Ghost cells have been recognized as eliciting humoral and cell-mediated immune responses and have also been predicted to play a role as an immune adjuvant. In this study, we used the intramuscular (IM) route to inject BALB/c mice with four vaccine groups constructed from Salmonella typhimurium ghost (STG) cells originating from different virulent strains and complex STG groups instead of heat-labile toxin (LT)-B, a type of adjuvant. Although the complex STG groups exhibited a response after a short delay, the groups showed final total IgG levels similar to those of the LT-B group, which encodes LT-B from pMMP300. The IgG1 response to the χ3339 group was the highest response at 6 weeks, whereas IgG2a responses to the χ3339 and JOL389 groups were higher at 6 and 8 weeks compared to those of the LT-B group. The response of vaginal sIgA to the LT-B group was generally higher than that of the other groups, whereas fecal sIgA to the LT-B group exhibited lower responses. Protection to virulent S. typhimurium in all groups was above 80%, which was similar to the LT-B group. Taken together, we suggest that STG complex groups can be used as an immune adjuvant instead of LT-B. Salmonella 는 gram-negative 통성 혐기성 세균으로서 주로 구강을 통해 중요한 가축 등에 감염되어 위염, 설사, 패혈증 등의 질병을 일으킨다 [14] . 또한, Salmonella 는 사람에게도 감염되어 위염, 장티푸스 등의 심각한 질병을 일으키기도 한다 [5 , 22 , 26] . 특히, S. typhimurium 은 사람에게 가장 빈번히 감염을 일으키는 Salmonella serotype이다 [1 , 4 , 7 , 19 , 20 , 28] . 이들은 포유동물, 조류, 파충류, 각종 애완동물 및 농업적으로 Salmonella 균이 함유된 유제품, 계란, 육류 등 가축 유래의 식품이나 가축들의 분노에 의해 오염된 물을 통해 감염되는데, 식품유래의 Salmonella 감염이 이루어지면 48시간 이내에 위염을 일으키게 된다 [12 , 17 , 18 , 23] . Salmonella 감염에 의한 장염은 연간 2~13억 건의 발병률을 나타내고 있으며, 이 가운데 약 3백만 명 이상이 사망하는 것으로 알려져 있다(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en/) [3] . Bacterial ghost (BG)는 용균 과정에서 자연 상태의 형태를 가지고 있기 때문에 모든 주요 면역 자극 요소가 잘 보존되어 있다 [15] . 이들 요소는 병원균과 연관된 분자 패턴(pathogen-associated molecular patterns; PAMPs)으로서 언급되며, 리포폴리사카라이드(LPS), monophosphoryl lipid A (MPL), 펩티도글리칸, 편모 등을 포함한다. PAMPs는 패턴 인식 수용체 (toll like receptor; TLR)에 의해 인식되기 때문에 선천적 면역 반응을 유발한다. 따라서 BG로 유도된 모든 박테리아는 첫 반응으로서 선천적 면역 반응을 유발한다 [15] . 또한, BG는 실험동물에서 체액성 및 세포성 면역 응답을 유도하는 매우 효과가 우수한 면역보강제로서의 특성이 있다 [24] . E. coli 의 heat-labile enterotoxin (LT)는 면역응답의 증가를 유도하는 성질에 의해 광범위하게 연구되어져 오고 있다 [11] . LT는 효소적으로 활성이 있는 A subunit (LT-A)과 GM1 ganglioside receptor에 결합하는 비독성 B subunit (LT-B)로 구성된다. LT-B가 포유동물 세포표면에 GM1과 안정한 상호연결은 동시에 투여된 단백질의 흡수를 돕는 것으로 보이며, 점막과 세포성 면역을 상승시키기 때문에 면역보강제로서 넓게 사용되고 있다 [9 , 10] . 따라서 본 연구에서는 BG가 heat labile toxin-B (LT-B)를 대체할 수 있는 능력이 있는가를 평가해 보았고, 그 결과 복합 BG 균주가 LT-B를 대체할 수 있는 것으로 나타났다. 사용된 균주 및 플라스미드는 Table 1 에 정리되어 있다. E. coli 및 Salmonella strain은 현재 연구실에서 보관중인 균주 또는 전북대학교 수의과대학에서부터 분양받은 균주를 사용하였다. 본 실험에 사용된 플라스미드의 E. coli 에 형질전환은 CaCl ₂ 처리를 경유하여 열 충격 방법으로 실시하였고, Salmonella 에 형질전환은 전기천공법(electroporation)에 의해 실시하였다 [25] . 고스트화 및 생균수를 측정하기 위해 전배양된 χ8554 [pMMP184] 균주 및 기타 살모넬라 배양액을 100 ml LB 배지에 1/100로 접종하여 28℃에서 24 h 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양된 액을 멸균된 원심분리관에 첨가하여 4,500× g 로 4℃에서 20분간 원심분리하여 배양 상등액을 완전히 제거하였다. 침전된 세포에는 배양액과 동일한 양의 phosphate buffered saline (PBS) 완충액을 첨가한 후 위와 동일한 조건으로 2회에 걸쳐 원심분리하여 불순물을 완전히 제거하였다. 처리된 세포에 신선한 M9 (4 g glucose, 12.8 g Na ₂ HPO ₄ 7H ₂ O, 3 g KH ₂ PO ₄ , 0.5 g NaCl, 1 g NH ₄ Cl, 0.49 g MgSO ₄ ) 배지를 첨가하여 42℃에서 계속 배양하면서 고스트화를 유도하였고, 생균수는 적정 시간 간격으로 샘플링을 수행하여 측정하였다. 고스트 카세트를 운반하지 않는 S. typhimurium χ3339 및 S. typhimurium JOL389와 같은 균주는 E protein과 유사한 역할을 수행하는 fosfomycin (100 ug/ml medium)으로 E protein의 용균과정과 동일한 조건에서 용균을 유도하였다. 즉, 각 균주를 위와 동일한 조건으로 성장을 유도하여 fosfomycin를 첨가하여 42℃에서 용균을 유도하였다. 고스트화가 완료된 고스트 세포는 원심분리관에 첨가하여 4,500× g 로 4℃에서 20 분간 원심분리하여 배양 상등액을 완전히 제거한 후, 고스트 농축액을 제조하여 직접적으로 사용하거나 동결건조를 실시하였다. 제조된 고스트 세포는 농도별로 희석하여 일주일간 순화된 BALB/c 마우스에 근육으로 접종하였다. 접종량은 근육으로 1×10 ⁸ CFU/ml에 의해 접종하였다. 접종하기 전에 4시간 이상 절수 및 절식을 시켰고 접종 후 1시간 후 음수 및 사료를 제공하였다. 접종을 실시한 후 8주 동안 마우스를 관찰하였고 혈액 중의 면역글로불린 함량을 측정하기 위한 혈액의 채취는 2, 4, 6, 8주에 눈 정맥을 통해 실시하였다. 또한 분비액 중에 sIgA를 측정하기 위해 질세척액과 분변을 2, 4, 6, 8주에 채취하였다. 질 세척액은 100 ul PBS buffer을 질에 투여하여 채취하였고, 분변은 적정량을 회수한 후 PBS buffer로 10배 희석하고 파쇄하여 사용하였다. S. typhimurium LPS를 200 ng/100 ul의 농도로 0.05 M carbonate 용액(pH 9.6)에 넣어서 4℃에서 overnight 시키고 microtiter plate의 표면에 항원으로 코팅시켰다. 코팅용액을 버리고 PBS (pH 7,4) 완충액으로 1회 세척을 수행하였다. PBS (pH 7.4) 완충액을 완전히 제거한 후 1% skim milk을 포함된 PBS 완충 용액으로 상온에서 30분간 blocking 시켰다. Blocking 용액을 버리고 샘플[혈액(1:50), 분변(1:2), 질분비액(1:2)]을 포함하는 PBS 완충액을 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응이 종료된 후 PBS (pH 7.4) 완충액으로 2회 세척을 수행하였다. PBS (pH 7.4) 완충액을 완전히 제거한 후, 2차 항체인 goat anti-mouse IgG (1:2,000; Southern Biotech), goat anti-mouse lgG1 (1:2,000; Southern Biotech), goat anti- mouse IgG2a (1:2,000; Southern Biotech), goat anti-mouse IgA (1:2000; Southern Biotech)을 첨가하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, PBS (pH 7.4) 완충액으로 2회 세척을 실시하였다. PBS (pH 7.4) 완충액을 완전히 제거한 후 반응 기질 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6- sulphonic acid) (ABTS)를 포함하는 용액에서 10-90분 동안 반응시켰다. 0.1% SDS로 반응을 정지시킨 후 ELISA reader로 파장 405 nm에서 발현 정도를 관찰하였다. 고스트 세포가 독력이 있는 살모넬라균에 대한 보호능력을 관찰하기 위해서 다음과 같이 도전실험을 실시하였다. 근육으로 1×10 ⁸ CFU/ml 고스트 세포를 접종하고 동량으로 2주 간격으로 추가 접종하였다. 고스트 세포 접종 10주 후에 S. typhi-murium c3339를 1.2×10 ⁶ CFU의 농도로 경구 투여하였다. 접종하기 전에 4시간 이상 절수 및 절식을 시켰고 접종을 완료하고 1시간 후 음수 및 사료를 제공하였다. 도전 실험을 실시한 후에 4주 동안 마우스를 관찰하였다. 이 연구에 사용된 동물 실험은 한국동물보호위원회의 가이드라인에 따른 경남과학기술대학교 동물윤리위원회의 승인하여 수행되었다(ACE-20100730-0002). 고스트 백신을 제조하기 위해 박테리오파아지 람다 cI 857 P _R 과 ΦX174 E 유전자를 융합한 체계를 많이 활용하고 있다 [27] . 본 연구에서도 이 cI 857 P _R :: E 체계를 도입하여 고스트화를 유도하였다. 단, 본 연구에서는 기존의 균주의 선별을 위해 사용한 항생제 마커 대신에 host-balanced lethal system으로 사용되는 aspartate semialdehyde dehydrogenase ( asd )를 도입하여 pMMP184를 구축하였다(unpublished data). 일반적으로 LT-B는 그 효능이 우수한 것으로 평가되어 목적동물의 면역 증강을 위한 면역보강제로서 많이 사용되고 있다 [2 , 13 , 21] . BG는 일반적으로 면역반응유발 기능뿐만 아니라 면역보강제로서의 역할이 있는 것으로 알려져 있다 [24] . 따라서 본 연구에서는 면역보강제인 LT-B에 대해 BG가 기능을 대체할 수 있는지를 알아보기 위해, 면역보강제인 LT-B와 독력이 강한 균주인 S. typhimurium χ3339 및 S. typhimurium JOL389로부터 유도된 BG에 대해 BG의 비교 실험을 수행하였다. S. typhimurium χ3339 및 S. typhimurium JOL389는 각각 3.5×10 ⁵ CFU/ml 및 3.76×10 ⁵ CFU/ml의 LD50 값들을 나타내는 강력한 독력을 유도하는 균주들이다(unpublished data). Fig. 1 에서 보여지는 바와 같이 총 IgG 함량 변화는 LT-B을 유지하는 B 그룹에서 4주차에 약간 먼저 상승되는 경향을 보였지만, 6주 이후에는 S. typhimurium χ3339 및 S. typhimurium JOL389와 특별한 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러므로 total IgG 수준에서만 본다면 LT-B을 유지하는 χ8554 [pMMP 300]은 S. typhimurium χ3339 및 S. typhimurium JOL389로 대체가 가능한 것으로 판단된다. 면역글로블린 IgG의 subtype인 IgG1과 IgG2a의 생성은 Th2와 Th1에 의해 촉진되어지고, 각각 체액성 면역과 세포 매개 면역 응답을 유발하도록 한다 [6 , 10 , 16] . 체액성 면역 및 세포매개면역반응을 알아보기 위해 IgG1 및 IgG2a를 분석하였다. 그 결과 Fig. 2 에서 보여지는 바와 같이 IgG1의 경우는 χ8554 [pMMP184]/χ8554 [pMMP300] 그룹에서 4주차부터 IgG1이 감지되어 χ8554 [pMMP184]/χ3339보다는 낮게 반응한 반면에 χ8554 [pMMP184]/JOL389보다 전반적으로 높게 형성되는 것으로 나타났다. 그러나 IgG2a의 경우는 [pMMP 184]/ χ8554 [pMMP300] 그룹이 높은 독력 그룹보다 낮은 것으로 나타났다( Fig. 3 ). 즉, 백신 투여 후 6주차부터 면역능력이 감지되었으며, χ8554 [pMMP184]/χ8554 [pMMP300] 그룹보다 χ8554 [pMMP184]/ χ3339나 χ8554 [pMMP184]/JOL389 에서 높게 감지되는 것이 관찰되었다. 질 sIgA에서는 LT-B그룹보다 독력 그룹에서 전반적으로 낮게 감지되었지만( Fig. 4 ), 분변 sIgA는 S. typhimurium χ3339나 S. typhimurium JOL389가 첨가된 실험구에서 보다 높은 sIgA가 4~8주차에서 관찰되었다( Fig. 5 ). 이상의 결과를 종합해 보면, LT-B 대체 그룹은 체액성, 세포매개면역반응, sIgA에 대한 면역응답에 LT-B를 대체하여 사용할 수 있는 것으로 제의된다. S. typhimurium χ3339을 이용한 도전실험결과, 대조구는 50%의 치사율을 보였지만, 단일균주 백신 그룹인 χ8554 [pMMP184], χ8554 [pMMP184]/χ8554 [pMMP300] 및 χ8554 [pMMP184]/JOL389는 대조구보다 약 30%의 보호효과가 높은 것으로 관찰되었다( Fig. 6 ). 그러나 χ8554 [pMMP184]/χ 3339는 백신화 초기에 대부분의 균주에서 폐사가 유도되는 관계로 정확한 결과를 획득하지 못했지만, χ8554 [pMMP184]/ JOL389의 경향성으로 보아 χ8554 [pMMP184]/χ8554 [pMMP 300] 그룹의 대체가 가능한 것으로 추정된다.