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Effects of Sea Buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) Fruit Extract on Ultraviolet-induced Apoptosis of Skin Fibroblasts
Effects of Sea Buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) Fruit Extract on Ultraviolet-induced Apoptosis of Skin Fibroblasts
Journal of Life Science. 2014. May, 24(5): 467-475
Copyright © 2014, Korean Society of Life Science
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
  • Received : February 26, 2014
  • Accepted : March 12, 2014
  • Published : May 30, 2014
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About the Authors
인식 황
Department of Biomaterials Science, College of Natural Resources & Life Science, Pusan National University, Miryang 627-706, Korea
은경 고
Department of Biomaterials Science, College of Natural Resources & Life Science, Pusan National University, Miryang 627-706, Korea
지은 김
Department of Biomaterials Science, College of Natural Resources & Life Science, Pusan National University, Miryang 627-706, Korea
영주 이
Department of Biomaterials Science, College of Natural Resources & Life Science, Pusan National University, Miryang 627-706, Korea
문화 곽
Department of Biomaterials Science, College of Natural Resources & Life Science, Pusan National University, Miryang 627-706, Korea
준 고
Department of Biomaterials Science, College of Natural Resources & Life Science, Pusan National University, Miryang 627-706, Korea
지은 성
Department of Biomaterials Science, College of Natural Resources & Life Science, Pusan National University, Miryang 627-706, Korea
성화 송
Department of Biomaterials Science, College of Natural Resources & Life Science, Pusan National University, Miryang 627-706, Korea
대연 황
Wellbeing Products RIS Center, Pusan National University, Miryang 627-706, Korea
dyhwang@pusan.ac.kr

Abstract
Sea buckthorn ( Hippophae rhamnoides L.) is a well-known and rich source of biologically active compounds, such as flavonoids, carotenoids, steroids, vitamins, tannins, and oleic acid. The effects of sea buckthorn fruit extract (SBFE) on ultraviolet (UV)-induced cell death was investigated in SK-MEL-2 cells cotreated with UV and a low concentration (LoC), medium concentration (MeC), or high concentration (HiC) of SBFE. Cell viability gradually decreased in accordance with an increase in the UV dose. The cell viability of the UV+SBFE cotreated cells increased significantly compared to that of UV+vehicle-treated cells during the application of an appropriate UV radiation dose (400 mJ). In addition, the number of 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium iodine (PI)-, and annexin V-stained apoptotic cells was higher in the UV+vehicle-treated cells than in the UV untreated cells. The decrease of apoptotic cell numbers varied in each treated group, but it was most significant in the SBFE-treated group. The number of PI-stained cells dramatically decreased in accordance with the concentration of SBFE, and the maximum decrease was detected in the UV+HiC-treated group. In addition, Bax expression increased and Bcl-2 expression decreased in the SBFE-treated group compared with the UV-only treated group. The level of caspase-3 remained constant in all the groups. These results suggest that SBFE may contribute to a recovery from UV-induced cell death through the regulation of apoptotic protein expression and that it may have potential therapeutic utility in ameliorating UV-induced skin ageing.
Keywords
서 론
Sea buckthorn ( Hippophae rhamnoides L.)는 아시아와 유럽에 주로 분포하고 있으며 높은 고도에서 자라는 Elaeaganaceae 과에 속하는 야생 관목이다[ 16 ]. 이 식물의 모든 부분은 flavonoide, carotenoids, steroids, vitamins, tannins, oleic acid 등과 같은 생물학적 활성 화합물을 풍부하게 포함하고 있다[ 4 , 32 ]. Sea buckthorn의 다양한 부위는 피부질환, 위궤양, 천식, 폐질환 등을 치료하기 위해 오랫동안 사용되어 왔다 [34] . 특별히, sea buckthorn의 잎 추출물, 열매, 씨앗오일 등은 진피 상처치료와 다양한 요인에 의한 화상치료 등에도 우수한 효능을 나타내었다[ 15 ]. 그러나, Sea buckthorn의 잠재적인 치료효과에 대한 이러한 보고에도 불구하고, 이들을 이용하여 UV에 의한 세포사와 관련된 작용기전에 대한 연구는 거의 알려져있지 않다.
한편, UV조사는 흡연과 함께 피부노화를 유발하는 외인성 요인(external influences)으로서 피부에 깊은 주름(wrinkles)을 유발하고 탄력성(elasticity)을 상실하게 하는 주요원인이다[ 2 , 23 , 36 , 38 ]. 특히, UV조사는 깊은 주름, 거칠기(roughness), 이완(laxity), 색소침착(pigmentation) 등을 특징으로 하는 피부손상의 가장 주요한 원인으로 고려되고 있다[ 10 ]. 또한, UV 조사에 의해 유발되는 피부변화는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)의 증가와도 밀접한 관계가 있으며, 증가된 활성 산소는 피부조직 내에 산화적 스트레스(oxidative stress)와 산화적 광손상(oxidative photodamage)의 원인일 뿐만 아니라 세포 내 항산화 방어작용의 파괴를 유발할 수 있다[ 3 , 5 , 17 , 22 , 40 ].
한편, UV조사로 세포 내에 유도된 산화적 스트레스는 세포 반응을 개시하고 일련의 반응을 유도하는 과정에서 매우 중요한 역할을 한다[ 25 , 30 ]. 특히, 세포 내 ROS를 생성시켜 미토콘드리아를 비롯한 세포의 기능을 손상시킨다[ 6 ]. UV조사에 의한 미토콘드리아의 기능 손상은 cytochrome c의 분비에 의한 caspase-3의 활성화로 인해 apoptosis를 유발시킨다. Apoptosis는 Bax와 Bcl-2의 경쟁에 의해 조절되며 Bcl-2는 Bax를 조절하여 cytochrome c의 분비를 억제함으로써 apoptosis를 저해한다[ 1 ].
따라서 본 연구에서는 Sea buckthorn열매의 추출물(SBFE)이 UV조사에 의해서 유도된 세포사에 미치는 효능과 작용기전에 대한 기초연구를 수행하고자 하였다. 본 연구의 결과는 SBFE가 고농도에서 세포사를 억제하는 효능을 나타낼 수 있음을 제시하고 있어 향후 UV 조사에 의해 유발되는 다양한 질환의 치료제로서 개발가능성을 제시하고 있다.
재료 및 방법
- SBFE시료준비
본 연구에 사용된 SBFE는 비타월드사(Seoul, Korea)로부터 구매하여 사용하였다. 세포처리를 위해, 각 농도 별로 멸균수에 희석하여 125, 250, 500 μg/ml 농도로 준비하였으며, 사용 전에 0.2 μm 필터(Pall Co., Ann Arbor, MI, USA)로 정제하여 준비하였다.
- 세포배양 및 처리
SBFE의 효능을 평가하기 위해 사용된 SK-MEL-2 세포주는 한국세포주은행(Korean Cell line Bank, Seoul, Korea)으로부터 분양받았다. SK-MEL-2 세포주는 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), L-glutamine, penicillin 및 streptomycin (Cambrex)을 함유한 Minimum essential Eagle midium (MEM, Gibco)에 37℃, 5% CO 2 조건의 incubator에서 배양하였다. UV 무처리군은 원래세포(intact cell)로 UV-B를 조사하지 않았다. UV-B를 조사한 세포군에는 멸균증류수(UV+Vehicle 처리군)와 125, 250, 500 μg/ml 농도 (UV+LoC, UV+MeC, UV+ HiC 처리군)의 SBFE를 각각 처리하였다.
- UV-B조사
UV-B 조사장치는 직사각형의 상자(90×30×50 cm, Daejong Instrument Co. Ltd., Seoul, Korea)에 자외선 조사장치의 광원으로 280-400 nm파장의 UV-A, UV-B, UV-C를 발광하는 TL20W/12RS 램프(Philips, Eindhoven, Netherlands)를 장착하여 사용하였다. 사용된 UV램프는 10.2% UV-C (275-290 nm), 53.5% UV-B (290-320 nm), 25.3% UV-A1 (320-340 nm), 11.2% UV-A2 (340-380 nm)로 구성되어 있다 [21] . 주름과 노화를 유발하기 위해서는 UV-A와 UV-B만이 조사되도록 Kodacel Sheeting 6805 Product (Kodak, USA)를 광원 앞에 부착하여 UV-C를 차단시켰으며, UV 램프와 세포의 거리는 30 cm가 되도록 유지하였고, 조사량은 UV x Radiometer (UVP, Upland, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 세포생존율 분석
MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diohenyl tetrazolium bromide, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)는 살아있는 세포 내 미토콘드리아 내막에 존재하는 oxido-reductase의 효소 작용에 의해 환원되어 보라색의 formazan을 형성하게 되는데, 용해액 내 보라색 formazan의 발색정도를 흡광도로 측정함으로써 세포 생존률을 분석하는 실험방법으로 이용되고 있다[ 12 ]. 먼저, SK-MEL-2 세포를 96 well (3×10 4 cells/well)에 분주하여 24시간 배양한 뒤, 400 mJ의 UV를 조사한 후 24시간 동안 배양기에서 안정화시켰다. 이들 세포에 Vehicle (dH 2 O), SBFE을 농도별로 처리하고, 3시간 동안을 배양하였다. 배양용 배지를 제거하고, MTT용액을 50 μl 첨가한 뒤, 4시간 동안 추가 배양하였다. 세포 내에 보라색 결정이 생성되면 dimethly sulphoxide (DMSO, Sigma-Aldrich Co.) 용액을 150 μl씩 넣고, formazan을 용해시켰다. 각 well에 나타난 색깔의 변화를 Soft Max Pro5 spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 측정하였다. 한편, 각 추출물의 처리조건에 따른 세포주의 분화 정도는 위상차 도립현미경(Leica Microsystems, Heerbrugg, Switzerland)을 이용하여 관찰하였다.
- Western Blot 분석
세포 내 세포사 관련 단백질 발현의 변화를 관찰하기 위하여 1×10 7 세포 이상을 Protein Extraction Solution (17081, INtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)을 이용하여 분쇄한 후 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 단백질을 분리하고, SMARTTM BCA Protein Assay Kit (21071, iNtRON Biotechnology)을 이용하여 단백질을 정량하여 western blot에 사용하였다. 4-20% SDS-PAGE gel에 50 μg의 단백질을 전기영동 한 후 ECL membrane (RPN2020D, Amersham Life Science, Piscataway, NJ, USA)에 전이하고, 3% skim milk에서 2시간 동안 블로킹하였다. 각 membrane은 다음과 같은 anti-caspase-3 antibody (#9662S, Cell signaling Technology, Beverley, MA, USA), anti-Bax antibody (ab7977, Abcam, Cambridge, UK), anti-Bcl-2 antibody (ab7973, Abcam), and anti-actin antibody (A5316, Sigma-Aldrich Co.)로 4℃에서 밤새 배양한 후 HRP-conjugated된 secondary antibody를 첨가하여 ECL Kit (RPN2108, Amersham Life Science)를 이용하여 develop하였다.
- FACS 분석
세포사의 분석을 위하여 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (556547, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 FACS 분석을 실시하였다. 세포자살이 진행되는 과정 중 세포막 내측에 위치하는 Phosphatidyl serine (PS)이 전위되며, PS는 Annexin V와 강한 친화력을 지닌다. 또한 Propidium iodide (PI)는 분해된 DNA의 절편과 친화력이 크므로 사멸된 세포를 분석하는 데 이용되고 있다[ 35 ]. 먼저, 세포를 1x PBS로 두 번 세척한 후 1x Binding Buffer를 이용하여 1×10 6 cells/ml 농도로 현탁시킨다. 이 용액으로부터 100 μl (1×10 5 cells)의 세포를 채취하여 5 ml culture tube에 분주하고, Annexin V-FITC (5 μl)와 PI (5 μl)를 첨가하여 15분 동안 실온에서 염색을 실시한다. 염색된 혼합액에 1x Binding Buffer (400 μl)를 첨가한 후 Flow Cytometer (Cytomics FC 500, Beckman Coulter, USA)를 이용하여 분석하였다.
- DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole)염색
세포에서 핵의 변화를 관찰하기 위해 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색을 실시하였다. 일반적으로 DAPI 염색은 핵과 염색체의 형태관찰 및 세포핵으로의 투과성을 비교하기 위해 사용된다[ 20 , 42 ]. 이를 위해, UV조사 후 SBFE를 처리한 세포 배양액에서 3시간 동안 배양한 후 4% Formaldehyde (Junsei Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)로 1시간 동안 고정시키고, 0.1% Triton X-100을 5분 처리하여, permeabilization을 유도하였다. 그리고 0.5% BSA로 1시간 동안 블로킹한 다음, DAPI를 첨가한 후 형광현미경(Olympus IX71, Hamburg, Germany)을 이용해 형광신호를 관찰하였다.
- 통계분석
UV 무처리군과 UV 처리군간 실험 결과에 대한 유의성은 One way ANOVA (SPSS for Windows, Release 10.10, Standard Version, Chicago, IL, USA)를 이용하여 분석하였고, UV 처리군 중에서 UV+vehicle 처리군과 UV+SBFE 처리군간의 유의성은 post-hoc test (SPSS for Windows, Release 10.10, Standard Version)를 이용하여 분석하였다. p -value<0.05를 유의성이 있는 값으로 인정하였으며, 실험결과는 means ± SD로 제시하였다.
결 과
- 세포사를 유도하는 최적 UV 조사량의 결정
먼저, 세포사를 유도할 수 있는 최적 UV조사량을 설정하기 위해, 200 mJ부터 800 mJ까지 4가지 조사량으로 UV-B를 조사한 후 MTT분석을 실시하였다. 그 결과, 200 mJ에서는 세포사가 관찰되지 않았으나 400 mJ부터 조사량의 증가에 따라 세포 생존율이 감소하면서 죽은 세포가 증가하였다( Fig. 1A ). 이러한 결과를 바탕으로 세포사를 유발할 수 있는 최소 UV조사량은 400 mJ로 설정하여 효능평가 실험을 실시하였다.
- SBFE가 UV조사로 유도된 SK-MEL-2세포의 생존율에 미치는 영향
SBFE가 UV조사에 의해 유도된 SK-MEL-2세포의 세포사에 미치는 영향을 시험하기 위해, UV조사장치를 이용하여 세포사를 유도한 뒤 SBFE를 처리하여 MTT분석을 실시하였다. 그 결과, UV + vehicle 처리군은 UV 무처리군에 비하여 유의적으로 세포생존율이 감소하였으나 SBFE를 처리한 UV + LoC, UV + MeC, UV + HiC 처리군에서는 세포생존율이 증가하였다( Fig. 1B ). 따라서 이러한 실험 결과는 SBFE가 농도 의존적인 변화는 적으나 분석된 모든 농도에서 UV조사에 의해서 유도된 SK-MEL-2세포의 세포사를 회복시켜주는 효과를 나타냄을 제시하고 있다.
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Effects of SBFE on the cell viability. (A) Determination of optimum UV dose. After treatment of the different UV doses, the viability of cells was measured using MTT assays, while their morphology was observed at 100x magnification. (B) Screening of SBFE effect. After UV radiation and SBFE, cells were further incubated in 37℃ incubator during 24 hr and cellular morphology was observed at 100x magnification. Also, cell viability was measured via the same method. The values of data represented the means ± SD of three experiments. a, p<0.05 is the significance level relative to the UV untreated group. b, p<0.05 is the significance level relative to the UV+vehicle treated group.
- SBFE가 UV조사로 유도된 SK-MEL-2세포의 세포사에 미치는 영향
UV조사에 의해 유도된 SK-MEL-2세포의 세포사에 미치는 SBFE의 기능을 분석하기 위해 DAPI염색과 FACS분석을 실시하였다. 그 결과, UV + vehicle 처리군에서는 UV 무처리군에 비하여 DAPI에 염색되는 세포의 수가 크게 증가하였다. 그러나 DAPI에 의해 염색된 세포의 수는 UV + vehicle 군에 비하여 UV + LoC 처리군 혹은 UV + MeC 처리군에서 유의적인 변화를 나타내지 않았지만 UV + HiC 군에서는 유의적으로 감소하는 효과를 나타내었다. 또한, 단편화된 핵의 모양도 유사한 양상으로 감소하였다( Fig. 2A ).
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Observation of SBFE on the DAPI, PI and Annexin V stained cells. DAPI staining and FACS analysis were applicated to identify the mechanism of cells death. (A) Immunofluorescence images. Cells (1×106) treated with vehicle or SBFE during 24 h were stained with DAPI in order to detect nucleus changes. The cellular morphology was observed under a fluorescent microscope (original magnification ×40). (B) FACS data represented four independent section (M1: debris, M2: necrotizing cells, M3: intact cells, M4: apoptotic cells). The X axis shows the intensity of Annexin V-FITC fluorescence and the Y axis shows PI fluorescence. The values of data represented the means ± SD of three experiments. a, p<0.05 is the significance level relative to the UV untreated group. b, p<0.05 is the significance level relative to the UV + vehicle treated group.
더불어, UV로 유도된 SK-MEL-2세포의 세포자살 및 사멸 세포에 미치는 SFBE의 영향을 분석하기 위하여 세포를 Annexin V와 PI로 염색한 후 FACS분석을 실시하였다. FACS 분석 결과, UV를 처리한 모든 군에서 PI에 의해 염색되는 세포들의 수가 급속히 증가하였으나, UV + SBFE 처리군에서 농도 증가에 따라 점진적으로 감소하였으며, UV + HiC 처리군에서 가장 높은 감소율을 나타내었다. 또한, Annexin V로 염색된 세포는 UV조사에 의해 급격히 증가하였으나, 오직 UV + HiC 처리군에서만 유의적인 감소를 나타내었다. 그러나, UV + SBFE 처리군에서 Annexin V와 PI가 염색된 세포의 수는 UV + vehicle 처리군과 비교하여 유의적인 감소를 나타내지 않았으며, 오히려 UV + LoC 처리군과 UV + MeC 처리군은 일시적인 증가를 나타내었다( Fig. 2B ). 이러한 결과는 SBFE가 비록 모든 농도에서 SK-MEL-2세포의 세포사를 억제하는 효과를 나타내지 않으나 고농도인 UV + HiC 처리군에서 세포사를 억제하는 효과를 나타냄을 제시하고 있다.
- SBFE가 UV조사로 유도된 세포사관련 단백질의 발현에 미치는 영향
UV조사에 의해 유도된 SK-MEL-2세포의 세포사와 관련된 단백질의 발현에 미치는 SBFE의 효능을 분석하기 위해, 3가지 단백질(caspase-3, Bax, Bcl-2)의 발현 변화를 western blot을 이용하여 분석하였다. 그 결과, pro-caspase-3의 발현양은 UV+vehicle 처리군에서 UV 무처리군에 비하여 크게 감소하였으나 농도별로 SBFE를 처리한 그룹에서는 변화가 나타나지 않았다. 또한, active-caspase-3의 발현양은 비록 UV+vehicle 처리군에서 약간 감소하였으나 전체적으로 매우 유사한 발현 양을 나타내었으므로 SBFE에 의한 caspase-3의 유의적인 변화가 관찰되지 않았다( Fig. 3 ). 한편, 세포사와 연관된 여러 가지 단백질 중에서, Bcl-2는 다양한 스트레스에 의해 유발된 세포자살을 억제하는 기능을 수행하고, Bax는 세포자살을 촉진한다[ 27 , 37 ]. UV조사에 의해 세포사가 유도된 SK-MEL-2 세포에서 Bax와 Bcl-2 단백질의 발현은 모두 감소 하였으나 SBFE의 처리는 UV+vehicle 처리군에 비하여 이들 단백질의 발현 변화를 유도하였다. Bcl-2단백질은 SBFE의 처리에 의해 더욱 감소하였으며, Bax단백질은 SBFE의 처리에 의해 증가되었다( Fig. 3 ). 이러한 결과는 SBFE은 Bax단백질의 정상회복을 촉진하지만 Bcl-2단백질의 감소를 유도함을 제시하고 있다.
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Alteration on the expression of cell death related proteins. (A) Total cell lysates were prepared from 5x106 cells treated with vehicle or SBFE after UV radiation. Fifty micrograms of protein per sample were immunoblotted with antibodies for each protein. (B) The intensity of each band was determined using an imaging densitometer, and then the relative level of each protein was calculated based on the intensity of actin protein. Three samples were assayed in triplicate via Western blotting. The values are expressed as the means ± SD. a, p<0.05 is the significance level relative to the UV untreated group. b, p<0.05 is the significance level relative to the UV+vehicle treated group.
고 찰
현재까지, 인간의 대사성질환 등에 대한 Sea buckthorn의 다양한 치료 효과에 대한 보고에도 불구하고, UV조사에 의해 유발되는 세포사를 효과적으로 완화시킬 수 있는 가능성에 대한 연구는 없었다. 따라서, 본 연구에서 피부노화와 세포사를 유발하는 UV와 Sea buckthorn의 기능의 상관관계를 규명하는 기초연구로서 매우 중요한 결과를 제시하고자 하였다.
일반적으로 UV-B는 섬유아세포, 케라틴생성세포, 멜라닌 세포와 같은 피부세포에서 free radical 또는 ROS 생산을 유도함으로서 DNA 손상으로 세포파괴를 촉진한다[ 33 ]. 이러한 손상은 항산화능을 갖는 물질에 의해 효과적으로 억제될 수 있으며, 다양한 종류의 천연 항산화물질은 Sea buckthorn에 포함되어 있다[ 31 ]. 특히, Sea buckthorn의 열매는 ascorbic acid (150-14,000 mg/kg), tocopherols (1,600 mg/kg), carotenoids (150-430 mg/kg)을 포함하고 있으며[ 14 ], Sea buckthorn 열매를 이용해 제조한 주스에 포함된 ascorbic acid (1.22 g/l)는 전체 항산화능의 75%에 기여하는 것으로 알려져 있다[ 41 ]. 또한, sea buckthorn 열매는 비타민 A, C, E, K 및 carotenoids, organic acids가 풍부하며[ 8 , 19 , 29 , 39 ], 강한 항산화 효과[ 11 , 34 ] 및 광보호효과[ 13 ]를 나타낸다. 이러한 연구의 일환으로, 본 연구에서는 UV-B에 의한 손상에 대항하는 SBFE의 효과를 증명하기 위해 흑색종 세포주인 SK-MEL-2세포에 UV-B를 노출한 뒤 SBFE를 처리하여 다양한 세포사관련 인자들의 변화를 관찰하였다. 이전의 연구결과와 유사하게, SBFE는 UV조사에 의해서 유도된 세포사를 억제하는 효과가 관찰되었다. 그러나, SBFE의 항산화효과에 대한 세부적인 지표들은 일부 차이가 있었으며, 활성화된 caspase-3의 발현은 큰 변화를 관찰할 수 없었다. 따라서, SBFE를 이용한 in vitro 결과와 이전에 실험동물을 이용하여 수행된 in vivo 연구결과[ 18 ]를 기반으로 사람의 피부에 발생하는 광노화(photoaging)를 효과적으로 억제하는 치료제의 후보물질로서 높은 가능성을 보여주고 있다.
많은 항산화 및 항광노화 화합물들은 피부의 광손상에 효과적으로 작용한다. Corallina pilulifera 의 메탄올 추출물은 우수한 항산화성을 보이며, 인간 진피세포에 UV-A로 유도된 산화적 스트레스로부터 보호하는 효과를 나타낸다[ 28 ]. 또한, Fraxinus chinensis 에서 분리된 aesculetin는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)의 강한 소거능과 UV-A가 방사된 인간 진피 섬유아세포에서 활성산소의 소거능을 보임이 보고되었다[ 24 ]. 2,2-dithiocinnamate 유도체(DTCD)와 2,2-dithio(DTBD) 또는 2-thiobenzoate 유도체(TBD)의 계열은 새로운 항광노화 물질로 합성되는데, 이는 라디칼 소거능과 Matrix metalloproteinases-1 (MMP-1) 억제능을 보인다[ 9 ]. 최근에, 많은 연구들이 피부노화에 대한 새로운 치료약물의 발전과 평가에 초점을 맞추고 있다. 본 연구결과는 이전의 연구결과와 유사하게 항산화 물질이 UV에 의해서 유도된 손상을 억제하는 효과가 있음을 보여주고 있다. 그러나, 항산화 물질의 구성은 차이가 있으며 분석방법이나 요인들도 차이가 있다. 비록 본 연구에서 산화적 스트레스에 대한 분석을 수행하지 않았으나 SBFE가 UV-B에 의해 유도되는 세포사를 억제함을 보여주는 여러 가지 근거를 제시하고 있어 SBFE의 항산화 물질로서의 가능성을 제시하고 있다.
현재까지, Sea buckthorn의 어떠한 추출물이 세포에서 UV 조사에 대한 회복효과를 나타냄을 밝히는 연구는 거의 수행되지 않았다. 유일한 연구는 SBF, 블루베리 추출물, 콜라겐의 혼합물을 이용하여 UV조사에 의해 유도된 hairless 마우스의 피부노화에 대한 치료효과를 연구한 것이다. 이 연구에서 이들 혼합물은 수분함량, MMP 발현, Superoxide dismutases(SOD)활성의 조절을 통하여 피부노화를 치료하는 효과를 나타내었다[ 18 ]. 본 연구에서는 SK-MEL-2세포를 이용하여 UV조사에 의해 유도된 세포사에 미치는 SBFE의 영향을 연구하였으며, 고농도의 SBFE가 세포사를 회복시키는 효과가 있음을 제시하고 있다. 따라서 본 연구는 Sea buckthorn의 기능에 대한 새로운 증거를 제시하는 연구로 의미가 있을 것으로 사료된다.
Bcl-2 family단백질은 세포사를 조절하는 단백질로서 전체 25개의 유전자를 포함하며, 이들은 세포사를 촉진하는 단백질(Bax, BAD, Bak, Bok)과 세포사를 억제하는 단백질(Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w)로 분류된다 [7] . 일반적으로 UV조사된 세포에서 Bax와 Bcl-2단백질의 발현은 조사량에 따라 다양하게 나타난다. 낮은 조사량(30 mJ)이 처리된 경우에는 Bax와 Bcl-2단백질의 발현은 대조군에 비하여 증가하지만, 50 mJ 이상의 높은 조사량에서는 이들 단백질의 발현이 감소하였다[ 26 ]. 유사한 실험결과는 본 실험의 western blot분석에서도 관찰되었다. 본 실험에서는 50 mJ보다 높은 400 mJ을 처리하였고, 이들 두 가지 단백질의 발현은 UV+vehicle 처리군에서 유의적으로 감소하였다.
결론적으로 본 연구에서는 SBFE가 UV에 의해 유도된 세포사를 억제 혹은 회복시키는 능력이 있음을 제시하고 있다. 따라서, 이러한 결과는 UV조사에 의한 피부노화를 억제하는 새로운 후보물질을 찾고, 이들의 기능을 규명하는 과정에 중요한 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
Acknowledgements
본 연구는 지식경제부가 부산대학교 생물자원웰빙제품 (RIS)사업단에 제공된 연구비에 의해 수행되었습니다.
References
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