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Induction of p53-dependent Apoptosis by Resveratrol in Human Cancer Cells, A549 and SKOV3
Induction of p53-dependent Apoptosis by Resveratrol in Human Cancer Cells, A549 and SKOV3
Microbiology and Biotechnology Letters. 2016. Jun, 44(2): 194-200
Copyright © 2016, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology
  • Received : December 30, 2015
  • Accepted : March 10, 2016
  • Published : June 28, 2016
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슬기, 이
주옥, 남
namjo@knu.ac.kr

Abstract
Resveratrol은 포도, 오디, 땅콩과 같은 많은 과일과 채소에 존재하는 폴리페놀 화합물로써 다양한 생물학적 효과를 가진다고 보고되어있다. 그러나, resveratrol이 A549 폐암세포에서 유도하는 apoptosis에 관여하는 분자적 기전 및 anoikis에 관해서는 명백하게 밝혀지지 않았다. 본 연구에서, 우리는 정상적인 p53 유전자를 갖는 A549 세포에서 resveratrol의 효과를 조사하고, p53 유전자가 결실된 SKOV3 난소암 세포와 그 효과를 비교했다. Resveratrol은 확실하게 SKOV3 세포에 비해 농도, 시간의존적으로 A549 세포의 생존과 증식을 억제했다. 또한 resveratrol은 A549 세포의 apoptosis를 유도했지만 세포의 anoikis 저항성에는 영향을 미치지 않았다. 더불어, p53 유전자 기능이 불완전 소실된(knock-down) A549 세포의 생존과 증식은 resveratrol에 의해 변하지 않았다. 그러므로, 본 연구의 결과는 resveratrol의 항암 효과가 기능을 하는 p53 유전자의 존재에 의존한다는 것을 보여준다. 결론적으로, 우리는 resveratrol이 p53 유전자에 의존적으로 A549 세포에 대해 항암효과를 가진다는 것을 입증했다.
Keywords
서 론
암은 전세계적으로 인류의 건강과 생명을 위협하는 사망률이 높은 질병 중 하나이며, 암 관련 사망자의 수는 향후 50년간 2배 증가할 것으로 예상된다 [3] . 따라서 암 치료를 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있고, 최근 프로그램된 세포 죽음을 표현하는 용어인 세포자멸사(apoptosis)에 대한 분자 기전연구가 활발히 진행되고 있다 [14] . Apoptosis는 세포 스스로 조절이 가능한 능동적 과정이지만, 암세포의 경우 apoptosis에 대한 저항성을 갖기 위해 세포 내 다양한 분자 기전 교란을 일으킴으로써 항암제에 대한 저항성을 가질 수 있다 [1 , 6] . Anoikis는 apoptosis의 아류형이며 부적절한 세포 부착 혹은 부착의 손실에 의해 일어난다 [17] . 일반세포는 부착되지 않은 상태에서 생존하지 못하고 Anoikis라는 세포 사멸과정을 거치게 되는데 이에 반해, 암세포의 경우 부착되지 않은 상태에서도 spheroid 형태를 형성하여 성장할 수 있으며, 생체 내에서 혈류를 통해 다른 기관으로 이동할 수 있으므로, 암세포의 Anoikis 저항성은 세포의 전이능력과 연관성이 있다 [10] .
Resveratrol은 자연계에 널리 존재하는 폴리페놀류의 한 종류이며 와인, 땅콩, 오디 등의 식품에 함유되어 있다 [9] . 또한 백혈병과 전립선암, 유방암과 같은 다양한 상피암종의 세포증식 억제 효과를 가진다고 보고되었다 [13] . 이러한 효과는 세포주기의 억제와 apoptosis 유도를 통해 나타나며, 이 과정에서 p53 유전자가 관여한다고 보고된 바 있다 [5] . 종양 억제유전자로 널리 알려진 p53의 돌연변이는 인간암세포에서 흔히 관찰되고 정상적인 p53은 FAS, Bax, Bcl-2 등 다양한 apoptosis 관련 유전자들의 발현을 조절함으로써 apoptosis를 유발한다 [12 , 18] . 최근 항암효과를 가지는 다양한 천연소재에서 apoptosis를 조절하는 중요한 메커니즘을 규명하는 연구가 꾸준히 이루어지고 있으며 [8 , 14] , 이전의 연구는 resveratrol이 A549 세포의 성장을 억제하고 apoptosis를 유도하는 등의 항암효과를 가진다는 것을 보고한 바 있다 [16] . 그러나, resveratrol이 정상적인 p53 유전자를 가지는 A549 세포의 anoikis 저항성에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 연구와 p53 유전자가 결실된 SKOV3 세포와의 차이점에 대해서는 보고된 바 없다.
그러므로 본 연구에서는 resveratrol이 A549 폐암세포와 SKOV3 자궁암세포의 생존 및 사멸에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고 또한 이러한 과정에서 p53이 관여하는 조사하였다.
재료 및 방법
- 시약 및 재료
본 실험에서 사용한 resveratrol은 Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, MO, USA)에서 구입하였고 dimethyl sulfoxide (DMSO, 5 mg/ml) 에 용해한 뒤 -20℃에 보관하였다. p53 small interfering RNA (siRNA), 대조군 siRNA, beta-actin antibody는 Santa cruz biotechnology사(CA, USA)에서 구입하였다. Pro-caspase3, p53 antibodies는 Cell signaling technology사(MA, USA)에서 구입하였다.
- 세포배양
A549 세포는 wild-type의 p53 유전자를 가지고 있는 폐암 세포주이며 SKOV3는 p53 유전자가 결실된 자궁암 세포주이다 [2 , 11] . A549, SKOV3 세포는 한국 세포주 은행 (KCLB)으로부터 분양받았고, 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin 그리고 100 µg/ml streptomycin을 포함하는 RPIM-1640 배지에 5% CO 2 가 공급되는 37℃ incubator에서 배양하였다. 배양 중인 세포의 배지는 2−3일에 한번 새로운 배지로 교체해주었다.
- 세포 생존율 측정(MTT assay)
A549, SKVO3 세포를 96-well plates에 각 well 당 4 × 10 3 으로 100 µl의 medium과 함께 분주하고 5% CO 2 가 공급되는 incubator에서 24시간 동안 배양한 후, 각 well 마다 resveratrol을 20, 40, 60, 80, 100 (µM) 농도로 처리하고 24, 48시간 배양하였다. Control group에는 resveratrol을 넣지 않고 동일한 양의 DMSO를 넣었다. 배양 후 medium을 제거하고 MTT (0.4 mg/ml) 를 20 µl/well 넣고 incubator에서 3시간 배양한 뒤 iso-propyl alcohol을 100 µl/well 넣어 생성된 formazan을 용해시킨 뒤, infinite reader를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정했다. 측정값은 3번은 반복하여 평균값으로 얻었다.
- 세포사멸 검출
A549, SKOV3 세포를 chamber slide (Lab-Tak II chamber slider system, USA)에 각 well 당 4 × 10 4 로 분주한 뒤 24시간 동안 부착시키고, resveratrol을 각 농도 별로 처리 후 48시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 4% para-formaldehyde로 상온에서 10분간 세포를 고정시킨 후, terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling (TUNEL) assays는 Red in situ apoptosis Detection kit (Millipore Corporation, MA, USA)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. DAPI로 DNA를 대조 염색한 후, 형광현미경을 이용하여 각 농도에 따른 핵의 형태를 관찰 하였고, 무작위적으로 5개의 필드를 선택하여 평균치를 구하였다.
- 부착성 상실 세포사멸 실험(anoikis assay)
Anoikis assay는 CytoSelect 96-well anoikis assay kit (Biolab Diagnostics, South Africa)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. Resveratrol을 농도별로 포함하는 medium에 A549, SKOV3 세포를 부유시킨 뒤, 각 well 당 0.5 × 10 5 으로 hydrogel이 코팅된 96-well plate에 분주했다. Resveratrol 처리 48시간 후, 각 well에 MTT reagent를 첨가하고 3시간 반응시킨 뒤, detergent solution를 첨가하였다. 3시간 배양 후, infinite reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- siRNA를 이용한 p53 유전자 일시적 침묵
A549 세포에서 siRNA transfection은 p53에 특이적인 siRNA (p53 siRNA)와 양성대조군인 scrambled control siRNA (control siRNA)를 이용하여, 각각의 siRNA를 lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA)과 섞어 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. Transfection시킨 뒤, resveratrol을 농도 별로 48시간 처리하였고, 단백질 발현 분석을 통해 siRNA의 효율성을 검증하였다.
- Western blot 분석
각 실험조건에 따라 resveratrol을 농도 별로 처리한 A549, SKOV3 세포를 lysis buffer에 용해한 뒤, 15,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 상층액에 있는 전체 단백질을 얻었다. 100℃에서 10분간 가열하여 sample을 얻었고 동일한 양의 단백질을 sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel에 의해 분리시켰다. 분리된 단백질을 Nitrocellulose membranes에 전달시킨 뒤, TBST에 용해시킨 5% non-fat skim milk를 이용하여 blocking하였다. 그 후, 1차 항체를 4℃에서 overnight 처리하였고 2차 항체는 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, enhanced chemiluminescence reagent (GEHealthcare, UK)를 membrane에 도포하고 X-ray film에 노출시켜 시각화하였다.
결과 및 고찰
- Resveratrol이 A549, SKOV3 세포의 생존과 성장에 미치는 영향
Resveratrol이 A549, SKVO3 세포의 생존에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 시행하였다. Resveratrol을 농도 별(0, 20, 40, 60, 80, 100 µM)로 각각 24, 48시간 처리한 후 세포 생존율을 측정한 결과, resveratrol은 A549 세포의 생존을 농도, 시간의존적으로 억제하였다. 반면에 SKOV3 세포의 생존에는 영향을 미치지 않았다( Fig. 1A , B ). Resveratrol이 세포의 성장에도 영향을 미치는지 알아보기 위해, BrdU incorporation assay를 시행하였다. 그 결과 A549 세포의 증식 비율은 resveratrol 처리 농도에 따라 점차적으로 감소하였다. 반면에 SKOV3 세포의 증식에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다( Fig. 1C ). 이러한 결과를 통해 resveratrol이 농도 의존적을 A549 세포의 생존과 증식을 억제하고, SKOV3 세포에는 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다.
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Effect of resveratrol on the viability and proliferation of A549 and SKOV3 cells. Human lung carcinoma A549 cells (A) and human ovarian carcinoma SKOV3 cells (B) treated with resveratrol at various concentrations for 24 and 48 h. The effect of resveratrol on cell viability was determined by MTT assay. (C) Cells were exposed to various concentrations of resveratrol for 48 h. The effect of resveratrol on cell proliferation was determined by BrdU assay. Values are mean ± S.D. of three experiments, with triplicate of each experiment.
- Resveratrol이 A549 세포의 apoptosis에 미치는 영향
다음으로, resveratrol이 A549, SKOV3 세포의 apoptosis를 유도하는지 조사하였다. Resveratrol을 농도 별(0, 40, 100 µM)로 48시간 처리 후, 세포의 핵에 염색되어 형태적 변화를 관찰할 수 있는 DAPI 염색과 DNA의 분절여부를 파악할 수 있는 TUNEL 염색을 시행하였다. 그 결과, A549 세포에서는 DAPI에 의해 염색된 세포의 수가 확실하게 감소하였다는 것을 관찰할 수 있었고, TUNEL에 의해 염색된 세포는 resveratrol 처리 농도에 따라 증가하는 것을 확인하였다. 반면에, SKOV3 세포에서는 TUNEL에 의해 염색된 세포가 거의 없는 것으로 나타났고 염색된 세포의 형광강도와 면적 또한 현저히 적었다( Fig. 2A - B ). Resveratrol에 의해 유도된 세포 apoptosis 비율을 확인하기 위해, TUNEL에 염색된 세포/DAPI에 염색된 세포의 비율을 분석한 결과 resveratrol을 100 µM의 농도로 처리하였을 때, 확실하게 apoptosis가 일어난 A549 세포의 비율이 증가했다는 것을 확인하였다( Fig. 2C ). 이러한 결과들을 통해 A549 세포에서 resveratrol의 생존억제 효과는 apoptosis 유도와 연관성이 있다고 보여지며, SKOV3 세포에서는 크게 영향을 미치지 않는 것으로 보여진다.
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Apoptotic cell death of A549 and SKOV3 cells by resveratrol. A549 cells (A) and SKOV3 cells (B) were treated with resveratrol (0, 40, 100 μM) for 48 h. A representative images of DAPI (blue)-, TUNEL (red)-stained cells and merged image are shown on the left, middle, and light, respectively. While DAPI stains the entire nuclei, TUNEL stains the apoptotic and necrotic cells. (C) Quantification of number of TUNEL-stained cells/number of DAPI stained cells. (D) suspension-cultured A549 and SKOV3 cells were treated with resveratrol for 48 h in hydrogel coated-96 well plate. Cell survival was assessed by the anoikis assay. Values are mean ± S.D. of three experiments, with triplicate of each experiment.
세포와 세포 외 기질과의 결합이 끊어질 때, 정상 세포는 anoikis에 빠지게 되어 대부분의 세포가 죽는 반면 암세포는 고착 비의존성 성장(anchorage-independent growth)을 함으로써 부착할 수 있는 기층(substratum) 없이 생존이 가능하다 [4] . 그러므로 우리는 resveratrol이 A549, SKOV3 세포의 anoikis 저항성에 영향을 미치는지 조사하기 위해 resveratrol을 농도별로 48시간 처리한 후 anoikis assay를 시행하였다. 그 결과 두 가지 세포 모두에서 resveratrol에 의한 anoikis 유도 효과가 없었다( Fig. 2D ). 이러한 결과는 resveratrol이 A549 세포가 부착상태일 때는 apoptosis를 유도 하지만 부유상태일 때는 세포생존에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. 또한 이러한 결과는 resveratrol이 일차 종양세포의 증식은 억제하지만, 전이과정에서 다른 기관으로 이동하는 세포의 증식을 억제하는 효과는 없다는 것을 의미한다.
- Resveratrol이 apoptosis 관련 단백질의 발현에 미치는 영향
Caspases는 세포내에서 불활성화된 proenzyme의 형태로 존재하여 세포사멸 신호에 의해 분절되어 활성화 된다 [15] . 그 중 caspase3는 apoptosis 유발인자들에 의해 caspase cascade가 일어나면 다른 caspase에 의해 활성화되며, apoptosis 유도의 최종 단계에서 중 중요한 역할을 하는 effecter caspase이다 [7] . 그러므로, resveratrol을 A549 세포에 처리했을 때 농도의존적으로 apoptosis가 유도되는 현상의 분자적 기전 분석을 위하여 pro-caspase3 단백질의 발현 변화를 western blot을 통해 확인하였다. 그 결과, A549 세포에서 resveratrol에 농도가 증가함에 따라 pro-caspase3의 발현이 억제되었고, SKOV3 세포에서는 변화가 없었다( Fig. 3A - B ). pro-caspase3의 발현량의 감소로 A549 세포의 apoptosis 유도 효과에 caspase3가 관여한다는 것을 확인하였다.
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Effect of resveratrol on the expression of apoptosis-related protein. A549 cells (A) and SKOV3 cells (B) were treated with resveratrol at various concentrations for 48 h. After treatment with resveratrol, the cells were lysed and the expression of pro-spase3 was confirmed by western blot analysis. Equal amount of loading was confirmed by the quantification of β-actin.
- P53 knock-down(유전자 기능의 불완전 소실)에 의한 resveratrol의 A549 세포 증식억제 및 caspase 발현 조절효과
위 실험들을 통해 resveratrol이 A549 세포의 apoptosis를 유도한다는 것과 반면에 SKOV3 세포에는 어떠한 영향도 미치지 않는다는 것을 알아냈다. P53은 apoptosis를 유발하는 것으로 잘 알려져 있으므로, 이러한 결과가 p53 유전자 발현에 의존한 것인지 알아보기 위해 정상적인 p53 유전자를 가지는 A549 세포에 siRNA를 이용하여 일시적으로 p53 유전자의 발현을 억제시켰다. P53 유전자가 확실하게 억제되 었음을 확인한 후( Fig. 4A ), p53 유전자가 억제된 세포에 resveratrol을 농도별(0, 40, 100 µM)로 48시간 처리하여 pro-caspase3의 발현량을 확인하였다. 그 결과 resveratrol 처리에 의한 pro-caspase3의 발현량에 변화가 없었다( Fig. 4B ). 또한 p53 유전자가 억제된 A549 세포의 생존율과 성장률 모두 변화가 없었다( Fig. 4C , D ). 반면 control siRNA를 처리한 세포는 상기의 결과들과 동일하게 세포생존과 증식 모두 resveratrol 처리농도에 따라 감소하였다. 이러한 결과는 resveratrol에 의한 A549 세포의 생존 및 증식억제 효과는 p53 유전자에 의존한다는 것을 보여준다.
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Effect of resveratrol in A549 cells transfected with p53 siRNA. (A) A549 cells transfected with control siRNA or p53 siRNA for 16 h and p53 siRNA efficiency was confirmed by western blot analysis. (B) Transfected cells were treated with resveratrol for 48 h and then cell lysates were prepared for western bolt analysis. Transfected cells were seeded in 96-well plate and treated group was treated with resveratrol for 48 h. Cell viability (C) and proliferation (D) were determined by MTT assay and BrdU assay, respectively. Values are mean ± S.D. of three experiments, with triplicate of each experiment.
결론적으로 본 연구에서는 resveratrol에 의해 유도된 A549 세포의 증식억제 및 apoptosis 유도 효과는 p53 유전자에 의존적임을 SKOV3 세포와의 비교를 통해 알아냈고, 또한 세포가 부유상태일 때는 억제 효과가 나타나지 않는다는 것을 보여준다. 본 연구 결과는 A549 폐암세포에서 resveratrol의 항암효과에 대한 기전을 밝히는데 기여할 수 있다고 사료된다.
Acknowledgements
This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research foundation of Korea (NRF) funded by Ministry of Education (NRF-2013R1A1A2064784); by Kyungpook National University Research Fund, 2012.
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