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Isolation and Identification of a Photosensitizer from Pueraria thunbergiana Leaves that Induces Apoptosis in SK-HEP-1 Cells
Isolation and Identification of a Photosensitizer from Pueraria thunbergiana Leaves that Induces Apoptosis in SK-HEP-1 Cells
Journal of Life Science. 2014. Mar, 24(3): 242-251
Copyright © 2014, Korean Society of Life Science
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
  • Received : December 11, 2013
  • Accepted : March 01, 2014
  • Published : March 30, 2014
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준영 이
Department of Clinical Pathology, Masan University, Changwon 630-729, Korea
미경 김
Department of Life Science & Environmental Biochemistry, Pusan National University, Miryang 627-706, Korea
준영 하
Department of Life Science & Environmental Biochemistry, Pusan National University, Miryang 627-706, Korea
용균 김
Department of Life Science & Environmental Biochemistry, Pusan National University, Miryang 627-706, Korea
창오 홍
Department of Life Science & Environmental Biochemistry, Pusan National University, Miryang 627-706, Korea
소영 김
Department of Convergence Medicine and Pharmaceutical Biosciences, Graduate School, Chung-Ang University, Seoul 156-756, Korea
충환 김
Department of Clinical Pathology, Masan University, Changwon 630-729, Korea
근기 김
Department of Life Science & Environmental Biochemistry, Pusan National University, Miryang 627-706, Korea
kkkim@pusan.ac.kr

Abstract
The objective of this study was to isolate a photosensitizer from Pueraria thunbergiana leaves that induces apoptosis in SK-HEP-1 cells. Column chromatography and thin layer chromatography were used to isolate active compounds from extracts of P. thunbergiana leaves. The structures of the isolated compounds were determined by 1D-NMR, 2D-NMR, and FAB-mass spectroscopy. A substance, named M4-3, was purified from the leaves of P. thunbergiana using various chromatography methods, and the absorbance of the substance was measured. The absorbance was highest at 410 nm, suggesting that the M4-3 substance was a different compound from chlorophyll a and b, which absorb at 410, 502, 533, and 607 nm. Further analyses revealed that the M4-3 compound was a 13 2 -hydoxy pheophorbide, a methyl ester with a molecular weight of 662. M4-3 was identified as a derivative compound of pheophorbide, with a structure that magnesium comes away from the porphyrin ring. The results of the analysis of the cytotoxicity of the M4-3 substance against the SK-HEP-1 cells revealed that it inhibited rates of cell growth by 40% and 80% at a concentration of 0.04 μM and 0.08 μM, respectively. The M4-3 compound was found to be a photosensitizer for cytotoxicity because it was appeared only in light condition as examining activity in different irradiation conditions (light condition and nonlight condition) under the same concentration. Analysis of morphological changes in the cells following cell death induced by exposure to the M4-3 substance reveled representative phenomena of apoptosis (nuclear condensation, vesicle formation, and fragmentation of DNA). The induction of apoptosis was attributed to the compound’s photodynamic activity.
Keywords
서 론
암 치료법에는 수술치료법, 약물치료법 및 방사선치료법 등이 있으며, 이런 치료방법은 단독치료와 병행치료를 하므로 치료효과는 좋지만 치료에 의해 발생하는 많은 부작용과 경제적인 부담이 환자에게 커다란 고통이 된다. 하지만 광역학치료법은 수술치료법과 달리 전신요법이 아니므로 부작용이 거의 없고, 경제적인 부담이 적어 반복시술이 가능하며 환자의 고통을 덜어주는 장점이 있다. 그래서 최근에는 폐암, 식도암, 자궁경부암의 치료에 광역학치료법이 많이 행해지고 있다. 광역학치료(Photodynamic Therapy)는 기존의 암치료법과는 달리 광역학활성을 갖는 광과민성물질을 처리하고 일정시간이 지난 후에 광케이블을 이용해 광을 조사하게 되면 체내의 풍부한 산소를 활성산소로 전환시켜 활성산소가 암세포를 파괴하게 하는 새로운 암치료 방법이다 [3] . 암세포가 사멸되는 형태를 보면 apoptosis와 necrosis기작에 의해 암세포가 사멸되는데, necrosis는 핵이 축소되고, 미토콘드리아와 세포막이 팽창 되어 물풍선처럼 부풀어 올라 터지게 되므로 암세포의 내용물들이 유출되어 정상세포에 영향을 미치며, 외부적으로는 inflammation과 swelling 현상으로 나타난다 [7] . Apoptosis는 세포가 축소되고, 핵이 응축되면서 DNA가 caspase에 의해 단편화되며, 세포는 apoptotic body의 소낭구조물로 분열 되어 대식세포의 식작용으로 제거된다. Necrosis는 비생리적인 조건에서 일어나는 강제적인 세포사라면 apoptosis는 생리적인 조건에서 일어나는 프로그램 세포사이기 때문에 다른 부작용 없이 암조직이 제거된다. 광역학치료에 사용되는 광과민성 물질은 빛을 조사하지 않은 암조건에서는 높은 농도에서도 세포독성을 거의 나타내지 않지만, 특정 파장의 빛을 조사하면 excitation 상태로 전환되면서 활성산소를 생성해 내면서 세포독성을 나타내는 치료제이다. 그러나 기존에 사용 중인 광과민성물질인 hematophorphyrin 유도체(HpD)들은 체내에서 배설되는 시간이 길어 광역학치료 시 완전히 대사될 때까지 빛을 보지 못하는 단점을 가지고 있었다 [18] . 이런 단점과 부작용을 줄이고 치료효과를 높이기 위해서 최근에는 더 좋은 반응성을 가지고, 체내에서 빠른 대사를 보이는 광과민성물질 개발의 필요성이 대두되어 chlorophyll 유도체(CpD)를 이용한 차세대 광과민성물질을 개발하기 위하여 물리화학적 특성과 작용기전에 대한 연구가 이루어지고 있다 [10] .
약용식물인 도라지( Platycodon grandiflorum ), 생강( Zingiber officinale ), 칡( Pueraria thunbergiana ) 등의 뿌리와 잎을 이용하여 광역학활성을 조사한 결과 칡 잎에서 가장 활성이 높게 나타나 porphyrin구조를 갖는 광과민성물질을 분리하기 위하여 연구를 진행하였다. 칡은 콩과 다년생의 활엽 덩굴성 식물로 한국, 중국, 만주, 대만, 일본 등을 포함한 극동아시아의 온대영역에 폭넓게 분포하며, 칡뿌리는 한의학에서 갈근이라는 생약명으로 해열, 혈압강하, 뇌혈류량 증가, 관상동맥 확장, 항부정맥, 평활근 이완, 혈소판응집억제작용 등의 효능을 갖고 있어[ 9 , 20 ], 한국, 중국, 일본 등지에서 중요한 약용식물로 사용되어왔다. 칡의 성분에 대한 연구로는 칡뿌리에 대한 연구로 주성분은 전분이고 이외에 isoflavone계 성분인 puerarin (2.0%이상), puerarinxyloside, daidzein 및 daidzin과 β-sitisterol, arachidonic acid를 함유하고 있는 것으로 알려져 있고, 칡꽃의 성분으로는 kakkalide, kakkatin, kaikasaponon III, soyasaponin I, daidzein, daidzin, genistein, genistin, rutin, quercetin, biochanin A, formononetin, ononin 등이 있으며, 칡 잎의 성분은 kaikasaponin III, daidzin, genistin, rutin, robinin (0.17~0.35%), nicotiflorin 등이 보고되어 있다[ 16 , 17 , 19 ]. 칡뿌리의 flavonoid 성분은 관상동맥 확장, 심장 근육의 산소 소모량 감소, 혈소판 응집 억제에 보고되어 있으며 [25] , polyphenol류인 catechin의 항산화 효과 [13] 외에 해열, 해독[ 5 , 11 ]등 간장병과 관련한 약리작용 등이 알려져 있다[ 1 , 8 , 13 , 21 , 24 ]. 또 다른 약리활성에 대한 연구로 Helicobacter pylori 균의 저해활성 [2] , 장내세균의 활성화 효과 [23] , 항산화 효과 [22] , 알코올성 간 손상 보호효과 [12] , allelopathy 작용 [6] , 해독작용, 면역력 증강 등의 활성을 나타내는 것으로 보고되었다. 최근 들어 칡에는 에스트로겐 유사물질인 phytoestrogen이 콩보다 30배, 석류보다는 625배나 많이 함유되어있어 여성갱년기증후군 치료에 좋은 효과가 있는 것으로 보고되고 있으나 [14] , 칡잎 성분에 대한 생리활성 연구보고는 없다.
연구는 국내에 자생을 하고 있는 칡 잎의 용매추출물로부터 광역학활성이 있는 광과민성물질을 분리하여 구조를 동정하고, 간암세포(SK-HEP-1)에 대한 광역학활성을 조사하여, 광과민성물질을 개발하기 위한 연구결과를 보고하고자 한다.
재료 및 방법
- 시약 및 기기
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), FBS (fetal bovine serum), trypsin-EDTA는 HyClone (Logan, UT, USA)에서 구입하였고, penicillin과 streptomycin은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 형광염료 SYTO ® 13는 Invitrogen (Camarillo, CA, USA)에서 MTT assay kit는 Cell Counting Kit-8 (DOJINDO, Kumamoto, Japan)에서 구입하였다.
분리 정제를 위해서 open column chromatography는 normal phase silica gel (230~400 mesh, Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였으며, thin layer chromatography (TLC) 는 Merck 25 DC-Alufolien Kieselgel 60 F 254 (20×20 cm, 0.2 mm)를 사용하였다. 물질의 분리도를 확인하기 위해서 고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography (HPLC), Waters, New Castle, USA) 분석을 실시하였고, 구조 동정을 위해서 핵자기공명분광기(nuclear magnetic resonance, NMR)은 Varian 500 MHz (Inova 500 Spectrometer, Varian, Palo Alto, CA, USA)로 측정하였으며, NMR용 CDCl 3 은 Sigma Aldrich 제품을 사용하였다. 그리고 분자량의 측정을 위해서는 FAB-MS (JMS 700, Jeol, Tokyo, Japan) 분석을 하였다. 암세포 배양은 MCO-18AIC (SANYO, Osaka, Japan)을 이용하였고, 세포관찰은 phase-contrast microscope (Nikon, Tokyo, Japan)를 이용하였으며, 효소활성 등은 ELISA reader (Model 680, Bio-Rad, CA, USA)를 사용하였다.
- 물질추출
칡 잎은 2008년 8월, 경남 창원시 진해구에서 채취하여 서늘한 그늘에서 3주간 음건하고, 뿌리와 잎으로 나누어 분쇄기로 분쇄한 후 중량 기준 10배량의 methanol을 넣어 상온에서 3일 동안 정치시킨 후, 150~180 rpm으로 3시간 동안 진탕 추출하여 filter paper (5C. 110 mm, Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan)로 여과하였다. 추출은 3회 반복 추출하였으며, 여과액은 진공농축기(Rotary vacuum evaporator, EYELA N-1000, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하여 냉장 보관하면서 실험에 이용을 하였다.
- 세포배양
실험에 사용한 간암세포주 SK-HEP-1은 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB30052 ® )으로부터 분양 받았으며, 암세포배양을 위해 90% DMEM, 10% FBS에 1%의 penicillin streptomycin이 포함된 성장배지를 사용하여 37℃, 5% CO 2 조건 하에서 배양하였다. 세포성장에 따른 과밀도 현상을 방지하기 위하여 세포의 생육정도를 관찰하면서 계대배양을 실시하여 적정수의 세포를 유지하였다.
- 세포의 형태 변화
SK-HEP-1의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 세포 수를 2×10 5 cells/ml로 조정하고 48 well plate에 0.2 ml씩 첨가하여 24시간 배양하였다. 칡 잎에서 얻은 용매추출물을 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma Aldrich)에 용해시켜 100 µg/ml 농도가 되게 조절한 다음 각 well에 DMSO 최종농도가 0.5% 가 되게 처리하였다. 광역학활성을 조사하기 위하여, 추출물을 처리하고 4시간이 경과한 후에 광조건의 plate에는 광을 10분간 조사시키고, 광을 조사한지 12, 24시간 후에 phase-contrast microscope를 이용하여 변화된 세포주의 형태적 특징을 관찰하였다. 암조건의 plate는 물질을 처리한 후 계속 암상태로 배양한 후 12, 24시간 후에 동일한 방법으로 현미경 관찰을 실시하였다. 1차 활성검정에서 칡 잎의 용매추출물을 처리하고 광을 조사한 곳에서 광역학활성이 나타나 물질의 분리와 정제에 이용하였다. 물질의 분리단계와 순수분리한 M4-3 compound 생물검정법도 식물체 추출물 검정법과 동일하게 하였으며, 순수분리한 M4-3 compound는 DMSO에 용해시켜 0.1, 0.5, 1, 5 µg/200 µl 농도로 각 well에 DMSO 최종 농도가 0.5%가 되게 처리하여 광역학활성을 조사하였다.
- 광과민성물질의 순수분리
광역학 활성물질의 분리정제를 위해서 추출물을 먼저 silica gel column을 실시하였다. 칡잎추출물은 hexane, hexane : ethyl acetate (EtOAc)(5:1→5:5), MeOH 순으로 용매의 극성을 높여가면서 순차적으로 용출하여 61개의 분획물을 얻었으며 물질분리 pattern을 확인하기 위하여 TLC를 실시하여 R f 값이 유사한 것을 그룹으로 하여 6개 그룹으로 나누어 회수하였다. Column 분획물로부터 광역학활성을 갖는 물질을 순수분리하기 위하여 활성을 조사해가며 3번의 TLC로서( Fig. 1 ) 물질을 순수분리하였다. 순수분리한 물질의 불순물함유를 조사하기 위하여 TLC와 HPLC분석으로 확인했으며( Fig. 3 ), 순수도가 확인된 물질은 구조동정과 활성실험을 실시하였다. HPLC 분석조건은 Table 1 에 나타냈으며, 용매 gradient program은 MeOH과 EtOAc를 이용하여 실시하였다. Injection은 MeOH 100% 조건으로 하여 5분까지 EtOAc를 20%까지 상승시키고, 20분까지는 EtOAc를 80%까지 상승시켰으며, 22분까지는 100% EtOAc가 되게 EtOAc농도를 증가시키며 분석을 실시하였다. 각 분리 단계별 SK-HEP-1 세포에 광역학활성에 의한 세포독성이 있는지 확인하기 위해 48 well plate에 2×10 5 cells/ml로 well 당 0.2 ml씩 첨가하여 24시간 배양한 다음, 처리할 물질을 DMSO에 용해시켜 0.1, 0.5, 1, 5 µg 농도로 각각 처리하였다.
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Schematic diagram of isolation and identification process of photosensitizer from MeOH extract of P. thunbergiana leaves.
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TLC developing pattern and HPLC analysis chromatogram of purified photosensitizer (M4-3 compound). (A) Purified M4-3 compound on a TLC plate (Rf 0.43, Developing solvent: Benzene : EtOAc(4:1)), (B) Purified M4-3 compound of HPLC chromatogram (Rt 6.546 min)
HPLC operating condition of M4-3 compound analysis
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HPLC operating condition of M4-3 compound analysis
- 광과민성물질의 구조동정
순수분리한 광과민성물질의 구조분석을 위해 질량분석은 fast atom bombardment (FAB) mass 방법으로 분자량을 측정하였으며, 물질의 기본 골격을 조사하기 위하여 물질을 CDCl 3 에 녹여 1D-NMR ( 1 H-NMR, 13 C-NMR)과 2D-NMR (Homo-Cosy, HSQC, HMBC)을 실시하였다.
- MTT assay
세포독성을 측정하기 위한 MTT assay는 부유세포를 5×10 3 cells/ml로 세포수를 조정하여 96 well plate에 0.2 ml씩 첨가하고 24시간 동안 37℃, 5% CO 2 조건으로 incubator에서 배양하였다. 24시간 배양한 후 M4-3 compound를 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 µM 농도로 각각 처리한 다음, 4시간 후에 광조건 plate에만 광을 10분간 조사하고, 24시간 후에 광조건과 암조건의 plate에 MTT assay를 실시하였다. 광조건과 암조건의 plate 에 MTT (5 mg/ml) 용액을 첨가하여 4시간 배양한 다음, formazan crystal형성이 확인되면, 배지를 완전히 제거하고 well 바닥에 형성된 formazan을 녹이기 위해 100 µl의 DMSO를 첨가하여, ELISA reader를 이용해 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복하여 평균값으로 얻었다.
- 형광현미경을 이용한 세포관찰
Apoptosis가 유도되면, 세포의 모양과 핵 DNA의 모양에 변화가 일어난다. 핵 DNA 형태적 변화를 관찰하기 위하여 형광염료(SYTO ® 13)로 염색한 후에 형광현미경으로 관찰하였다. 세포 수를 1×10 6 cells/ml로 조정하고, 6 well plate에 1 ml씩 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO 2 조건으로 배양하였다. 24시간 배양 후 M4-3 compound를 DMSO에 용해시켜 0.4 µM 농도로 처리하였으며, 물질처리 후 4시간이 경과한 뒤 광조건의 plate에 광을 10분간 조사하고, 24시간 후에 세포를 scraper로 회수하였다. 원심분리하여 배양액을 제거하고 PBS(free Ca ++ , Mg ++ ) 2.5 ml과 SYTO ® 13 5 µl를 혼합하여 암 조건, 상온에서 염색시켰다. 염색 10분 후에 형광현미경(Image Analysis and Cytogenetic System, DM5500B/ DFC490/CW4000)을 이용하여 세포의 핵 DNA 형태변화를 관찰하였다.
- DNA fragmentation
Apoptosis가 유도 되었을 때 관찰되는 특징 중에 하나가 DNA fragmentation 현상이다. DNA fragmentation을 확인하기 위하여 세포를 1×10 6 cells/ml로 조정한 후, 6 well plate에 1 ml씩 첨가하고 24시간 동안 37℃, 5% CO 2 조건으로 배양하였다. M4-3 compound는 DMSO에 용해시켜 0.4 µM, 0.8 µM 농도로 처리(DMSO 최종농도: 0.5%)하였으며, M4-3 compound 처리 후 4시간이 경과한 뒤 광조사 조건에만 광을 10분간 조사하고, 24시간 후에 세포를 회수한다. 회수한 세포부유액을 원심분리하여 상층액을 버리고 인산완충용액으로 세척하였다. Lysis buffer (5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-100)를 ice 위에서 20분간 반응시킨 뒤 상층액에 proteinase K (Roche, Indianapolis, IN, USA)와 RNase A (Ambion, Austin, Texas, USA) 용액을 첨가하고, 37℃에서 60분간 반응시켰다. 원심분리하여 얻어진 상층액에 동량의 isopropanol을 첨가하여 원심분리하고 상층액을 제거한다. 얻어진 pellet에 70% ethanol을 넣고 현탁시킨 다음, 원심분리하여 상층을 제거하고 건조 시킨다. DNA rehydration buffer를 첨가하고 65℃에서 1시간 방치한 후 gel loading dye를 혼합한 후 1.5% agarose gel을 이용하여 100 V로 30분간 전기영동한 다음 ethidium bromide (EtBr, Sigma)로 염색하고 ultra violet (UV) 하에서 관찰하였다.
결 과
- 용매추출물의 광과민성 활성 조사
칡 잎을 MeOH로 추출하여 농축한 다음, MeOH과 CHCl 3 으로 각각 녹여 용해물을 얻어 SK-HEP-1세포에 대한 세포독성을 조사한 결과, 칡 잎의 MeOH 용해물을 처리하고, 광을 조사한 곳에서 간암세포가 심하게 손상을 받았으며, 광을 조사하지 않은 곳에서는 세포손상이 없는 것을 확인되었기 때문에 칡 잎의 MeOH용해물에서 광과민성물질에 의한 광역학활성이 있는 것을 알 수 있었다.
- 세포의 형태 변화
SK-HEP-1세포에 대한 M4-3 compound의 광역학활성을 조사하기 위하여, 물질을 처리한 후에 세포의 형태학적 변화가 어떻게 일어나는지 관찰하였다. SK-HEP-1 세포는 흡착세포이기 때문에 세포를 분주한 후 24시간이 지나면 대부분의 세포가 well에 착상을 하게 되는데, 무처리의 대조군은 세포가 confluent하게 well에 부착하여 정상적인 생육을 하는 반면, ADCL (2 µl/0.1 mM)을 처리한 곳은 대부분의 세포가 탈리되어 원형의 형태로 부유하는 현상을 볼 수 있었다. 그리고 well 전체에 소낭구조물과 파열된 듯한 작은 조각들이 부유하고 있는 것을 관찰할 수 있었다. M4-3 compound를 처리하고, 광을 조사한 well에서는 처리농도에 따라 세포손상에 차이를 보였으나, 광을 조사하지 않은 암조건에서는 대조구처럼 정상적인 생육을 하였다. M4-3 compound를 0.1 µg과 0.5 µg을 처리한 처리구에서는 커다란 변화를 볼 수 없었고, 1 µg을 처리한 처리구에서는 50%의 세포가 apoptosis가 유도될 때의 전형적인 형태, 즉 세포 모양이 길쭉해지고, well에서 탈리도 되었으며, 소낭구조물이 형성되는 현상이 나타났다. 5 µg을 처리한 처리구에서는 12시간 이전에 ADCL을 처리한 곳과 같이 대부분의 세포가 부유되고, 형태적인 변화를 심하게 일으켜 광역학활성에 의한 apoptosis 가 높게 일어난 것을 확인할 수 있었다. ADCL의 경우에는 광조건과 암조건에서 동일하게 세포 손상을 일으키는 것으로 볼 수 있었고, M4-3 물질은 광을 조사한 곳에서만 apoptosis가 유도되는 것으로 보아 M4-3물질은 광과민성 물질로서 광조사에 따라 세포에 독성을 일으키는 것을 확인하였다.
- 광과민성물질의 순수분리
칡잎 추출물로부터 apoptosis 유도물질을 분리하기 위하여 1차로 column chromatography를 실시한 결과 61개의 분획물을 얻었으며, 분획물의 물질 분리패턴을 TLC로 확인한 결과는 Fig. 2 와 같다. A는 UV short wave (254 nm)로 조사했을 때 나타난 물질의 전개패턴이고, B는 UV long wave (365 nm)로 조사했을 때 물질의 전개패턴이다. Visible 상태에서도 물질의 전개패턴을 확인할 수 있었는데 254 nm에서 관찰된 것과 비슷한 패턴으로 확인되었다. 확인된 물질의 분리패턴에 따라 R f 치가 비슷한 물질들을 같은 그룹으로 하여 6개의 그룹 M1-1(R f 0.88~1.0), M1-2(R f 0.71), M1-3(R f 0.58~0.62), M1-4(R f 0.4~ 0.49), M1-5(R f 0.18~0.44), M1-6(R f 0~0.1)으로 나누었고, 6개 그룹의 물질들을 이용하여 SK-HEP-1세포에 대해 광역학활성을 조사하였다. 그 결과 M1-5그룹의 물질이 SK-HEP-1세포를 심하게 손상시키는 것을 확인할 수 있었다. 처리한 물질에 의한 세포독성은 세포가 사멸되거나 다양한 형태로 형태적인 변화가 일어나는 것이 전형적인 현상이다. 세포가 사멸되는 대표적인 경우는 apoptosis와 necrosis현상으로 볼 수 있는데, apoptosis의 경우는 세포가 축소된 후 소낭구조로 되고 소낭 안에 밀도가 높은 물질들이 검은 입자로 현미경에서 apoptotic body가 관찰된다. Necrosis의 경우에는 세포가 물의 endocytosis에 의해 세포소기관들은 한쪽 극으로 몰려있고, 빈 공백을 갖는 큰 풍선처럼 부풀어진 것을 확인할 수 있다. 칡잎 추출물의 1차 컬럼에서 얻은 M1-5분획물을 처리한 곳에서 apoptosis에 의한 apoptotic body 들을 확인 할 수 있었는데, 비정상적인 세포모양을 하는 것들과 세포구조물이 파괴되어 이물질 같은 것들이 well에 가득한 것을 확인할 수 있었다. 또 세포가 물풍선처럼 부풀어 오른 모양의 세포들도 확인할 수 있어 M1-5를 처리한 곳에서 apoptosis와 necrosis가 동시에 일어난 것으로 추정할 수 있었다. M1-4와 M1-6의 분획물을 처리한 곳에서도 세포의 형태가 기형을 나타난 것을 확인할 수 있어 활성을 나타내는 물질이 M1-5를 중심으로 전후로 일부 함유된 것을 판단하였다. 활성이 확인된 M1-5분획물을 회수하여 SK-HEP-1에 독성을 나타내는 물질을 순수분리하기 위하여 3차에 걸쳐 TLC를 실시하였으며, 분리과정에서 회수한 물질을 처리한 SK-HEP-1세포는 apoptosis의 전형적인 형태학적 특성이 나타났고, 광을 조사하지 않은 곳에서 세포손상이 없었으므로 광역학활성에 의한 apoptosis 유도라는 것을 확인할 수 있었다. Column과 TLC로서 순수분리한 물질은 chloroform에 용해성이 뛰어났으며 용해시켰을 때 dark green의 색을 띄었다. Column과 3차례의 TLC로 얻어진 물질은 구조동정과 apoptosis 유도활성을 농도에 따른 변화를 확인하기 위하여 순수 분리정도를 TLC와 HPLC로 확인하였다. TLC분석결과 R f 0.43에서 single spot를 확인되었으며( Fig. 3A ), HPLC로 분석한 결과는 Fig. 3B 와 같다. Methanol과 ethyl acetate 두 용매를 gradient system으로 분석한 결과 R t 6.546에서 분리한 물질의 peak를 확인할 수 있었고, R t 5.68과 5.91의 작은 peak는 물질을 용해시킬 때 사용한 CHCl 3 peak로 확인되었다. 분리한 물질의 흡광도를 측정한 결과 410 nm에서 최대 흡수를 보였고, 668 nm에서는 410 nm 흡수의 50% peak를 보였으며, 502, 533, 607 nm에서 작은 흡수 peak를 확인할 수 있었다. 이는 chlorophyll a, b의 흡광도와 비교하면 chlorophyll a는 430 nm와 662 nm에서 최대흡수를 나타내고, chlorophyll b 는 453 nm와 632 nm에서 최대흡수를 나타낸다. 이는 chlorophyll a와 b와는 다른 구조를 하고 있음을 나타낸다. 그리고 장파장대의 668 nm에서 흡수대를 갖는다는 것은 임상에서 암조직에 조사했을 때 조직 내로 깊이 침투할 수 있어 치료효과를 높일 수 있는 장점이 있다.
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TLC developing patterns of subfractions by 1st column chromatography of P. thunbergiana leaves MeOH extract. (A) Phenomena in the 254 nm, (B) Phenomena in the 365 nm.
- 광과민성물질의 구조 동정
칡잎에서 순수분리한 dark green 물질을 SK-HEP-1에 처리하고 광을 조사시켰을 때 광의존적으로 apoptosis 를 유도시켰다. 순수분리한 물질의 기본 골격을 확인하기 위하여 1 H-NMR과 13 C-NMR을 실시하였다. 1 H-NMR분석결과 일반적으로chlorophyll과 같은 porphyrin 환을 갖는 화합물에서 볼 수 있는 특징적인 signal중의 하나가 5개의 methine기의 signal인데, phytyl기의 methine을 제외하면 porphyrin 환주위의 methine 은 4개로 signal이 8~10 ppm 범위에서 나타나고, methylene기의 signal이 6~7 ppm에서 나타난다[ 4 , 15 ]. 순수분리한 M4-3물질의 1 H-NMR spectrum ( Table 2 ) signal을 보면 4개의 methine기가 20-H(8.639, s), 5-H(9.499, s), 10-H (9.622, s), 3 1 -H(8.029, q)에 각각 나타나는 것을 확인할 수 있어 porpyrin 환을 갖는 물질이라는 것을 확인할 수 있었다. Chlorophyll 구조에는 약 20개에 이르는 phytyl기가 존재하는데 이 phytyl는 0.5~1 ppm 부근에 multiple signal이 나타나는데 순수분리한 물질에서는 phytyl 기의 signal을 확인 할 수 없었으므로 phytyl기가 잘려나간 구조라는 것을 알 수 있었다. 그리고 chlorophyll의 porphyrin 환의 중심에는 Mg 이온이 결합하고 있는데, Mg이온은 구조적결합이 약해서 쉽게 떨어져 나가는데, Mg이온이 떨어져 나가면 NH 결합이 형성되어 minus 부분에 signal이 나타나게 된다. 분리한 물질의 1 H-NMR spectrum에서는 −1.817 ppm에 signal이 있는 것이 확인되어, Mg 이온이 탈리되어 porphyrin환에 NH가 존재하는 것을 확인하였다. 3 1 과 3 2 -vinyl carbons에 결합하고 있는 −H은 3 1 -H(8.029, q), 3 2 -H(H trans, 6.313, q), 3 2 -H(H cis, 6.203, q)에서 확인할 수 있었고, 7C에 −CH 3 기가 결합하고 있으면 chlorophyll a이고, −CHO가 결합하게 되면 chlorophyll b가 된다. 1 H-NMR spectrum결과 7C−CH 3 signal이 3.271 ppm에서 double let으로 나타남으로써 chlorophyll a porphyrin 구조라는 것을 알 수 있었다. 순수분리한 물질의 13 C-NMR 분석결과 36개의 carbon signal을 확인할 수 있었다. Chlorophyll의 carbon수는 55개이기 때문에 phytyl기가 잘려져 나간 특정구조를 하고 있다는 것을 알 수 있으며, 30~40 ppm 사이에 나타나는 phytyl기의 signal이 분리한 물질의 spectrum에서는 나타나지 않음으로 phytyl기가 없다는 증거로 확인할 수 있었다. Chlorophyll a의 13 C-NMR spectrum에는 13 1 -keto carbon, 13 3 -와 17 3 -carbonyl carbon, 5-, 10-, 20-methine bridge carbon, 17 5 phytyl carbon, 3 1 과 3 2 -vinyl carbons의 signal이 특징적으로 나타나는 구조이다. 분리한 물질의 13 C-NMR chemical shift값( Table 3 )을 보면 keto carbon [δ191.9(C-13 1 )], carbonyl carbon [δ172.8(C-13 3 ), δ 173.9(C-17 3 )] methine bridge carbon[δ 98.0(C-20), δ 104.3(C-5), δ107.6(C-10)], vinyl carbon[δ129.1 (C-3 1 ), δ 122.8(C-3 2 )]의 signal이 chlorophyll과 동일하게 나타났다. 그리고 광역학활성을 갖는 porphyrin 화합물에는 13 1 -C와 13 2 -C 사이에 lactone구조를 갖는 화합물들이 존재한다 [10] . 분리한 물질의 spectrum에서 13 1 -C가 191.9 ppm에 13 2 -C는 89 ppm에서 signal이 확인되어 lactone 구조가 아님을 알 수 있었다. 지금까지 1 H-NMR spectrum과 13 C-NMR spectrum 결과를 종합해보면 chlorophyll a의 기본 porphyrin 환을 갖는 구조에 Mg이온이 탈리되었고, pythyl기가 잘려진 구조를 하고 있는 것으로 확인되었다. 그리고 분리한 물질의 분자량을 측정하기 위하여 FAB-MS 분석을 실시한 결과, [M] + 622와 [M+Na] + 645의 fragment signal이 확인되어 분자량 622라는 것을 알 수 있었다. NMR과 MS data를 종합해 보면 칡 잎에서 분리한 광과민성 물질은 분자량 622의 13 2 -hydroxy pheophorbide a methyl ester로 구조를 동정하였으며, dark green의 porphyrin 화합물이라는 것을 알 수 있었다( Fig. 4 ).
1H-NMR chemical shift of M4-3 compound (500 MHz, CDCl3)
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1H-NMR chemical shift of M4-3 compound (500 MHz, CDCl3)
13C-NMR chemical shift of M4-3 compound (500MHz, CDCl3)
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13C-NMR chemical shift of M4-3 compound (500MHz, CDCl3)
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Structure of purified photosensitizer M4-3 compound (132-hydroxy pheophorbide a methyl ester).
- MTT assay
M4-3 compound가 SK-HEP-1 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해, MTT assay를 실시하였다. Fig. 5 에 나타난 바와 같이, 광을 조사한 처리구에 순수분리한 M4-3 compound의 처리농도가 높아짐에 따라 SK-HEP-1 세포의 증식억제율이 증가하여 0.04 µM 처리에서는 40%, 0.08 µM 처리에서는 80%의 증식 억제효과가 나타났다. 반면에 M4-3 compound를 동일한 농도로 처리하고, 광을 조사하지 않은 곳에 서는 암세포의 증식 억제에 변화를 일으키지 않았다. MTT assay에서 나타난 결과에서도 M4-3 compound는 광의 조사에 의해 세포독성을 나타내는 photosensitizer라는 것을 알 수 있었다.
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The growth inhibitory effects of SK-HEP-1 cells when treated with compounds M4-3. Cells were treated M4-3 compound(0.01 µM, 0.02 µM, 0.04 µM, 0.08 µM) for 4 hours, irradiated with light for 10minutes or kept in dark, and further incubated for 24 hr. The data shown are the means±SD of three independent experiments.
- 형광현미경을 이용한 세포관찰
M4-3 compound의 첨가에 따른 SK-HEP-1 세포의 사멸효과가 apoptosis와 연관성을 확인하고자 형광염료인 SYTO-13으로 염색을 실시하고, 형광현미경을 이용하여 핵의 형태를 관찰하였다. Fig. 6A 는 control로서 핵은 타원형의 온전한 형태의 균질한 형광염색을 나타냈으며, DNA 단편화를 확인할 수 없었고, 크기도 정상적인 것을 확인할 수 있었다. ADCL을 처리하면 apoptosis가 유도되어 inverted microscope 관찰에서도 세포가 소낭구조로 변형이 된 것을 확인 할 수 있고, 형광염료 SYTO-13으로 염색을 한 다음 형광현미경관찰을 하면 소낭에 단편화된 DNA를 관찰할 수 있으며, control과 비교했을 때도 작은 발광물질들의 단편을 확인할 수 있다. Fig. 6B 의 사진이 ADCL을 처리한 것으로서 전형적인 apoptotic body가 형성된 것을 확인할 수 있다. M4-3 compound를 처리하고 광을 조사한 D의 사진에서도 B와 동일하게 apoptosis가 일어나 전형적으로 관찰되는 DNA의 단편화에 따른 작은 염색질들이 매우 증가된 것이 관찰되었다. 그리고 세포가 손상을 받아 부유가 되어 부착되어 있는 세포 수가 적은 것도 확인할 수 있었다. 반면 M4-3 compound를 처리하고 광을 조사하지 않은 Fig. 6C 에서는 핵의 단편화와 응축을 관찰할 수 없었으므로 M4-3 compound의 광조사에 따른 SK-HEP-1 세포의 사멸이 apoptosis 유도에 의해 일어나는 현상으로 확인할 수 있었다( Fig. 6D ).
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Fluorescent staining of SK-HEP-1 cell. Cell were treated without (A) or with ADCL (B) or M4-3 compound 0.08 µM (C, D) for 4 hr, irradiated with light for 10 min (C) or not treated by the irradiation (D) and further incubated for 24 hr. Cells were observed under a fluorescent microscope.
- DNA fragmentation
Apoptosis의 전형적인 현상 중에 하나가 chromosomal DNA fragmentation이 일어나는 것이다 [17] . 염색질의 응축이 일어나고, caspase 활성에 따라 nucleosomal DNA가 끊어지기 때문에 전기영동을 하면 ladder 현상이 나타난다. M4-3 compound를 처리하고 광을 조사한 well의 현미경관찰에서 apoptosis가 유도되는 것을 관찰했기 때문에 DNA fragmentation현상도 일어나는지를 확인하기 위하여 M4-3 compound 를 처리하고 세포를 배양한 다음, 세포를 회수하여 DNA를 분리하고 전기영동을 실시한 결과 fragmentation 형성을 관찰하였다. 그 결과는 Fig. 7 에 나타냈으며, 무처리와 M4-3 compound를 처리하고 암조건에서 배양한 곳에서는 chromosomal DNA가 손상을 받지 않았기 때문에 DNA의 ladder 현상을 확인할 수 없었고, M4-3 compound를 처리하고 광을 조사한 곳에서는 DNA fragmentation 현상을 확인 할 수 있었다. 그리고 ADCL의 경우에는 암조건과 광조건 모두에서 DNA fragmentation 현상을 확인할 수 있었다. Fig. 7 에서 apoptosis가 유도된 곳의 DNA ladder양상이 band 끌림으로 깨끗한 ladder를 볼 수 없었다. 하지만 광을 조사한 곳은 band가 끌리는 현상을 확인할 수 있었지만 광을 조사하지 않은 곳에서 는 band가 전혀 보이지 않은 것은 control과 같았으며, M4-3 물질을 처리하고 광을 조사한 곳의 DNA 전개양상은 ADCL을 처리한 곳과 동일하게 나타난 것을 볼 수 있다. 이것은 apoptosis를 유도하는 ADCL과 동일한 활성을 나타내는 것으로 판단되며, 좀 더 명확한 DNA ladder 현상을 확인하기 위해서는 세포배양 량과 물질처리 및 DNA분리에 주의를 기울여 확인을 해볼 필요가 있을 것이다. M4-3 compound를 처리하고 광을 조사하게 되면 SK-HEP-1 세포의 증식에 치명적인 영향을 미치는데 그것은 apoptosis유도에 따른 세포사멸 기작으로 확인 되었다.
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Detection of DNA fragmentation in SK-HEP-1 cells. Cells were treated M4-3 compound (0.04 µM, 0.08 µM) for 4 hr, irradiated with light for 10 min or kept in dark, and further incubated for 24 hr. DNA was extracted with lysis buffer, treated with proteinase K and RNase for 1 hr, respectively. Fragmented DNA was electrophored on 1.5% agarose gel and visualized staining with ethidium bromide. Line Marker using 100 bp size marker.
고 찰
약용식물 P. thunbergiana 잎의 MeOH추출물로부터 MeOH과 CHCl 3 용해물을 얻고, 각 용해물을 SK-HEP-1세포에 대한 세포독성을 조사한 결과 P. thunbergiana 잎의 MeOH 추출물을 처리한 군에서 세포독성을 확인하였다. 세포독성은 광의조사에 따라 활성이 다르게 나타나 광과민성물질에 의한 광역학활성에 의한 것으로 확인할 수 있었다. P. thunbergiana 잎의 MeOH 추출물을 이용하여 column chromatography와 TLC를 실시하면서 각 단계마다 세포독성을 조사해가며 M4-3 compound를 순수 분리하였다. 분리한 물질은 TLC와 HPLC로서 purity를 확인한 결과, single spot와 single peak로 확인되었고, 구조동정을 위하여 UV spectrophotometer, 1D-NMR ( 1 H-, 13 C-), 2D-NMR (cosy, HSQC, HMBC) 및 FAB-MS 등의 분석을 실시한 결과, porphyrin 환을 가진 chlorophyll a 유도체라는 것을 알 수 있었고, porphyrin환의 중심에 Mg이온이 탈리된 것을 NH기의 signal 로 알 수 있었다. 그리고 탄소 수가 36개로 확인되어 chlorophyll 구조에 pythyl기가 잘려진 특정구조라는 것을 확인할 수 있었다. 1D-NMR과 2D-NMR spectrum과 FAB 분석 결과를 종합해서 해석한 결과 분자량 622의 13 2 - hydroxy pheophorbide a methyl ester로 동정하였다. M4-3물질을 SK-HEP-1세포에 처리하여 세포에 미치는 영향을 먼저 현미경관찰로 확인한 결과 apoptotic body 형성과 함께 세포가 사멸되는 현상을 확인하였다. 물질의 분리과정에서는 도립현미경으로 apoptosis 현상을 확인해가며 활성분획만을 회수하여 다음단계로 진행을 계속했다. 순수 분리한 후에 M4-3물질을 이용하여 형광현미경관찰, MTT assay, DNA fragmentation 등을 실시한 결과 세포의 축소, 핵의 응축 및 세포의 소낭으로 분열화 등을 관찰할 수 있었고, 형광물질을 처리하여 형광현미경으로 관찰한 결과 소낭구조물에서 DNA 단편들을 확인이 되어 염색체 DNA가 단편화 된 것을 확인할 수 있었다. 그래서 물질을 처리하고 배양한 세포로부터 DNA를 분리하여 전기영동으로 DNA ladder 현상을 확인한 결과, M4-3을 처리한 곳에서 DNA ladder 현상을 확인할 수 있어 칡 잎에서 분리한 M4-3물질은 apoptosis유도하는 것으로 결론지었다. 그리고 물질을 분리하는 과정에 물질을 처리하고 광을 조사한 것과 조사하지 않은 것에서 활성에 큰차이를 보였으며, 순수 분리한 M4-3물질을 처리하고 광조건과 암조건에서 세포사멸과 apoptosis유도현상을 조사한 결과 암조건에서는 세포가 정상적으로 생육한 반면 광조건에서는 세포가 대부분 사멸되었다. MTT assay 결과에서도 SK-HEP-1 세포배양에 M4-3 compound를 0.08µM 처리하고 광을 조사한 결과 80%의 세포증식 억제작용을 확인 하였다. 그리고 DNA ladder 실험에서도 광을 조사한 곳에서 DNA fragmentation활성을 확인할 수 있었지만 광을 조사하지 않은 곳에서는 DNA fragmentation을 전혀 확인할 수 없었다. 따라서 P. thunbergiana 의 잎으로부터 분리한 M4-3 compound는 pheophorbide a 유도체로 간암세포에 apoptosis 를 유도하는 photosensitizer라는 것을 확인되어졌기 때문에 칡 잎을 이용한 광역학 치료물질 개발이 가능할 것으로 사료되며, 칡은 산림생태계를 심각하게 파괴하는 덩굴성식물로 수목의 생육을 억제시키고, 고사시키는 피해를 일으키므로 칡을 식의약 소재나 의약소재로 개발한다면 농민의 고소득 창출은 물론 산림생태계 보호에도 기여할 것으로 사료된다.
Acknowledgements
이 논문은 부산대학교 자유과제 학술연구비(2년)에 의하여 연구되었음.
References
An C. G. 1998 Antioxidative effect of spice and their synergism with catechin and ascorbic acid Korea -
Bae E. A. , Han M. J. , Kim D. H. 2001 In vitro anti-Helicobacter pylori activity of irisolidone isolated from the flowers and rhizomes of Pueraria thunbergiana Planta Med 67 161 - 163    DOI : 10.1055/s-2001-11499
Crl D. 2000 Update on photodynamic therapy Curr Opin Opthalmol 11 166 - 170    DOI : 10.1097/00055735-200006000-00002
Cheng H. H. , Wang H. K. , Ito J. , Bastow K. F. , Tachibana Y. , Nakanishi Y. , Xu Z. , Luo T. Y. , Lee K. H. 2001 Cytotoxic pheophorbide-related compounds from Clerodendrum calamitosum and C. cyrtophyllum J Nat Prod 64 915 - 919    DOI : 10.1021/np000595b
Choo M. K. , Park E. K. , Yoon H. K. , Kim D. H. 2002 Antithromboticand antiallergic activities of daidzein, a metabolite of puerarin and daidzin produced by human intestinal microflora Biol Pharm Bull 25 1328 - 1332    DOI : 10.1248/bpb.25.1328
Hisashi K. N. 2003 Allelopathic substances in Pueraria thunbergiana Phytochemistry 63 577 - 580    DOI : 10.1016/S0031-9422(03)00195-X
Hsieh Y. J. , Wu C. C. , Chang C. J. , Yu J. S. 2003 Subcellular localization of photofrin determines the death phenotype of human epidermoid carcinoma A431 cells triggered by photodynamic therapy: when plasma membranes are the main targets J Cell Physiol 194 363 - 375    DOI : 10.1002/jcp.10273
Jo H. J. , Lee S. K. , Lee H. J. , Kang H. Y. , Choi D. H. , Lee T. S. 2008 A study on the extractives and antioxidation activity of phellodendron amurense and Pueraria thunbergiana Korean Forest Bioenergy Soc 27 19 - 25
Kim H. 2004 Textbook of herbal pharmacology Jipmoondang Seoul, Korea
Kim K. K. , Kawano Y. , Yamazaki Y. 2003 A novel porphyrin photosensitizer from bamboo leaves that induces apoptosis in cancer cell lines Anticancer Res 23 2355 - 2361
Kim M. J. 1998 Effects of extracts from mugwort and Puerariae radix roots on the blood ethanol concentration and liver function
Kim M. J. , Lee J. S. , Ha O. M. , Jang J. Y. , Cho S. Y. 2002 Effects of Pueraria thunbergiana bentham water extracts on hepatic alcohol metabolic enzyme system in rats J Korean Soc Food Sci Nutr 31 (1) 92 - 97    DOI : 10.3746/jkfn.2002.31.1.092
Kim S. H. 1996 The study on the antioxidant effects of crude catechin extracted form Pueraria thubergiana root.
Kim S. J. , Park C. , Kim H. G. , Shin W. C. , Choe S. Y. 2004 A study on the estrogenicity of Korean arrowroot (Pueraria thunbergiana) J Korean Soc Food Sci Nutr 33 (1) 16 - 21    DOI : 10.3746/jkfn.2004.33.1.016
Kim S. K. , Byun H. G. , Park P. J. , Adachi K. 2002 Purification and structure of antioxidative substance derived from Tetraselmis suecica J Korean Fish Soc 35 (2) 155 - 161    DOI : 10.5657/kfas.2002.35.2.155
Kinjo J. , Takeshita T. , Abe Y. , Terada N. , Yamashita H. , Yamasaki M. , Takeuchi K. , Murakami K. , Tomimatsu T. , Nohara T. 1998 Studies on the constituents of Pueraria lobata chemical constituents in the flowers and the leaves Chem Pharm Bull 36 1174 - 1179
Koichi T. , Hideji I. 1982 Isoflavonoids and the other constituents in callus tissues of Pueraria lobata Chem pharm Bull 30 1496 - 1499    DOI : 10.1248/cpb.30.1496
Lavie G. , Kaplinsky C. , Toren A. , Aizman I. , Meruelo D. , Mazur Y. , Mandell M. 1999 A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells Br J Cancer 79 423 - 432    DOI : 10.1038/sj.bjc.6690066
Lee K. T. , Sohn I. C. , Kong E. A. , Kim D. H. , Choi S. K. , Choi J. W. , Park H. J. 1999 Antioxidative and cytopro-tective effects of isoflavones isolated from Pueraria thunbergiana flowers Yakhak Hoeji 43 736 -
Lee S. , Ahn D. , Shin M. 1982 Clinical application of medicinal herb Seongbosa Seoul, Korea
Oh M. J. 1990 Antioxidative components of pueraria root Korean J Food Sci 22 (7) 793 - 798
Park C. H. , Lim S. S. , Lee D. U. 2007 Structure-activity relationships of components from the roots of Pueraria thunbergiana having aldose reductase inhibitory and antioxidative activity Bull Korean Chem Soc 28 (3) 493 - 495    DOI : 10.5012/bkcs.2007.28.3.493
Park E. K. , Shin J. , Bae E. A. , Lee Y. C. , Kim D. H. 2006 Intestinal bacteria activate estrogenic effect of mainconstituents puerarin and daidzin of Pueraria thunbergiana Biol Pharm Bull 29 2432 - 2435    DOI : 10.1248/bpb.29.2432
Song H. S. , Park Y. H. , Kim S. K. , Moon W. K. , Kim D. W. , Moon K. Y. 2004 Downregulatory effect of extracts from mistletoe (Viscum album) and pueraria Root (Pueraria radix) on cellular NF-κB activation and their antioxidant activity J Korean Soc Food Sci Nutr 33 (10) 1594 - 1600    DOI : 10.3746/jkfn.2004.33.10.1594
Yeung D. K. Y. , Leung S. W. S. , Xu Y. C. , Vanhoutte P. M. , Man R. Y. K. 2006 Puerarin, an isoflavonoid derived from Radix pueraria, potentiates endothelium-independent relaxation via the cyclic AMP pathway in porcine coronary artery Eur J Pharmacol 552 105 - 111    DOI : 10.1016/j.ejphar.2006.08.078