활성과 그 기전을 이해하는데 도움을 줄 것으로 기대된다. 본 연구에서 사용된 8종의 주박과 3종의 누룩은 (주)국순당에서 제공받아 사용하였으며, 총 11종의 시료에서 총 85종의 분획물을 2회에 나누어 제조하였다. 제조방법은 다음의 절차에 따라 진행하였다. 주박의 열수 추출물은 시료 1 kg에 물 1 l를 가하여 100℃에서 30분 동안 추출하였으며, 여과한 후(Whatman No. 2), 70℃에서 감압 농축하여 분말로 제조하였다. 에탄올 추출물은 시료 1.5 kg에 95% 에탄올 6 l를 가하여 상온에서 3일간 2회 추출 하였고, 여과한 후 60℃에서 감압농축하여 분말로 제조하였다. 또한 누룩의 에탄올 추출물은 시료 200 g에 95% 에탄올 1 l를 가하여 상온에서 7일 동안 2회 추출하였고, 여과한 후 60℃에서 감압 농축하여 분말로 제조하였다. 각각 추출된 추출물 4 g을 물에 현탁하여 n-hexane, ethylacetate, butanol을 이용하여 순차적으로 분획하고 물 잔류물을 회수하여 총 85종의 추출물 및 분획물을 제조하였다. 추출물과 분획물은 Dimethyl sulfoxide (DMSO, sigma, USA)에 녹여 −20℃에서 저장하여 사용하였다. 총 분획물 85종 중 cell viability assay 결과에서 선별된 분획물 KSD-E1-3, KSD-E2-3, 그리고 KSD-E4-3에 대한 자세한 정보는 Table 1 에 나타내었다. 대장암 세포주 HCT116는 American Type Culture Collection (ATCC, Frederick, MD, USA)에서 구입하였고, p53 null HCT116 (HCT116 p53-/-) 세포주는 Johns Hopkins 의과대학의 Bert Vogelstein 박사로부터 분양 받았다. 두 종류의 세포주 배양은 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco, USA), 1% penicillin 및 streptomycin (WelGene, Korea)이 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA)을 사용하였다. 세포의 생육정도를 관찰하면서 계대배양을 실시하여 적정수의 세포를 유지하였다. 대장암 세포주 HCT116에 주박 추출물 및 분획물을 처리하여 세포 생존율에 미치는 영향을 연구하기 위해 cell viability assay를 수행하였다. 우선 96 well plate에 1×10 ³ cells/well의 세포를 접종한 후, 24시간 후에 FBS를 첨가하지 않은 serum free medium으로 배지를 교환한 뒤 DMSO에 녹인 주박 추출물 및 분획물을 1 mg/ml 로 처리하였다. 주박 분획물의 대조물질로는 용매인 DMSO를 처리하였다. 24시간 경과 후, cell viability assay를 수행하기 위해 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)용액(Promega, USA)을 각 well당 20 μl씩 첨가하여 37℃, 5% CO ₂ incubator에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 NanoQuant Plate ^TM (Tecan Trading AG, Switzerland)를 사용하여 580 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과 수치는 4개의 독립적인 well에서 수행한 값을 Microsoft EXCEL program을 이용하여 분석한 후 mean ± SD 값과 그래프로 나타내었다. Total RNA 추출은 주박 및 추출물을 처리한 대장암 세포주로부터 RNeasy mini kit (Qiagen, USA)를 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 수행하였다. 최종적으로 정제된 total RNA는 NanoQuant Plate ^TM 를 이용하여 260 nm와 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량한 후, oligo DNA Microarray 실험과 RT-PCR에 사용되었다. Oligo DNA microarray 실험과 데이터 분석은 지노믹트리사(Genomictree, Inc, Korea)에 위탁하여 수행하였다. 사용한 microarray는 Agilent사의 Agilent Human GE 4 X 44K (V2) arrays (Agilent Techonlogies, Palo Alto, USA)를 사용하였다 수확한 세포주로부터 추출한 total RNA 2 μg을 주형으로 PrimeScript ^TM RT-PCR Kit (TaKaRa, Japan)를 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 유전자 특이적인 oligonucleotide primer ( Table 2 )를 이용하여 PCR (Polymerase Chain Reaction) 과정을 수행하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분 denaturation시키고, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초의 cycle을 총 30번 반복한 뒤, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. 최종적인 PCR product는 1.5% agarose gel에서 전기영동 하고 ethidium bromide (EtBr, Bioneer, Korea)로 염색하여 Gel Image Analysis System (CoreBio, Korea)을 이용하여 사진 촬영하였다. 모든 실험은 최소한 3회 이상 실험을 실시하였다. p <0.05 값에서 유의성을 조사하기 위하여 Student’s t-test로 평균값을 분석하였다. 주박 추출물 및 분획물이 대장암 세포주 HCT116의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여 40종의 1차 추출물 및 분획물을 1 mg/ml의 농도로 처리한 다음 cell viability assay를 수행하였다. 주박 추출물 및 분획물의 대조물질로는 DMSO를 이용하였다. 그 결과 대부분의 추출물 및 분획물에 의해 cell viability 생성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 KSDE3-2, KSD-E3-3, 그리고 KSD-E1-3등의 시료에 의해 생존율이 크게 감소되는 것을 확인할 수 있었다( Fig. 1A ). 2차 주박 추출물 및 분획물 45종에 의한 세포생존율을 측정하기 위해 1 mg/ml의 농도로 처리한 뒤 동일한 조건으로 cell viability assay를 수행하였다. 그 결과 KSD-E4-3, KSD-E4-4 그리고 KSD-W7-5 등의 분획물에서 세포생존율의 큰 감소를 확인 할 수 있었다( Fig. 1B ). 본 연구에서는 총 85종의 주박 추출물 및 분획물에 의한 cell viability assay에 결과와 마우스 대식 세포인 RAW264.7 세포주에 대한 세포 사멸결과(data not shown)를 종합하여 최종적으로 3종의 분획물(KSD-E1-3, KSD-E2-3, KSD-E4-3)을 선정하여 추후 실험을 진행하였다 ( Table 1 ). 선별된 3종의 주박 추출물 및 분획물(KSD-E1-3, KSD-E2-3, KSD-E4-3)의 농도에 따른 처리가 HCT116 세포 생존율에 미치는 영향을 연구하였다. 연구방법은 HCT116 세포주에 선별된 주박 추출물 및 분획물 3종을 0.25, 0.5, 1 mg/ml의 농도로 24시간 처리한 후, cell viability를 측정하였다. 그 결과 3종의 시료에 의해 농도 의존적으로 cell viability가 감소함을 확인할 수 있었으나, 이 중 KSD-E1-3에 의한 세포 생존율 감소가 가장 크게 일어남을 확인하였다( Fig. 2 ). KSD-E1-3에 의한 유전체수준에서의 발현을 확인하기 위하여 oligo DNA microarray 실험을 진행하였다. 선별된 3종의 시료 중에서 가장 높은 항성장 활성을 보여준 KSD-E1-3 분획물을 1 mg/ml 농도로 HCT116 세포주에 처리한 후, oligo DNA microarray analysis를 수행하였다. DNA microarray 실험 결과, 2배 이상 발현이 증가되는 유전자중 항암 유전자 4개(Non-steroid Anti-inflammatory drug-activated gene-1 [ NAG-1 ], Activating Transcription Factor 3 [ ATF3 ], DNA-damage-inducible Transcript 3 [ DDIT3 ], Cyclindependent kinase inhibitor 1A [ CDKN1A, p21 ])를 선별하였다( Table 2 ). 세포 생존율 실험 결과에 따라 선별된 3종의 분획물을 1 mg/ml의 농도로 처리한 후, 4가지의 유전자 발현을 확인하였다. 그 결과, p21 유전자의 경우 KSD-E1-3에 의해서만 발현이 증가된 반면, DDIT3 , ATF3 그리고 NAG-1 유전자는 처리한 모든 분획물에 의해 발현이 유도되었다( Fig. 3 ). 또한, 처리한 분획물 중 KSD-E1-3에 의해 모든 항암 유전자의 발현이 가장 높게 증가됨을 확인하였다. NAG-1 유전자는 TGF-β (Transforming Growth Factor-β)superfamily의 한 종류로써, pro-apoptotic 및 anti-tumorigenic의 기능을 가지는 것으로 알려져 있으며, 최근 파이토케미칼과 같은 천연물에 의해 다양한 기작을 통하여 NAG-1 유전자의 발현이 조절된다는 총설이 보고된 바 있다 [23] . ATF3 유전자는 전사조절인자로서 ATF/cAMP responsive element binding protein (CREB) family에 속하며, 천연물에 의해 발현이 증가되며 세포사멸과 관련이 있는 것으로 보고 되었다 [5 , 21] . DDIT3 유전자는 endoplasmic reticulum stress에 의해 활성화되며 세포사멸과 관련이 있는 것으로 알려져 있다 [18] . p21WAF1/CIP1유전자는 대표적인 cyclin-dependent kinase inhibitor 중 하나로서, 세포주기 진행을 억제하는 역할을 수행한다. 암 억제 유전자인 p53 은 DNA 손상으로 인해 발생할 수있는 치명적인 영향으로부터 세포를 보호하는 역할 이외에 세포주기의 정지, 노화, apoptosis 등 다양한 역할을 수행하는 전사조절인자이다. 또한, 천연물의 처리에 의해 발현이 증가되며, 암세포 사멸과 직접적 관련성이 있는 것으로 알려져 있다 [13] . 본 연구에서는 oligo DNA microarray 실험에 의해 선별된 4개의 유전자 발현이 전사조절인자 p53 에 의존적인지 확인하고자 p53 유전자가 null인 HCT116 세포주를 이용하였다. p53 wild type HCT116 세포주는 p53 의 발현이 되는 것을 확인 하였고, KSD-E1-3의 처리 유무에 관계없이 p53 null 세포주에서는 p53 이 발현되지 않았다. 선별된 4개의 유전자 중 NAG-1, ATF3, DDIT3 유전자는 p53 발현 유무에 관계없이 KSD-E1-3에 의해 발현이 증가됨을 확인하였다. 반면, p21 유전자의 경우 p53 에 의해서만 KSD-E1-3에 의해 발현이 증가되는 것을 확인하였다( Fig. 4 ). 연구결과를 종합하면 주박 추출물 및 분획물이 여러 항암유전자 발현을 다양한 경로를 통하여 증가시킴으로써 암세포에 대한 항성장 활성을 나타냄을 증명하였다. 그러나 선별된 KSD-E1-3 분획물의 작용기전을 이해하고, 항성장 활성의 핵심물질을 찾기 위해서는 추가 분획물을 제조하고, 추가적인 기전연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다.