Advanced
Synergistic Effect of Acetylalginate Esterase and Alginate Lyase on the Degradation of Acetylalginate from Pseudomonas aeruginosa ATCC 39324
Synergistic Effect of Acetylalginate Esterase and Alginate Lyase on the Degradation of Acetylalginate from Pseudomonas aeruginosa ATCC 39324
Journal of Life Science. 2013. Dec, 23(12): 1420-1427
Copyright © 2013, Korean Society of Life Science
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
  • Received : August 26, 2013
  • Accepted : October 14, 2013
  • Published : December 30, 2013
Download
PDF
e-PUB
PubReader
PPT
Export by style
Share
Article
Author
Metrics
Cited by
TagCloud
About the Authors
희숙 김
hskim@ks.ac.kr

Abstract
A novel acetylalginate esterase (AcAlgE) gene was previously cloned and characterized from Sphingomonas sp. MJ-3. In this study, the synergistic effects of MJ-3 AcAlgE, and KS-408 alginate lyase on the degradation of acetylalginate from Pseudomonas aeruginosa were investigated by using high-field 1 H-NMR and an FPLC-equipped peptide column. The alginate lyase coupled assay of AcAlgE showed that degradation of high molecular weight acetylalginate was more difficult than degradation of acid hydrolyzed acetylalginate. The degradation of acetylalginate by alginate lyase was easier after AcAlgE was used to remove the acetyl group from acetylalginate. This result showed that the recombinant AcAlgE enhanced the degradation of acetylalginate by alginate lyase.
Keywords
서 론
Pseudomonas 속 균주들은 세포외 다당류(exopolysaccharide, EPS)로 아세틸알긴산을 분비하여 바이오필름(biofilm)을 형성하므로서 먹이에 부착할 수 있고 백혈구들에게 잡혀먹히지 않으며 바이오필름을 형성하지 않는 균들보다 항생제에 수백배~수천배 저항성이 있다고 알려진 바 있다[ 7 , 11 , 21] . 토양균인 Azotobacter 속 균주들도 불리한 환경조건에서 균체가 건조되는 것을 방지하기 위하여 아세틸알긴산을 생성한다고 알려져 있다[ 17] . 미역이나 다시마와 같은 갈조류의 세포벽 구성성분으로 셀루로우즈, 알긴산, 퓨코이단 등이 있으며 그 중 알긴산은 L-guluronate가 α(1-4) 결합되어 있는 polyG block과 D-mannuronate가 β(1-4) 결합하고 있는 polyM block, 그리고 L-guluronate와 D-mannuronate가 α(1-4) 결합 또는 β(1-4) 결합하고 있는 random block (MG/GM)들로 이루어진 선상 산성다당류이다[ 20] . 그러나 특히 P. aeruginosa 가 생산하는 알긴산은 갈조류의 알긴산과는 달리 L-guluronate는 거의 없으며 D-Mannuronate가 β(1-4) 결합으로 연결되어 있는 polyM 구조이며 mannuronate의 2번 또는 3번 탄소의 수산기(-OH)가 아세틸화(-OCOCH 3 ) 되어 있다( Fig. 1 ) [ 15] .
PPT Slide
Lager Image
Schematic diagram of the enzymatic cleavage of algal alginate (A) and bacterial acetylalginate (B) into unsaturated uronate oligomers.
알긴산 분해효소(alginate lyase)에 대한 연구는 유전병인 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 환자를 치료하기 위하여 시작되었다[ 13] . 낭포성 섬유증이란 염소이온 수송을 담당하는 막단백질(CFTR)의 유전적 결함(△F508)으로 폐와 이자에서 과잉의 점액질이 생산되며 호흡과 소화작용에 문제가 생기는 질병으로 알려져 있다. 이러한 환자들은 두꺼운 점액질 때문에 쉽게 세균에 감염이 되고 특히 Pseudomonas 균에 감염이 되면 항생제를 보통 환자들보다 많은 양 주사하여도 아세틸알긴산으로 바이오필름을 형성한 세균들을 치료하기 힘들다고 한다. Hatch 및 Schiller [ 5] 와 Alipour 등 [1] 은 알긴산 분해효소 특히 polyM 분해효소를 사용하면 Pseudomonas 가 생성한 바이오필름의 아세틸알긴산을 분해하여 항생제 양을 줄일 수 있다고 보고한 바 있다.
알긴산 분해균주들은 알긴산을 유일한 탄소원으로 이용하여 에너지원으로 사용하기 때문에 알긴산 operon 또는 알긴산 분해관련 유전자 cluster를 가지고 있다. 본 연구실에서 Sphingomonas sp. strain MJ-3 및 Stenotrophomonas maltophilia KJ-2 균주의 알긴산 operon ( alg operon)을 분석하던 중 operon의 마지막 유전자로 만들어지는 단백질이 GDSL-like esterase 단백질과 상동성을 가지는 것으로 분석되었다. 이 유전자를 재조합하여 생화학적 특성을 연구한 결과 P. aeruginosa ATCC 39324 균주로부터 분리한 아세틸알긴산의 아세틸기를 가수분해하는 아세틸알긴산 탈아세틸화효소(AcAlgE) 활성을 가지는 것을 확인하였다[ 12] . 본 연구에서는 재조합 AcAlgE 및 polyM block을 특이적으로 분해하는 알긴산 분해효소를 각각 또는 함께 Pseudomonas aeruginosa 균주가 생산하는 세포 외 다당류인 아세틸알긴산과 반응시켰으며 그 생성물을 NMR 및 FPLC로 분석 비교하였다.
재료 및 방법
- 균주 및 시약
본 연구에 사용한 AcAlgE 및 polyM-specific 알긴산 분해효소는 본 연구실에서 Sphingomonas sp. strain MJ-3 및 Pseudomonas sp. strain KS-408로부터 각각 재조합하여 얻은 효소들로 Park 등[ 12] 과 Kam 등[ 8] 의 방법에 따라 재조합단백질을 과발현시킨 다음 효소들을 분리정제하여 사용하였다 아세틸알긴산은 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입한 P. aeruginosa ATCC 39324를 PIA 고체배지 (Pseudomonas Isolation Agar F, Difco, USA)에서 37℃ 에서 24시간 배양한 후 May 및 Chakrabarty [ 9] 의 방법에 따라 분리 정제하여 사용하였다. 해조류유래 알긴산은 Sigma에서 구입하였으며 polyM block은 Haug 등[ 6] 의 방법에 따라 산 가수분해하여 분리 정제하였다. 탈아세틸 알긴산(De- O -acetylated alginate)은 P. aeruginosa ATCC 39324로부터 얻은 아세틸알긴산을 0.1 N NaOH 용액에 0.2% (w/v) 되도록 녹인 후 60℃ 에서 30분간 가열하고 0.1 N HCl 용액 동량을 가한 다음 중화하고 투석하여 얻었다 [16] .
- 정제한 아세틸알긴산의 acetyl기 함량 분석
P. aeruginosa ATCC 39324가 PIA 고체배지에서 분비한 아세틸알긴산을 분리하고 정제한 후 아세틸알긴산이 함유한 acetyl기의 함량을 hydroxamic acid 반응법을 사용하여 분석하였다[ 10] . 표준물질 glucose pentaacetate를 이용하여 만들어진 표준곡선으로부터 아세틸기 함량을 분석하였으며 520 nm에서 측정하였다..
- 아세틸알긴산 esterase 효소활성시험법
아세틸알긴산 esterase의 활성실험은 Fig. 1B 와 같이 알긴산 분해효소 coupling assay 방법[ 12] 을 이용하였다. 해조류 유래 알긴산( Fig. 1A )과는 달리 박테리아 유래 알긴산은 D-mannuronic acid가 β(1-4) 결합을 한 고분자로 mannuronan 형태이며 2번 탄소 및 3번 탄소에 결합된 산소에 O-아세틸화 되어 있거나 2번과 3번 위치 모두에 아세틸화 되어 있다. Park 등의 방법[ 12] 에 따라 정제한 재조합효소들을 사용하였으며 기질로는 고분자 아세틸알긴산 및 산가수분해하여 얻은 저분자 아세틸알긴산을 사용하였다. 기질에 MJ-3 AcAlgE 및 KS-408 알긴산 분해효소를 각각 가하여 분해산물을 얻거나 또는 먼저 아세틸알긴산 기질에 MJ-3 AcAlgE를 적정한 시간 동안 반응시켜 탈아세틸화한 후 생성된 mannuronan을 polyM-specific 알긴산 분해효소인 KS-408 lyase로 분해하여 생성물을 얻었다. 이때 생성된 분해물은 비환원말단에 이중결합을 가진 dimer, trimer, tetramer 등 oligomannuronate이므로 TBA와 반응시켜 생성된 붉은 색을 얻은 후 548 nm에서 측정하였다 [19] .
- 1H-NMR과 FPLC에 의한 세균 아세틸알긴산의 분해산물의 분석
1 H-NMR 분석을 위한 시료의 준비는 Kam 등의 방법 [8] 에 따랐다. 동결건조한 시료를 D 2 O에 녹여 400 Hz 1 H-NMR spectroscopy (ECX-NMR, JEOL, USA)에서 측정하였으며 NMR 스펙트럼은 Grasdalen [ 4] 및 Zhang 등[ 22] 의 방법에 따라 해석하였다. 내부 표준물질로 TMSP (0.75% 3-(trimethylsilyl)- 2,2′,3,3′-tetradeuteropropionic acid, Na salt)를 사용하였으며 data 수집은 80℃에서 행하였다. 시료의 spinning, proton spectral width, scan 횟수, relaxation delay, proton pulse angle 및 data 수집시간 등은 각각 15 Hz, –5~15 ppm, 64, 5 s, 90° 및 4.098 s 이었다.
P. aeruginosa ATCC 39324를 배양하여 얻은 아세틸알긴산은 고분자로서 점성이 너무 높아 NMR 분석결과가 분명하지 않았으므로 알긴산 고분자를 산가수분해하는 표준방법[ 22] 에 따라 산가수분해하여 중합도를 20~50으로 낮추어 저분자 아세틸알긴산으로 사용하였다. 기질 및 효소분해 생성물들은 동결건조한 후 D 2 O에 녹여 다시 동결건조 시키고 소량의 D 2 O에 녹여 NMR 및 FPLC의 시료로 사용하였다.
결과 및 고찰
- P. aeruginosaATCC 39324로부터 정제한 acetylalginate의 아세틸기 함량 분석
박테리아들은 자신을 보호하거나 먹이에 부착하기 쉽도록 바이오필름을 형성하는데 사용하기 위하여 세포외 다당류들을 생성한다. 해조류 유래 알긴산은 α-L-gluronate와 β-D-mannuronate들로 이루어진 선상다당류인데 비하여 박테리아성 알긴산은 O -2, O -3번 또는 O -2,3 위치에 O -아세틸화 (-OCOCH 3 ) 되어있으며 그 중 P. aeruginosa ATCC 39324가 생산하는 아세틸알긴산은 거의 D-mannuronate로만 구성된 아세틸알긴산이다[ 15] . CF 환자의 가래로부터 분리한 P. aeruginosa ATCC 39324를 ATCC로부터 구입하여 PIA 고체배지에서 배양하고 세균이 분비한 아세틸알긴산을 분리정제하였다. 동결건조한 아세틸알긴산의 아세틸기를 hydroxamic acid 반응으로 분석한 결과 배양조건에 따라 조금씩 차이가 있었으나 28-30%의 아세틸기를 함유하고 있었다. Skjåk-Braek 등 [15] P. aeruginosa DE27은 37-57%, P. mendocina 10541은 30%, P. putida 1007은 4%의 아세틸기를 함유하였으며 A. vinelandii TL은 22%, A. vinelandii IV는 4%의 아세틸기를 함유하였다고 보고하였다.
- 정제한P. aeruginosaATCC 39324 아세틸알긴산의1H-NMR 분석
P. aeruginosa 로부터 정제한 아세틸알긴산은 400 kDa 정도의 높은 분자량을 가지며 Fig. 1B 와 같이 아세틸기를 가지고 있어 점성이 아주 높다[ 18] . Fig. 2A 는 고분자 아세틸알긴산의 NMR 스펙트럼으로 2.2 ppm 정도에서 아세틸기를 확인할 수 있었으나 점성이 높아 구성성분인 mannuronate에 의한 signal은 구별할 수가 없었다. 점성을 낮추고 NMR의 해상도를 높이기 위하여 산가수분해를 행한 결과 Fig. 2B 와 같이 mannuronate의 C-1에 결합된 proton signal (M-1, 4.8-4.6 ppm), mannuronate의 O -아세틸기(-OCOCH 3 )가 결합된 C-2와 C-3의 proton signal (M-2' 및 M-3')을 확인할 수 있었으며 2.2 ppm에서 아세틸기도 확인할 수 있었다. ATCC39324 아세틸 알긴산으로부터 알칼리 가수분해를 행하여 얻은 탈아세틸 알긴산의 NMR 스펙트럼은 Fig. 2C 와 같이 O-2 및 O-3에 결합되어 있던 아세틸기가 제거되어 M-2' 및 M-3' peak가 없어지고 2.2 ppm에서 보이던 아세틸기도 나타나지 않았다. 또한 P. aeruginosa 탈아세틸화 알긴산은 Fig. 2D 에 보이는 해조류 유래 polyM-block의 NMR 스펙트럼과 유사하였으며 이로 부터 P. aeruginosa ATCC 39324유래 알긴산은 아세틸기가 결합한 mannuronan임을 알 수 있었다. 알긴산을 생성하는 또 다른 박테리아인 A. vinelandii P. aeruginosa 와는 달리 guluronate가 67-93% 함유되어 있고 아세틸기는 mannuronate에만 결합되어 있다고 하였다[ 15] .
PPT Slide
Lager Image
Comparison of 1H NMR spectra of acetylalginate, acid hydrolyzed acetylalginate, alkali treated de-O-acetylated bacterial alginate and polyM block from alginate. Bacterial acetylalginate with high molecular weight was purified from Pseudomonas aeruginosa ATCC 39324 (A). Acid hydrolyzed acetylalginate was prepared by acid hydrolysis for reducing the viscosity (B). De-O-acetylalginate was obtained by alkali treatment of bacterial acetylalginate (C). PolyM block was prepared by acid hydrolysis from sodium alginate hydrolysate (D). The signal originated from the underlined residue (M). The numbers denote proton causing the signal. M2' and M3' are corresponding M2 and M3 protons in the acetylated mannuronate residues.
- MJ-3 AcAlgE와 KS-408 lyase에 의한 아세틸알긴산의 분해
본 실험실에서는 Sphingomonas sp. MJ-3 균주의 genomic DNA library로부터 알긴산 오페론 유전자를 분리하였으며 염기서열을 분석한 결과 아세틸자일란 가수분해효소(acetylxylan esterase)와 상동성을 가지는 유전자가 포함되어 있었고 이 유전자로부터 발현된 효소(AcAlgE)는 실험결과 4-methyl-umbelliferyl acetate를 가수분해하는 esterase 활성을 가지며 아세틸알긴산의 아세틸기를 가수분해하는 효소활성이 있음을 보고한 바 있다[ 12] . AcAlgE의 활성을 측정하기 위하여 기질은 고분자 아세틸알긴산과 저분자 아세틸알긴산을 사용하였으며 효소액은 MJ-3 AcAlgE와 KS-408 알긴산 분해효소 유전자를 과발현 시킨 대장균의 lysozyme 균질액을 사용하였다. Fig. 3 에서와 같이 고분자 아세틸알긴산은 점성이 너무 높아 효소의 접근성이 떨어져 D-mannuronate 와 D-mannuronate의 β(1-4) 결합을 분해하는 KS-408 알긴산 분해효소만 처리하였을 때(KS-408 only) 불포화 oligouronate의 생성이 낮은 것에 비해 산가수분해로 얻은 저분자 아세틸알긴산은 KS-408 알긴산 분해효소에 의해 2.6배의 불포화 oligouronate가 생성되었다. KS-408 알긴산 분해효소는 아세틸기가 결합되지 않은 M-M 결합을 분해하므로 아세틸기가 결합되어 있는 AcM-AcM은 분해하지 못한다. 먼저 MJ-3 AcAlgE 효소로 아세틸알긴산의 아세틸기를 제거한 다음 KS-408 알긴산 분해효소로 10분 동안 반응시켰을 경우(AcAlgE + KS-408) KS-408 분해효소만 처리하였을 때 보다 알긴산의 분해가 잘 되었음을 알 수 있었다. 또한 고분자 아세틸알긴산은 점성이 높아 저분자 아세틸알긴산보다 AcAlgE에 의한 아세틸기 제거가 쉽지 않고 따라서 이후의 KS-408 첨가 결과 불포화 oligouronate의 생성도 낮은 것을 알 수 있었다. 과일의 pectin이나 식물의 세포벽 구성성분인 xylan 등은 acetylgalacturonan methylester 또는 acetylxylan 등으로 되어있다. Biely 등[ 3] 은 acetylxylan을 xylanase로 완전히 분해할 수 없어 바이오연료로 응용하기 위해서는 먼저 xylan acetylesterase로 분해하여 당분해효소 (xylan 분해효소)의 효율을 높일 수 있다고 하였다. 또한 과일에 병을 일으키는 균들이 pectin을 에너지원으로 사용하기 위하여 pectin acetylesterase, pectin methylesterase, galacturonan lyase 등을 가지고 있다고 하였다[ 14] . Acetylxylan을 효율적으로 분해하기 위하여 xylan 아세틸기 가수분해효소를 처리하는 것과 같이 병원성균 P. aeruginosa 가 분비하는 아세틸 알긴산도 먼저 아세틸기를 제거한 다음 알긴산 분해효소를 처리하였을 때 효율적으로 분해되었음을 알 수 있었다.
PPT Slide
Lager Image
Effects of the MJ-3 AcAlgE on the degradation of bacterial acetylalginate by alginate lyase. 1% (w/v) acetylalginate was incubated with or without AcAlgE recombinant cell lysate in 25 mM citrate buffer (pH 6.5) at 25℃ for 10 min. A 50 μl reaction mixture was withdrawn and boiled to remove the enzyme activity. After cooling, 30 μl of 100 mM phosphate buffer (pH 8.0) and 20 μl KS-408 alginate lyase were added and incubated at 40℃ for further 10 min. After heating, the amount of unsaturated uronate products was determined by TBA method. All experiments were conducted three times.
- 아세틸알긴산 효소분해물의1H-NMR 스펙트럼 분석
고분자 아세틸알긴산 및 산가수분해로 얻은 저분자 아세틸 알긴산에 MJ-3 AcAlgE 또는 KS-408 알긴산 분해효소만을 처리하였거나 AcAlgE와 KS-408 알긴산 분해효소를 함께 처리하였을 때 생성된 분해물을 동결건조하고 D 2 O로 녹인 다음 1 H-NMR 스펙트럼을 측정한 결과는 Fig. 4 와 같았다. Fig. 4A 에서와 같이 고분자 아세틸알긴산에 AcAlgE만을 처리하였을 때 2.2 ppm의 peak 크기로 보아 총 아세틸기가 많이 남아있음을 알 수 있고 M-2' 및 M-3' peak들도 남아있음을 알 수 있었다. PolyM-block에 KS-408 알긴산분해효소를 처리하면 Fig. 4C 에서와 같이 거의 다 분해되어 불포화 dimer와 trimer를 생성하며 NMR 스펙트럼에서는 -4-M peak (5.8 ppm), M -1 red peak (4.9 ppm 및 5.4-5.2 ppm) 등 분해산물들의 peak들이 보이는데 고분자 아세틸알긴산의 경우 -4-M peak (5.8 ppm)가 거의 보이지 않는 것을 보아 Fig. 3 의 결과에서와 같이 높은 점성으로 인한 효소접근성이 떨어져 M-M 사이의 분해가 제대로 일어나지 않은 것으로 보인다. 그러나 아세틸기 분해효소인 AcAlgE와 알긴산 분해효소인 KS-408 분해효소를 함께 처리한 경우에는 2.2 ppm의 아세틸기 peak가 많이 감소하고 -4-M (5.8 ppm) 및 M -1 red (5.2 및 4.9 ppm) 등 비환원말단을 나타내는 peak들이 증가하였으므로 AcAlgE와 KS-408 분해효소를 함께 처리하면 아세틸알긴산의 분해효과가 높아짐을 알 수 있다. 산가수분해하여 20-50개의 mannuronate가 결합된 저분자 아세틸알긴산에 효소들을 처리한 경우는 Fig. 4B 와 같았다. AcAlgE를 처리하였을 때 Fig. 4A 의 경우보다 아세틸기 (2.2 ppm)가 많이 제거되었으며 M-1 peak (4.7 ppm)가 증가하는 반면 M-2' 또는 M-3' peak가 많이 감소하여 탈아세틸화가 많이 진행되었음을 볼 수 있었다. KS-408 분해효소를 처리하였을 경우에도 -4-M (5.8 ppm)가 증가한 것을 보아 고분자 아세틸알긴산보다는 올리고머가 많이 생성되었음을 알 수 있고 TBA 방법으로 실험한 결과( Fig. 3 )와 유사함을 알 수 있었다. 아세틸기 분해효소인 AcAlgE와 알긴산 분해효소인 KS-408 분해효소를 함께 처리한 경우 아세틸기는 완전히 제거되었고 -4-M (5.8 ppm) 및 M -1 red (5.2 및 4.9 ppm) 등 비환원말단을 나타내는 peak들이 증가하여 polyM block을 알긴산 분해효소로 분해하였을 때와 같이 분해산물에서 나오는 peak들을 관찰할 수 있었다.
PPT Slide
Lager Image
Comparison of 1H NMR spectra of ezymatic degradation products from acetylalginate and polyM block from alginate. (A) Bacterial acetylalginate with high molecular weight was digested by MJ-3 acetylalginate esterase (AcAlgE) or polyM-specific alginate lyase (KS-408). (B) Acid hydrolyzed bacterial acetylalginate with a degree of polymerization of about 20 to 50 was digested by AcAlgE or KS-408. (C) PolyM block was digested by polyM-specific alginate lyase (KS-408). The signal originated from the underlined residue (M). The numbers denote proton causing the signal. M without underline indicates neighbor residue of signal-causing residue. △ means unsaturated uronate on nonreducing end. M2' and M3' are corresponding M2 and M3 protons in the acetylated mannuronate residues.
CF 환자들이 P. aeruginosa 균에 감염되었을 경우 P. aeruginosa 균들이 생산하는 아세틸알긴산들과 염증반응 때문에 증가하는 중성백혈구 유래 DNA와 actin 등이 당단백질과 결합하여 호흡기에 바이오필름을 형성하게 된다. Alipour 등[ 1] 에 의하면 DNase 및 알긴산 분해효소와 함께 aminoglycoside를 처리한 경우 항생제 활성이 증가한다고 하였으며 Hatch와 Schiller [ 5] 는 알긴산 분해효소의 처리가 P. aeruginosa 가 생성하는 세포외 다당류 속으로 항생제를 확산시키는데 도움이 된다고 하였다. 본 실험의 결과로 보아 알긴산 분해효소 만으로 박테리아가 분비하는 점성이 높은 세포외 다당류를 분해하기는 쉽지 않고 아세틸알긴산 분해효소인 AcAlgE와 알긴산 분해효소를 함께 처리하는 것이 항생제의 활성을 더욱 높여줄 것으로 생각된다.
- 아세틸알긴산 효소분해물의 FPLC 분석
1 H-NMR 스펙트럼을 측정하기 위하여 0.5% (w/v) 고분자 아세틸알긴산에 Ni-sphepharose 친화력 크로마토그라피로 정제한 알긴산 분해효소만을 가한 것과 아세틸분해효소 및 알긴산 분해효소를 함께 가하고 반응시켜 얻은 생성물( Fig. 4A )을 FPLC로 분석한 결과는 Fig. 5 와 같았다. Fig. 5A 는 정제한 KS-408 알긴산 분해효소를 가한 것으로 점성이 높고 아세틸기가 붙어있는 기질을 분해하기 어려워 tetramer 이상의 분자량이 큰 올리고머들이 적은 양 생성될 수 있었던 것으로 보인다. MJ-3 AcAlgE를 가하여 아세틸기를 먼저 제거한 후 알긴산 분해효소를 넣어 반응시킨 생성물의 FPLC 분석 결과는 Fig. 5B 와 같았다. AcAlgE를 넣지 않고 KS-408 알긴산 분해 효소만 넣었을 경우 생성되는 올리고머들의 함량에 비하여 AcAlgE와 KS-408 알긴산 분해효소를 함께 넣어서 생성되는 dimer, trimer, tetramer 등 적은 분자량의 올리고머 함량을 계산하면 20배 이상 생성되었음을 알 수 있었다. 이들 결과들로 보아 병원성균 P. aeruginosa 가 생산하는 바이오필름의 구성성분인 고분자 아세틸알긴산을 효과적으로 분해하기 위해서는 아세틸기 분해효소인 AcAlgE와 알긴산 분해효소를 함께 처리하는 것이 좋을 것이다.
PPT Slide
Lager Image
FPLC profile of degraded acetylalginate by the recombinant MJ-3 AcAlgE and KS-408 polyM-specific lyase. (A) 0.5% Acetylalginate solution was degraded by purified KS-408 lyase only. (B) After 0.5% Acetylalginate solution was degraded by purified MJ-3 AcAlgE, KS-408 lyase was added and incubated overnight.
그러나 Sphingomonas sp. MJ-3에서 얻은 AcAlgE 유전자를 thioredoxin protein 이나 glutathione S-transferase 등과 융합시켜 soluble 한 형태로 발현시키고자 하였으나 pET21, pET32 또는 pET42 vector 들에 발현시켰을 때 다량의 inclusion body만을 얻을 수 있었다(data not shown). Maltose binding protein (MBP)과 융합되어 재조합 단백질을 발현시킬 수 있는 pMal-c2X vector에 cloning 하여 MBP-AcAlgE 단백질을 얻었을 때에는 soluble 형태로 얻을 수 있었으나 낮은 온도인 22-25℃에서 최적 활성을 보여 CF 환자들에게 응용하기에는 문제가 있을 것으로 생각되었다[ 12] . 따라서 site-directed mutagenesis 또는 transmembrane domain 제거 등을 통한 방법을 이용하여 높은 온도에서 활성을 가지는 재조합 단백질을 얻을 수 있도록 연구를 진행하고 있다.
Acknowledgements
이 논문은 2013학년도 경성대학교 학술연구비지원에 의하 여 연구되었으므로 이에 감사드립니다.
References
Alipour M. , Suntres Z. E. , Omri A. 2009 Importance of DNase and alginate lyase for enhancing free and liposome encapsulated aminoglycoside activity against Pseudomonas aeruginosa J Antimicrob Chemother 64 317 - 325    DOI : 10.1093/jac/dkp165
2010 ASTM F2259-10. Standard test method for determining the chemical composition and sequence in alginate by proton nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectroscopy
Biely P. , Mastihubová P. , Tenkanen M. , Eyzaguirre J. , Li X. L. , Vršmanská M. 2011 Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of β-D-xylopyranose and α-L-arabinofuranose J Biotechnol 151 137 - 142    DOI : 10.1016/j.jbiotec.2010.10.074
Grasdalen H. 1983 High-field,1n.m.r. spectroscopy of alginate: sequential structure and linkage conformations Carbohydr Res 118 255 - 260
Hatch R. A. , Schiller N. L. 1998 Alginate lyase promotes diffusion of aminoglycosides through the extracellular polysaccharide of mucoid Pseudomonas aeruginosa Antimicrob Agents Chemother 42 974 - 977
Haug A. , Larsen B. , Smidsrot O. 1966 A study of the constitution of alginic acid by partial acid hydrolysis Acta Chem Scand 20 183 - 190    DOI : 10.3891/acta.chem.scand.20-0183
Hay I. D. , Gatland K. , Campisano A. , Jordens J. Z. , Rehm B. H. A. 2009 Impact of alginate overproduction on attachment and biofilm architecture of a supermucoid Pseudomonas aeruginosa strain Appl Environ Microbiol 75 6022 - 6025    DOI : 10.1128/AEM.01078-09
Kam N. , Park Y. J. , Lee E. Y. , Kim H. S. 2011 Molecular identification of a polyM-specific alginate lyase from Pseudomonas sp. strain KS-408 for degradation of glycosidic linkages between two mannuronates or mannuronate and guluronate in alginate Can J Microbiol 57 1032 - 1041
May T. B. , Chakrabarty A. M. 1994 Isolation and assay of Pseudomonas aeruginosa alginate Methods Enzymol 235 295 - 304    DOI : 10.1016/0076-6879(94)35148-1
McComb E. A. , McCready R. M. 1957 Determination of acetyl in pectin and in acetylated carbohydrate polymers Anal Chem 29 819 - 821    DOI : 10.1021/ac60125a025
Nivens D. E. , Ohman D. E. , Williams J. , Franklin M. J. 2001 Role of alginate and its O acetylation in formation of Pseudomonas aeruginosa microcolonies and biofilms J Bacteriol 183 1047 - 1057    DOI : 10.1128/JB.183.3.1047-1057.2001
Park Y. J. , Chu Y. J. , Shin Y. H. , Lee E. Y. , Kim H. S. 2013 Molecular cloning and characterization of a novel acetylalginate esterase gene in alg operon from Sphingomonas sp. MJ-3 Appl Microbiol Biotechnol
Pedersen S. S. , Hoiby N. , Espersen F. , Koch C. 1992 Role of alginate in infection with mucoid Pseudomonas aeruginosa in cystic-fibrosis Thorax 47 6 - 13    DOI : 10.1136/thx.47.1.6
Shevechik V. E. , Robert-Baudouy J. H. , Huguvieux-Cotte-Pattat N. 2003 Pectate lyase Pel1 of Erwinia chrysanthemi 3937 belongs to a new family J Bacteriol 185 3091 - 3100    DOI : 10.1128/JB.185.10.3091-3100.2003
Skjåk-Braek G. , Grasdalen H. , Larsen B. 1986 Monomer sequence and acetylation pattern in some bacterial alginates Carbohydr Res 154 239 - 250    DOI : 10.1016/S0008-6215(00)90036-3
Sutherland I. W. , Keen G. A. 1981 Alginase from Beneckea pelagia and Psudomonas spp J Appl Biochem 3 48 - 57
Uwe R. , Rehm B. H. A. 2006 Bacterial alginate : from biosynthesis to applications Biotechnol Lett 28 1701 - 1712    DOI : 10.1007/s10529-006-9156-x
Veeranagouda Y. , Basavaraja C. , Bae H.-S. , Liu K.-H. , Lee K. 2011 Augmented production of poly-β-D-mannuronate and its acetylated forms by Pseudomonas Proc Biochem 46 328 - 334    DOI : 10.1016/j.procbio.2010.09.009
Weissbach A. , Hurwitz J. 1959 The formation of 2-keto-3-deoxyheptonic acid in extracts of Escherichia coli B J Biol Chem 234 705 - 709
Wong T. Y. , Preston L. A. , Schiller N. L. 2000 Alginate lyase: Review of major sources and enzume characteristics, structure-function analysis, biological roles, and application Annu Rev Microbiol 54 289 - 340
Yu J. , Penatroza-Vazquea P. , Chakrabarty A. M. , Bender C. L. 1999 Involvement of the exopolysaccharide alginate in the virulence and epiphytic fitness of Pseudomonas syringae pv. Syringae Mol Microbiol 33 712 - 720
Zhang Z. , Yu G. , Guan H. , Zhao X. , Du Y. , Jiang X. 2004 Preparation and structure elucidation of alginate oligosaccharides degraded by alginate lyase from Vibrio sp. 510 Carbohydr Res 258 1475 - 1481