본 연구는 최근 국민들이 많은 관심을 갖는 식물발효 효소액 중 부추 당침액(부추:설탕 1:3)을 유산균( Lactobacillus acidophilus AML 0422, Lactobacillus brevis HLJ 59, Lactobacillus helveticus AML0410, Lactobacillus plantarum KCTC 13093) 발효를 통해 발효 부추액의 항균활성 및 항산화활성과 항고혈압활성 등의 기능성을 발효 전 후의 유효특성을 조사하였다. 유산균을 이용하여 발효한 발효 부추액은 S. aureus KCTC 1916에 대해 31.43 mm의 높은 항균력을 보이는 것으로 조사되었으며, 총 폴리페놀함량, 총 플라보노이드 함량과 DPPH 활성 소거능이 160.8-178 mg/ml, 100-108 mg/ml, 82.8-93.5%로 각각 조사되었다. DPPH 활성 소거능에 있어서는 Vitamin C 50 ppm과 유사한 활성을 보이는 것으로 나타났다. 심혈관질환 및 뇌혈관질환 등 고혈압과 관련이 깊은 ACE 저해활성은 유산균의 종류에 따라 50.4-67%로 발효전인 32.6%보다 좋은 활성을 보이는 것으로 조사되었다. 이상의 결과를 종합하였을 때 유용 유산균을 이용한 부추 당침액의 발효산물은 항균활성, 항산화활성과 ACE 저해활성 등 우수한 생리활성 효과를 나타내는 것으로 조사되었다. 최근 건강에 대한 관심이 높아지면서 건강기능식품에 대한 소비량이 증가되고 있는 실정이다. 이러한 건강기능식품 중의 하나인 발효식품 중 효소액에 대한 관심이 높아지고 최근 다양한 효소액 제품이 생산판매되고 있다. 하지만 진정한 발효 효소액 보다는 설탕 등의 당을 첨가하여 일정기간 침지를 통해 얻어지는 당추출로 당침액에 가까워 당도가 매우 높은 제품군이다. 최근 이러한 식물발효액의 항산화성, 항비만, 항암등의 기능성에 대한 연구 [10 , 15 , 30] 가 보고되어 있으나 발효액의 표현보다는 당침액이라 할 수 있다. 진정한 의미에서의 발효식품은 항산화 시스템 강화, 그리고 인체의 방어력을 높이는 면역 시스템 강화 효과를 가져다주며, 다양한 기능성 소재의 가능성이 보고되고 있다 [16] . 발효 효소액은 발효 역할을 하는 주요 발효 미생물인 probiotics가 포함되어 이들 균주들이 식품 내 활용 가능한 기질등을 발효하여 소화 및 건강에 유리한 발효산물을 생성하고, 균들이 정장작용 및 조성물이 기능성 작용 등을 통해 건강을 유지해 주는 것으로, 특히 유산균 발효는 장내 독성제거 기능을 향상시키는 기능성 식품으로 최근 각광을 받고 있다. 서구에서는 발효 음료, 사워크라우트(Sauerkraut), 올리브, 대두 발효와 채소 발효 식품 등이 발달해 있다. 유산균 발효 공정을 조절하기 위하여 당도, 염도, 온도와 pH의 변화에 따른 발효 환경에 대하여 조사하고, biogenic amines 등의 유해 물질 억제, 소비자가 원하는 식재료의 조직감과 풍미, 안정성과 보존성, 그리고 생산성을 고려하여 유산균 종균 선택 기준이 정리되고 있다 [17 , 23] . 부추는 백합과에 속하는 Allium속 식물로 500여종의 Allium속 식물에 대한 약리작용은 수 세기 동안 경험적으로 사용되고 있었으며, 우리나라 산야에서 자생하며, 독특한 맛과 향기가 있어서 식품으로 많이 이용해왔으며, 한방에서는 맛이 맵고 성질이 따듯하여 혈액순환에 좋으며, 강장제, 해독제 등으로 효과가 있다고 보고되고 있다 [1 , 21] . 부추의 주요 영양성분은 카로틴, 비타민 B2, 비타민 C, 칼슘, 철 등을 함유하고 있으며 주요 성분으로는 allyl sulfide, pentose 및 allylthiamine, 여러 가지 sulfide 유도체와 adenosine, alanine, glutamic acid, aspartic acid, valine 등 아미노산, dimethyl disulfide와 dimethyl trisulfide 같은 8가지 지방족 황 함유화합물 등이 함유되어 자양강장효과가 있는 것으로 확인되었다 [4 , 24] . 따라서 본 연구는 최근 국민들이 많은 관심을 갖는 식물발효 효소액 중 부추 당침액(부추:설탕 1:3)을 유산균 발효를 통해 발효 부추액의 기능성 분석 항산화활성과 항고혈압활성등의 기능성을 발효 전 후의 유효 특성을 파악하고 향후 각종 식물발효에 대한 과학적 표준화에 대한 기초자료로 제공하고자 한다. 본 실험에 사용한 Folin-ciocalteau′s phenol reagent, DPPH, tannic acid, angiotensin converting enzyme, hippuril- L-histidine-L-leucine 등은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 그 외의 시약은 특급 및 일급 시약을 사용하였다. 부추 당침액은 2013년도에 안동시 임하면에서 재배한 부추를 활용하여, 뿌리 부분을 제외한 부분을 수세한 다음 단지에 부추와 설탕을 1:3의 비율로 침지하여 3개월간 당침을 통해 완성된 부추 당침액을 원액으로 사용하였다. 부추 당침액 원액은 당농도가 35 Brix로 조사되었으며, 1차 실험에서 균주접종 후 높은 당도로 인해 유산균의 증식이 저해되는 것으로 조사되어, 10 Brix 로 조정하여 여과지(Whatman No. 2)로 여과 후 고압멸균을 하여 발효 시료로 사용하였다. 본 실험에 사용한 유산균은 Lactobacillus plantarum KCTC 13093와 연구실에서 분리 동정한 Lactobacillus acidophilus AML 0422, Lactobacillus brevis HLJ 59와 Lactobacillus helveticus AML0410을 사용하였으며, Lactobacilli MRS broth (Difco, Sparks, USA)에 접종하고 37℃에서 24시간 2회 계대배양하여 균주를 활성화 시킨 후 사용하였다. 발효를 위해 유산균 전 배양액을 각각의 종 배양액으로 5% (v/v)를 접종하여 3일간 37℃에서 정치배양 후 종균으로 이용하여 10 Brix 부추당침액에 유산균을 10% (1.2±0.15×10 ⁷ cfu/ml)를 접종하여, 37℃에서 7일간 발효한 유산균 부추 발효액을 원심분리하여 균체를 제거한 다음 상등액을 본 실험에서의 시료로 사용하였다. 유산균으로 발효한 부추 당침액의 항균활성을 조사하기 위해 paper disk method 법을 이용하였다. 8 mm paper disc에 부추 당침액과 유산균 발효 부추 당침액을 각각 100 ul 를 점적하여 건조시킨 후 각 병원균주 ( E. coli KCTC, 1682, S. aureus KCTC 1916, B. cereus, Listeria monocytogenes KACC 10550) 배양액을 OD값을 0.1로 조정한 후 멸균 면봉을 이용하여 LB agar plate에 도말한 후 각각의 paper disc를 올려 37℃에서 24시간 배양한 뒤 생육저지환의 직경을 측정하여 항균활성 정도를 조사하였다. 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis법을 응용하여 측정하였다 [28] . 각각의 시료 50 ul에 2% Na ₂ CO ₃ 용액 1 ul을 넣고, 50% Folin시약 50 ul를 넣은 후 상온에서 30분간 방치하여 반응 시킨 후 UV-VIS spectrophotometer를 사용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 이때 표준물질은 tannic acid를 사용하였으며, 적정농도로 만든 후 위와 같은 방법으로 실험하여 표준곡선을 구하였다. 총 플라보노이드 함량 측정은 Jia 등 [7] 의 방법을 응용하여 측정하였다. 각각의 시료 용액 150 ul에 증류수 600 ul와 5% NaNO ₂ 45 ul를 첨가하여 5분간 반응시킨 후, 10% AlCl ₃ · 6H ₂ O 100 ul를 가하고 6분간 반응시킨 후에 1 N NaOH 300 ul를 첨가하여 반응을 정지 시킨 다음 UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 rutin을 위와 같은 방법으로 실험하여 표준곡선으로하여 함량을 구하였다. DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical 소거활성은 Blois의 방법 [2] 을 일부 변형하여 측정하였다. 시료 상등액 50 ul에 DPPH 용액(ethanolic solution)을 150 ul를 가하여 혼합한 다음 실온에서 30분간 암상태에 방치 후, 525 nm에서 흡광도 감소치를 측정하였다. 이때 DPPH radical 소거활성은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 비교하여 백분율로 나타내었으며, 양성대조군으로 Vitamin C를 사용하였다. ACE 저해활성은 Cushman과 Cheung의 방법 [6] 을 일부 변형하여 측정하였다. 조효소액은 rabbit lung acetone power(Sigma, USA)를 0.3 M NaCl을 함유한 0.1 M sodium borate buffer (pH 8.3)에 1 g/10 ml (w/v)의 농도로 4℃에서 24시간 추출한 다음, 4℃에서 7000 rpm으로 60분간 원심 분리하여 상등액을 ACE 조효소액으로 사용하였다. 기질은 0.3 M NaCl 을 함유한 0.1 M sodium borate buffer (pH 8.3)에 HHL(hippuril-L-histidine-L-leucine, Sigma, USA)을 25 mg/2.5 ml (w/v)의 농도로 녹인 후 기질로 사용하였다. ACE 저해활성은 원심분리한 시료 상등액 0.1 ml과 0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3) 0.1 ml에 기질을 0.05 ml 첨가한 후, 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 1 N HCl 0.25 ml를 가하여 반응을 정지시키고 ethyl acetate 1 ml를 가하여 30초간 교반한 다음 3000 rpm으로 5분간 원심분리 한 후 상등액 0.8 ml를 취하였다. 이 상등액을 80℃에서 질소 가스를 이용하여 완전히 건조 시킨 후 0.1M sodium borate buffer (pH 8.3) 1 ml를 넣은 후 용해시키고 228 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 ACE 저해활성은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 비교하여 백분율로 나타내었으며, 양성대조군으로 ACE 저해제로 널리 사용되는 Captopril을 사용하였다. 최초 부추 당침액을 이용하여 유산균을 접종하여 발효시 37 Brix의 높은 당도로 인해 유산균의 증식이 저해가 되어 발효가 이루어지지 않는 것을 확인하였다(data not showed). 유산균의 증식을 위해 당도를 10 Brix로 조정하여 7일간의 발효기간을 거치는 동안 최초 부추 당침액의 pH 3.8에서 시작된 유산균 발효 부추액의 pH는 거의 변화가 없는 것으로 조사되었으며, 당도는 초기 10 Brix에서 6-5 Brix 까지 내려가는 것으로 조사되었다. 당침부추액의 항균활성을 조사한 결과 Table 1 에서와 같이 gram 양성균인 L.monocytogenes KACC 10550에 대해서 대조구 12.89 mm와 비교하여 유산균 발효 부추액의 항균활성이 11.10-12.12 mm로 큰 변화가 없는 것으로 조사되었으며, gram 음성균인 S. aureus KCTC 1916에 대해서는 L. acidophilus AML0422의 항균활성이 31.43 mm로 항균활성이 매우 높은것으로 나타났다. E. coli KCTC 1682에 대해 12.89-14.77 mm와 B. cereus 는 17.43-21.42 mm로 대조구보다 유산균 발효부추액의 활성이 더 좋은 것으로 조사되었다. Lee 등 [13] 은 부추추출물이 E.coli 저해활성이 703 mm로 보고되었으며, Lee 등 [14] 은 부추즙 100%에서 18.17 mm로 S. aureus에 대해서는 23.6 mm로 보고하였다. 서로 상이한 항균력을 보이는 결과는 부추의 종과 농도에 따라 다소 차이가 나는 것으로 사료된다. 일반적으로 식물은 폴리페놀 및 플라보노이드 화합물과 같은 2차 대사산물을 함유하고 있는데 이들은 방향성 화합물로 고리구조상 -OH기로부터 전자를 공여하여 페놀 고리구조 공명에 의해 구조적 안정화되면서 항산화 활성을 나타내게 된다 [26] . 이러한 폴리페놀과 플라보노이드는 항산화, 항염증, 항혈전 및 항암 등 생리활성에 관여하는 것으로 최근 많은 연구에서 밝혀지고 있다 [2] . 유산균 발효에 의한 부추 당침액의 총 폴리페놀 함량은 160.8-178 mg/ml로 조사되었으며, 특히 L. plantarum KCTC 13093을 접종하여 발효한 부추액의 총 폴리페놀 함량이 178 mg/ml로 나타났다. Kim 등 [11] 에 의하면 부추의 총 폴리페놀 함량이 220.98 mg/g으로 보고되었으나, 이러한 결과는 부추의 품종에 따라 다소 차이가 나타날 것으로 사료된다. 또한 Choi 등 [4] 과 Jo 등 [8] 의 보고에 의하면 유산균 발효에 따라 폴리페놀 함량의 변화는 크게 나타나지 않는다고 하여 본 연구결과와 유사한 것으로 나타났다. 총 플라보노이드 함량의 조사결과 Fig. 2 에서와 같이 대조구인 부추 당침액에서 총 플라보노이드 함량이 110.3 mg/ml로 조사가 되었으며, 유산균 발효액은 대조구인 부추 당침액과 큰 변화가 없이 100-108 mg/ml로 나타났다. 이러한 결과로 보아 유산균 발효를 통해 총 폴리페놀 함량이 증가에 비례하여 총 플라보노이드 함량이 함께 증가한다고 볼 수 없는 것으로 사료된다. DPPH는 화학적으로 안정화 된 free radical을 가지고 있는 수용성 물질로서 515-525 nm 부근에서 최대 흡광도를 가지는 보라색의 화합물로 ascorbic acid, BHA, 토코페롤과 방향족아민류 등에 의해 환원되어 짙은 보라색이 탈색됨으로서 항산화 물질의 전자공여능을 측정할 때 사용된다 [3] . 본 실험에서 유산균을 이용하여 부추 당침액의 발효에 따른 DPPH radical 활성 소거능을 측정한 결과 Fig. 3 과 같이 다양한 유산균 종에 따라 발효한 발효 부추액이 82.8-93.5%로 조사되었으며, 대조구인 부추 당침액 78.4%보다 DPPH radical 활성 소거능이 좋은 것으로 나타났다. 또한 L. plantarum KCTC 13093으로 발효했을 경우 양성 대조구로 이용한 비타민 C 50 ppm의 92%와 유사한 DPPH radical 활성 소거능을 보이는것으로 나타났다. 이러한 결과는 Ko 등 [12] 에 의하면 부추의 DPPH redical 활성 소거능 67%로 조사되었으며, Ryu 등 [25] 의 부추김치를 용매 추출 조건에 따른 DPPH radical 활성 소거능 결과 CH ₂ Cl ₂ 추출물이 84.87%의 소거 활성능을 보다 더 높은 것으로 나타났다. ACE는 renin-angiotensin-aldosterone system의 중요한 효소물질로서 불활성형의 angiotensin-I 으로부터 C-terminal에서 dipeptide인 His-Leu를 분리시켜 가수분해 함으로서 강력한 혈관수축작용을 하는 angiotensin-II를 생성하는데, 혈압을 감소시키는 bradykinin을 불활성화시키는 효소로서 결국 본태성고혈압의 원인이 되고 있다 [19] . ACE 저해제는 ACE 활성을 저해하여 angiotensin-II의 생성과 aldosterone의 분비를 억제하여 혈관확장제인 bradykinin의 증가 등의 과정을 통해 신장혈관을 확장시켜 나트륨 배설을 촉진시킴으로서 혈압을 낮추어 줄 수 있으며, 이로 인해 심혈관질환 및 뇌혈관질환 등 고혈압과 관련이 깊은 질환을 치료하는데 사용될 수 있다 [20] . 부추 당침액을 이용한 유산균 종류에 따른 부추 발효액의 ACE 저해활성 조사결과 Fig. 4 에서와 같이 유산균 종류에 따라 50.4-67%의 ACE 저해활성을 보이는 것으로 조사되었다. 특히 L. helveticus AML 04101은 대조구인 부추 당침액 32.6% 보다 두 배 높은 ACE 저해활성을 보였으며, 현재 항고혈압제로 사용되는 captopril 0.01%는 90%의 ACE 저해활성을 보였다. 이러한 결과는 L. helveticus 를 이용한 치즈의 ACE 저해활성이 86.1%로 Wang 등 [29] 에 의해 보고되었으며, Park 등 [22] 은 부추에서 분리된 유산균의 ACE 저해활성이 59.8%로 나타났다. 이러한 결과로 보아 부추 당침액을 이용하여 유산균으로 발효한 발효물은 ACE 저해활성 효과가 우수하게 나타나는것으로 사료된다. 이상의 결과를 종합하였을 때 유용 유산균을 이용한 부추당침액의 발효산물은 항산화활성과 ACE 저해활성 등 우수한 생리활성 효과를 나타내는 것으로 조사되었다. 이러한 결과를 바탕으로 향후 설탕을 이용한 당침액으로서의 상품화가 아닌 과학적 근거에 맞는 기능적 특성을 함유하는 발효된 부추 당침액을 활용하여 기능성 음료소재로의 활용도가 높을 것으로 사료된다.