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Prevalence and Expression Pattern of Cytokines in Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC)
Prevalence and Expression Pattern of Cytokines in Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC)
Journal of Life Science. 2014. Oct, 24(10): 1118-1124
Copyright © 2014, Korean Society of Life Science
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
  • Received : July 19, 2014
  • Accepted : August 05, 2014
  • Published : October 30, 2014
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경현 이
재찬 송
songjach@knu.ac.kr

Abstract
국내에서 발생하는 돼지호흡기복합증후군(Porcine respiratory disease complex, PRDC)의 발생 상황 및 원인체의 검출 방법의 비교와 PRDC에서 cytokine의 발현변화 여부를 확인하기 위해서 481건의 시료에 대해 PRDC 발생상황을 조사하였다. 총 481건 중 단독감염은 113건(23.5%), 2종 이상의 원인체에 의한 발병이 348(72.3%)건으로 나타났다. PRDC 발생상황을 주령별로 분석한 결과, 총 348건에서 3주령에서 10주령미만의 돼지에서 258건(74.1%)으로 가장 많이 나타났다. PRDC의 주 원인체로 알려진 PRRSV, PCV2, SIV에 대한 감별진단을 위해 면역조직화학염색법(IHC)과 PCR에 의한 검출을 원인체 검출을 비교한 결과, 결과 PCR 방법이 IHC보다 원인균인 PRRSV, PCV-2의 검출에 효과적인 것으로 나타났으며 이러한 결과를 근거로 PRDC를 유발하는 원인체에 대해서는 임상적으로는 PCV-2는 감염되더라도 병리소견을 발현하지 않는 예가 있어 임상증상을 나타내는 PRDC의 주요 원인체는 PRRSV로 확인되었다. PRDC로 진단된 시료 중 2종 및 3종의 혼합감염군을 대상으로 폐와 림프절에서 cytokine의 발현의 변화를 조사한 결과에서는 , IL-6을 제외한 조사된 모든 cytokine들이 2종 및 3종 복합 감염군에서 대조군에 비해 감소되었다.
Keywords
서 론
돼지호흡기복합증후군 (Porcine respiratory disease complex, PRDC)은 우리나라의 양돈 산업에서 있어서 큰 경제적 손실을 일으키는 질병으로 바이러스와 세균이 복합적으로 감염되어 질병을 일으키는 질병증후군이다. 발병 원인으로는 세균, 바이러스에 의한 감염, 사육환경 및 사양관리 부실 등의 요인이 복합적으로 작용하며, 두 가지 이상의 병원균이 혼합감염을 일으키는 경우가 많다. PRDC의 주요 원인균 중, 세균으로는 Mycoplasma hyopneumoniae ( M. hyopneumoniae ), Pasteurella multocida ( P. multocida ), Actinobacillus pleuropneumoniae ( A. pleuropneumoniae ), Haemophilus parasuis ( H. parasuis ) Streptococcus suis ( S. suis )등이 있으며 [20] , 바이러스로는 Porcine reproductuve and respiratory syndrome virus(PRRSV), porcine circovirus 2형(PCV-2), swine influenza virus (SIV) 등이 보고되었다 [12] . PRDC는 바이러스 또는 세균 단독 감염일 경우에는 예방이나 치료 효과도 양호하나, 혼합감염이 이루어지면 치료 효과가 떨어져 농장의 피해가 증가되는 경향이 있다. 국내에서는 아직 PRDC와 관련하여 발생상황을 조사한 바가 없으나, PRDC와 임상증상이 유사한 돼지소모성질환(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)에 대하여 조사한 바에 따르면 1999년부터 2000년까지 증체지연이 있는 돼지를 대상으로 조사한 결과 1,634마리의 돼지 중 1,243마리가 PMWS으로 진단이 되었으며, 대부분의 경우(85%)에서 다른 원인체와 혼합 감염된 것으로 확인되었다. 그 중 PCV-2와 H. parasuis 의 혼합감염이 32.3%로 가장 높았고, 그 다음이 PCV-2와 PRRSV의 혼합감염이 29.3%로 나타났다 [7] . PRDC의 주 원인균인 PRRSV는 Arterivirus 과에 속하는 RNA 바이러스로 PRRSV는 호흡기계통의 대식세포와 폐포강 또는 혈관 내 대식세포에 강한 친화성을 가진다 [16] . 현재까지 PRDC의 발병 기전에 대해서는 알려진 바가 없으나, PRDC와 유사한 형태로 혼합감염에 의해서 발생하는 PMWS의 경우에는 면역계의 변화가 질병을 유발하는데 영향을 주는 것으로 보고되어 있다 [1 , 8 , 9 , 16 , 23] . PRDC에 있어서 cytokine의 발현의 변화에 대해서 PRRSV의 단독 감염에서 IL-1의 발현은 증가되나, TNF-α는 변화가 없다는 것이 보고되었다 [25] . PRDC와 유사한 혼합감염에 의해서 주로 발생하는 PMWS의 경우에서는 림프구계 장기에 손상을 주어 cytokine의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있는 Pneumocystits carnii Chlamydia spp. 등이 소장과 폐에서 높은 빈도로 발견되고, 혈중의 B 림프구의 감소와 CD4 + 와 CD8 + T 림프구의 감소가 나타난다. 또한 IL-2와 IL-4의 발현은 감소되나, IL-1β나 IL-8과 같은 pro-inflammatory cytokine의 발현은 활성화된다 [5] . 흉선에서는 IL-10의 발현을 증가시켜 thymocyte의 성숙을 방해함으로써 면역억제를 일으키는 것으로 보고되었다 [8] . 아직까지 PRDC에 대해서는 다른 돼지 호흡기 질병에 비해 면역학적 연구가 미흡하여, PRDC에 대한 면역생화학적 연구가 PMWS의 예와 같이 혼합감염에 의한 질병유발 기전을 이해하는데 중요한 요소가 될 것으로 판단되어 국내에서 발생한 PRDC를 대상으로 발생상황, 원인균의 종류와 감염형태를 조사하고 혼합 감염된 경우에 대해서 cytokine의 발현의 변화를 조사하였다.
재료 및 방법
- 실험재료
2005년부터 2006년까지 전국 16개 시도에서 호흡기증상으로 PRDC로 진단된 461개의 시료를 사용하였다. 수집된 시료로부터 DNA와 RNA를 추출하여 항원검사와 유전자검사 통하여 감염된 바이러스와 세균을 동정하였다. 항원검사는 IHC(Discovery TM , Ventana Medical Systems, USA)를 이용하여 제조사가 제공한 manual에 따라 실시하였다.
- DNA 및 RNA의 분리
바이러스 및 세균의 유전자 검사를 위하여 채취한 폐, 림프절은 실험에 사용할 때까지 −20℃의 냉동상태로 보관하였다. 시료로부터 DNA와 RNA는 각각 QIAmp DNA mini kit (Qiagen, USA)와 RNeasy mini kit (Qiagen, USA)를 이용하여 추출하였다. 추출한 RNA는 spectrophotometer (Nanodrop ND-1000, Nanodrop technologies, USA)를 이용하여 정량하였다. 정량한 RNA 1 μg을 reverse transcription을 위해 PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time, Takara, Japan)을 이용하여 37℃에서 15분 동안 반응한 다음 85℃에서 5초간 불활화한 후에 PCR에 사용하였다.
- 감염균의 동정 및 PCR
균의 동정을 위한 RNA sample은 One-step RT PCR kit (Qiagen, USA)를, DNA는 Premix Taq (Bioneer, Korea)를 이용하여 균 종의 특이 DNA fragment를 확인하였다 [13 , 21] .
- Real-time PCR
Cytokine에 대한 Quantitative real-time PCR의 primer [3 , 11 , 14] 는 design TIB MOLBIOL (Germany)사에 의뢰하여 합성하였다. Real-time PCR 반응은 cDNA 2 μl, 각각의 cytokine primer (20 pmol) set 1 μl, probe (40 pmol), Premix Ex Taq (Takara, Japan) 12.5 μl, DNA-RNA free water 10.5 μl를 첨가하여 총 25 μl를 맞추어 사용하였고 반응액은 Smart cyclerII(Cepheid, USA)를 이용하여 95℃에 5초 반응, 95℃ 10초, 60℃ 30초 50회 반복하여 CT값을 측정하였다.
- 통계분석
상대정량 값은 cytokine gene의 threshold cycle (Ct)값에 세가지 housekeeping gene의 threshold cycle (CT) 평균값을 나눈 값을 하였으며, 본 실험에서 얻어진 자료는 ANOVA test의 분석방법을 이용하여 분석하였고 대조군과의 유의성은 95% 수준에서 실시하였다.
결 과
- PRDC의 발생상황 및 원인체의 분석
2005년부터 2006년까지 전국 16개 시·도에서 수집된 PRDC로 진단된 시료에 대해 발생상황을 조사한 결과, 총 461건 중 113건(24.6%)이 단독감염이었으며, 348건(75.5%)이 2종 이상의 원인체에 의한 혼합감염이었다( Table 1 ). PRDC 발생상황을 주령 별로 분석한 결과, 3주령에서 10주령 미만의 돼지에서 338건(73.4%)으로 가장 많이 나타났으며, 10주에서 20주 미만의 돼지에서 86건(18.7%)으로 나타나, 전체 3주령에서 20주령의 이유돈에서 높은 빈도로 나타났다. 혼합감염 유형은, 2종 혼합감염이 175건(38.0%), 3종 혼합감염이 112건(24.4%)을 차지하고 있어, 국내에서 발생하는 PRDC는 2종 또는 3종의 혼합감염이 62.4%로 가장 많은 것으로 나타났다. 113건의 단독감염인 대하여 원인체를 조사한 결과, PCV-2가 76건(67.3%)으로 가장 많이 나타났으며, 그 다음은 PRRSV로 21건(18.6%)였다. 세균 원인체는 H. parasuis 가 11건(9.7%)으로 가장 많이 나타났다( Table 2 ). 혼합감염의 주요 원인체로는 PRRSV/PCV-2의 2종 혼합감염이 44.6%로 가장 높은 빈도로 나타났다. 3종 혼합감염 예에서는 PPRSV/PCV-2/ H. parasuis 의 혼합감염이 34.8%로 가장 많이 검출되었다( Table 2 ).
Prevalence according to age and agent on PRDC
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Prevalence according to age and agent on PRDC
Patterns of ages and agent on PRDC
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Patterns of ages and agent on PRDC
- 원인균 검출을 위한 항원검사와 PCR 방법의 비교
항원 검사에서 PCV-2로 진단된 경우 PCR 방법과의 일치율이 72.7%로 나타났으며, PRRSV의 경우 일치율이 50%로 나타났다. 기타 PCV2/ H. parasuis 혼합감염일 경우 일치율이 41.7%로 나타났다. PMWS의 경우에는 항원검사시 PRRSV/PCV2가 혼합감염된 경우가 41.7%로 가장 높았다. PRRSV/ H. parasuis 혼합감염일 경우 일치율이 60%로 나타났으며, PRRSV/PCV2로 진단된 경우 43.9%의 일치율을 보였다. 3종 복합감염된 예를 비교하여 보았을때, PRRSV/PCV2/ H. parasuis 감염일 경우 42.8%의 일치율을, PRRSV/PCV2/ P. multocida 감염인 경우 37.5%의 일치율을 보였다. PRRSV/PCV2/SIV 복합감염일 경우 100%의 일치율을 보였다. 4종 복합감염일 경우 PRRSV/PCV2/ P.multocida / H. parasuis 의 경우는 66.7%로 나타났다( Table 3 ).
Comparison of diagnostic detection of viral agents between IHC and PCR method
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Comparison of diagnostic detection of viral agents between IHC and PCR method
- 혼합감염에서 cytokine의 발현 양상
PRDC의 발생 양상 중에서 가장 높은 빈도로 나타나는 2종과 3종의 감염원에 의해 혼합 감염된 시료를 대상으로 cytokine 유전자의 발현을 비교하였다. 각각의 실험결과는 no template control (NTC), RT- control을 사용하여 각각의 실험마다 사용하였고 PCR반응의 결과에서 NTC와 RT-control은 형광반응을 보이지 않았다. 2종 혼합 감염에 의한 시료 중에서 가장 높은 빈도로 나타난 PRRSV/PCV-2 (44.6%), 3종 혼합감염에서는 PPRSV/PCV-2/ H. parasuis (34.8%)의 혼합감염균에 대한 cytokine의 발현을 비교한 결과, 2종 및 3종 혼합 감염군에서 IL-6를 제외한 조사한 모든 cytokine에서 동일한 양상을 보였다( Fig. 1 ). cytokine 발현의 비교는 대조군을 기준으로 시험군에서의 발현의 비로 표시하였다. IL-6는 2종 및 3종 혼합감염 군에서 모두 증가하였고, 그 이외의 IL-1α, IL-2, IL-4, IL-10, IFN-α의 발현은 감소하였다. 또한 2종 혼합 감염 군과 3종 혼합 감염 군에서 cytokine의 발현 비율을 비교하면, IL-1α가 2종 혼합 감염 군보다 3종 혼합 감염 군에서 발현이 가장 감소하였으며, IL-4의 변화가 가장 적게 나타났다. IL-6의 경우에는 2종 혼합 감염 군보다 3종 혼합감염 군에서 감소가 크게 나타났다.
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The ratio of cytokines mRNA expression polymicrobial infection case in 2 by and 3 agent investigated. The expression of cytokines was calculated in relation to expression of 3 housekeeping genes (gylceraldahyde-3- phosphate-dehydrogenase, β-actine, cyclophilin gene). Data are presented as mean ± S. E. M. p< 0.001.
고 찰
2005년부터 2006년까지 전국 16개 시도에서 PRDC로 진단된 461개 시료에 대해 원인체, 발생연령, 혼합감염 형태를 분석하고, 원인 체의 진단 방법의 비교, PRDC의 높은 발생 빈도를 나타내는 2종 또는 3종 혼합 감염된 시료를 대상으로 cytokine 발현의 변화에 대해 조사하여 국내에서 발생하는 PRDC의 발생양상과 발병기전을 이해하고자 하였다. 이유돈(3주령~10주령)에서 질병은 특히 증체율이 낮아져 양돈농가의 수익성 감소를 초래한다. 본 연구의 결과, 국내에서 발생하고 있는 혼합감염에 의한 PRDC의 발생연령은 주로 3주령에서 10주령 사이에서 가장 많이 발생하는 것으로 나타났으며, 외국의 경우에서 8-12주령의 돼지에서 발생빈도가 높은 것으로 보고되어 국내의 PRDC 발생이 외국보다 더욱 빨리 나타나는 것으로 확인되었다 [22] . 이러한 결과는 외국의 경우 양돈농가에서 동물복지의 기준에 맞춘 사육이 정착되어 질병과 관련된 환경 문제의 개선뿐만 아니라 질병감염의 주요 원인인 밀식사육 등으로 인한 사육 스트레스가 감소된 반면 [26] , 국내에서는 밀식사육이 가장 널리 사용되는 사육방법이며, 특히 밀식사육의 경우에 사육돈의 스트레스가 증가하고, 환기시설의 규모가 소형일수록 호흡기 질병의 발생에 차이가 나타나는 점 [15] 을 고려하면 면역력이 낮은 어린 자돈일수록 높은 빈도로 발생할 수 있다. 이러한 문제는 우리나라의 양돈의 사육환경이 동물복지의 기준으로 개선될 필요가 있음을 시사한다.
본 연구의 결과에서는 전체 발생한 PRDC 중 단독감염이 113건(24.6%)로 나타났으나 미국 미네소타 대학에서 조사한 바에 따르면, 단독감염의 예가 2872건중 338건(11.8%) 으로 나타나 본 연구의 결과보다 단독감염의 비율이 낮게 나타났다 [6] . 이러한 결과는 PRDC와 유사한 증상을 보이는 PMWS와 같은 호흡기 질병과의 감별진단에 있어서 본 연구의( Table 3 )에서 나타났듯이 진단의 방법에 따라 감염형태가 많은 차이가 나기 때문에 진단의 방법 및 정확도 등의 차이에 의한 결과일 것으로 추측된다. 국내에서 발생하는 PRDC는 단독감염보다 혼합감염이 높은 빈도로 발생하는 것이 확인되었으며, 단독감염을 포함하여 2종 혼합감염이 38.0%, 3종 혼합감염도 24.4%를 차지하고 있어 국내 PRDC는 2종 또는 3종의 혼합감염이 62.4%로 가장 많이 나타났다. 외국의 경우, 2종이상의 혼합감염만을 대상으로 실시한 조사에서 PRDC로 진단된 2,872건중 338건(88.2%)으로 [6] 이러한 결과는 본 연구에서 2종 이상의 복합감염(348건)을 대상으로 하면 2종 혼합감염이 175건(50.2%), 3종 혼합감염이 112건(32.2%)로 우리나라와 비슷한 양상을 보임을 확인하였다. 또한 PRDC의 원인균을 분석한 결과, 113건의 단독감염의 원인체는, PCV-2가 총 76건(67.3%)으로 나타났으며, 그 다음은 PRRSV로 21건(18.6%)으로 나타났다. 세균원인체중 가장 많이 확인된 것은 H. parasuis 로 11건(9.7%)였다. PRDC 혼합감염의 주요 원인체로 PRRSV/PCV-2의 2종 혼합감염의 예가 전체 혼합감염 중에서 22.4%로 가장 높은 빈도로 검출되었으며. PPRSV/PCV-2/ H. parasuis 의 3종 혼합감염의 예가 11.0%로 나타났다. 또한 4종 혼합감염은 13.8%로 PRRSV/PCV-2/ P. multocida / H. parasuis 혼합감염 예가 3.7%로 확인되었으며, 5종 또는 6종 혼합감염도 나타나는 것으로 확인되었다. 국외에서도 PRRSV/PCV-2의 혼합감염이 가장 높게 나타나는 것으로 보고되었으며 [22] , 그 외 PRRSV/PCV2/ P. multocida 이 17.9%, PCV2/ H. parasuis 가 16.6%였으며, PRRSV/PCV-2/SIV는 10.7%로 나타나 [17] , 우리나라에서 발생하는 PRDC와 유사한 형태의 감염 양상을 나타내고 있다. PRDC의 원인균이 지역과 사육환경이 다른 외국의 경우와 유사한 결과는 PRDC 발생의 대부분을 차지하는 혼합감염의 원인이 PRRSV 또는 PCV-2 등에 의해 일차 감염된 후, 돼지가 면역력이 약화된 상태로 의해 지속적 외부환경에 노출되면서 2차 감염이 이루어지고 있는 것으로 추측된다. 따라서 PRDC의 예방을 위해서는 외부인의 출입을 제한하는 것을 포함하여 지속적인 사육환경의 청결이 중요한 요인으로 나타났다.
PRDC의 예방과 치료를 위해서는 정확한 원인균의 검출이 요구된다. PRDC의 확진을 위해서 사용하고 있는 조직항원염색방법(IHC)은 균들간의 항원교차반응에 의해 정확성이 떨어지는 경향이 있어 정확한 원인균의 검출을 위해서 PCR 방법을 이용하여 두 진단 방법간의 정확도를 비교하였다. PRRSV, PCV-2에 대한 면역조직화학염색과 PCR 방법과의 원인균의 검출율을 비교한 결과 PCR 방법이 IHC보다 원인균인 PRRSV, PCV-2의 검출에 효과적인 것으로 나타났다. 이러한 결과를 근거로 PRDC를 유발하는 원인체에 대해서는 항원검사의 결과에서 PCV-2의 감염이 많이 나타났으나 임상적으로는 PCV-2는 감염되더라도 병리소견을 발현하지 않는 경우가 있어 임상증상을 나타내는 PRDC의 주요 원인체는 PRRSV로 판단된다.
PRDC에서 cytokine 발현의 변화를 조사하기 위해서 본 연구의 결과에서 PRDC 발생의 발생이 가장 높은 빈도로 나타나는 2종과 3종 혼합감염(82.5%)을 대상으로 조사하였다. Cytokine의 발현을 분석한 결과 2종 및 3 종 혼합 감염군에서 IL-6를 제외한 조사한 모든 cytokine에서 동일한 양상을 보였다. 이러한 현상은 PRDC의 주 원인균으로 알려진 PRRSV 또는 PCV-2의 일차감염으로 대식구의 융해가 일어나며 [18 , 24] 또한 PRDC에서 PCV2 감염에 의한 B 및 T 림프구의 현저한 감소와 상대적으로 단핵세포 및 과립구의 증가가 보고되어 있어 [13] , proinflammatory cytokine인 IL-6를 제외한 cytokine이 감소가 나타날 수 있다는 예상과 본 결과가 일치하였다. IL-1α가 감소를 나타내는 본 연구의 결과는 IL-1α가 단핵구계 세포와 B 림프구에서 분비되어 B와 T 림프구의 활성을 촉진하는 cytokine으로 실험적 감염에 의한 PRDC에서도 감소되는 경향을 보이며, 2종 혼합감염군보다 3종 혼합감염군에서 더욱 감소하는 경향을 나타내고 있다는 보고 [8] 와 본 연구 결과와 일치하였다. PRDC와 원인균과 감염경로, 임상증상이 유사한 PMWS 감염돈의 에서도 IL-1α가 PRDC와 림프절에서 분비가 감소되는 양상을 보이는데 [4] 이러한 cytokine은 일차 감염된 바이러스에 의해 감소된 후에도 혼합감염의 상태에도 감소된 상태를 유지하면서 숙주의 면역기능을 저하시키는 요인이 되는 것으로 추측된다. IL-1α의 감소는 단핵구계의 세포에서 PCV-2가 증식하여 발현이 감소하는 것으로 생각되며, 병리조직학적 소견에서도 림프절 germinal center의 괴사는 B 림프구의 감소를 동반하여 Il-1α의 발현을 감소시켰을 것으로 사료된다. IL-4의 발현이 감소하는 것은 specific humoral immunity의 정도가 감소하는 것을 의미하지만, 돼지 IL-4의 경우 Th2형과 관련된 cellular mediated immunity과 연관된 것으로 보고되었다 [18] . 이와 같이 IL-1α, IL-2, IL-4, IL-10, INF-α의 세포 내 발현수준이 감소하는 것은 T cell immunosuppresion을 의미하여 혼합감염에서 숙주의 T-cell에 의한 면역반응이 감소될 것으로 예상된다. IL-6의 경우 2종 및 3종 혼합 감염군에서 증가하는 경향을 나타내었다. IL-6는 주로 IL-1과 TNF-α를 억제하고, IL-1 수용체 antagonist와 TNF-α 수용체의 작용을 억제하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다 [4] . IL-6가 IL-1등이 발현한 뒤에 나타나는 2차 cytokine인 것임을 고려할 때 mRNA 발현이 IL-1과는 상반되게 나타나 본 연구의 실험결과와도 일치함이 확인되었다. 반면 PRDC와 유사한 형태의 혼합감염에 의해서 발병되는 PMWS의 경우 B 세포와 T 세포의 손실이 보고되어 있으며 [2] , 특히 기억 T 세포의 손실이 보고되었다 [18] . 또한 PMWS에 감염된 cytokine을 분석해보면, 흉선에서 T 세포 면역 억압의 지표로 생각되는 IL-10 mRNA 발현이 증가됨이 확인되었으나 [10] , 자연감염에 의한 PMWS에 감염된 돼지에서의 본 연구에서 조사한 그 외의 cytokine의 변화는 mRNA와 단백질 수준에서 모두 유의성 있는 변화를 보이지 않는 [19] 것에 의해 판단하면 PRDC나 PMWS가 감염형태나 원인균 등에서 유사성을 보이고 있으나 감염후의 발병기전은 다를 것으로 추측되어 앞으로 PRDC와 PMWS에 대한 면역학적 연구는 두 질병에 대한 예방 및 감별 진단과 치료에 공헌을 할 수 있을 것으로 기대된다.
Acknowledgements
이 논문은 2010학년도 경북대학교 학술연구비에 의하여 연구되었음.
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