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Characterization of Chlorella vulgaris Mutants Producing High Chlorophyll
Characterization of Chlorella vulgaris Mutants Producing High Chlorophyll
Microbiology and Biotechnology Letters. 2015. Sep, 43(3): 275-279
Copyright © 2015, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology
  • Received : July 29, 2015
  • Accepted : September 02, 2015
  • Published : September 28, 2015
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현진 박
옥주 김
지민 하
태오 최
재화 이
jhalee@silla.ac.kr

Abstract
본 연구는 Chlorella vulgaris 에 자외선을 조사하여 획득한 변이주 중 색소함량이 높은 변이주 2종(UBM1-2, UBM2-57)의 특성을 분석하였다. 2종의 변이주의 생장속도는 WT와 비교했을 때 20% 가량 더딘 생장율을 보였고, 세포건조 중량 및 단백질 함량 또한 세포생장과 비슷한 패턴을 보였다. 지질 함량은 UBM1-2 변이주에서 WT와 비교 시 21% 높은 지질 함량을 확인하였지만, UBM2-57 변이주는 WT보다 39% 낮은 지질함량을 축적하고 있음을 확인하였다. 하지만, 색소함량(클로로필, 카로티노이드)의 경우 WT와 비교 시 유의적으로 높은 함량을 축적하고 있음을 확인하였다. 클로로필함량은 UBM1-2, UBM2-57 변이주가 WT보다 각각 37%, 89% 높았고, 카로티노이드 함량은 WT보다 각각 27%, 70% 높음을 확인하였다. 본 연구를 통해 선별한 미세조류 변이주는 야생균주와 비교 시 세포 생장에 큰 차이를 보이지 않으며, 유용성분을 다량 함유하고 있어 화장품 및 의약품, 건강 기능식품의 중요한 소재로써 이용이 가능할 것으로 판단된다.
Keywords
서 론
조류(algae)는 해수조류와 담수조류로 구별되며, 크기에 따라 미세조류(microalgae)와 거대조류(macroalgae)로 분류된다 [23] . 미세조류는 이산화탄소, 물, 태양에너지를 이용하여 생장하는 광합성 단세포 생물로 탄수화물, 지질, 단백질, 색소 등 다양한 유용물질들을 함유하고 있어 이를 산업적으로 이용하기 위한 관심이 고조되고 있다 [9] .
미세조류 중 녹조류에 해당하는 클로렐라( Chlorella )는 직경 2–10 µm의 구형 단세포로 20시간 마다 4배로 증식하여 육상 식물에 비해 증식속도가 빠르다고 알려져 있다 [2 , 11] . 클로렐라는 광합성을 통해 생장하며 세포 내 색소(엽록소 및 카로티노이드)와 지질과 같은 유용물질을 축적한다 [12] . 또한, 다량의 단백질과 함께 약 14%의 지질을 함유하고 있다고 알려져 있다 [6 , 8] .
자연에서 생장하는 미세조류(야생균주)의 경우 세포 내 유용물질 함유량이 적어 산업적 이용에 한계를 가진다 [10] . 이를 극복하기 위해 유용물질 축적량이 증대된 미세조류 균주의 개량이 절실하다. 미세조류 개량을 위한 방법으로는 물리적, 화학적 돌연변이원 처리를 통한 무작위적 균주개량(random mutation)과 세포 내 유전정보 변화를 통한 균주개량 방법이 있다. 김 등 [16] 은 화학적 돌연변이원에 해당하는 EMS를 Arthrospira platensis 에 처리하여 돌연변이를 유도하였으며, cerulenin 처리를 통해 선별한 돌연변이의 지질 함량은 야생균주에 비해 최대 4.8배 증가하였으며, phycoerythrins 함량 또한 약 6.9배 증대됨을 확인하였다. Chlorella vulgaris ( C. vulgaris )에 EMS를 처리한 연구에서도 세포 생장은 야생균주와 비슷하나 지질 및 클로로필과 같은 유용성분의 함량이 증대된 변이주를 획득할 수 있었다 [14] . 박 등 [19] Hamatococcus pluvialis ( H. pluvialis )에 자외선 조사와 colchicines를 처리하였으며, 자외선을 조사한 변이주에서 야생균주 보다 1.68배 높은 카로티노이드를 생산하였고, colchicines를 처리한 변이주는 생장속도가 야생균주 보다 20−30% 증가하였다. 이처럼 돌연변이원 처리를 통한 무작위 돌연변이법은 미세조류 내 유용물질의 생산율 증대에 유용한 방법이다 [4] .
물리적 돌연변이원 가운데 자외선은 파장에 따라 UV-A (320−400 nm), UV-B (280−320 nm), UV-C (190−280 nm)로 나누어진다 [7] . 해조류에 자외선을 조사하였을 경우 DNA, RNA, 단백질의 변형과, 세포분열, 세포의 크기, 생존율, 광합성 등의 감소를 초래한다 [22] . 또한, 식물이 UV-B에 직접 노출되면 잎 구조와 생식생장기관의 변형을 초래하며, 세포내 색소 합성 대사 감소를 초래한다 [24] . 박 등 [21] A. pltatensis 에 자외선을 조사하여 돌연변이를 유도하였으며, 그 결과 지질 및 색소 함량이 야생균주에 비해 증대된 균주를 선별할 수 있었다. 또한 김 등 [13] 은 자외선을 N. oculata 에 조사하여 선별한 돌연변이 균주에서 세포생장과 지질함량의 변화를 확인할 수 있었다. 이처럼 자외선 조사는 미세조류 내 유용물질 함량이 증대된 개량균주를 개발할 수 있는 방법으로 판단된다.
본 연구는 C. vulgaris 에 자외선(UV-B)을 조사하여 기 확보한 변이주 중 색소함량이 증대된 변이주를 선별하고자 하였으며, 선별된 변이주의 특성을 분석하였다.
실 험
- 균주 및 배양조건
본 연구에 사용된 미세조류는 Chlorella vulgaris (KMMCC 191)로 한국미세조류은행으로부터 분양받아 사용하였다. f/2 배지를 이용하여 250 ml 삼각플라스크에서 working volume 100 ml 부피로 온도 25℃, 교반속도 120 rpm, 광도 3,000 lux의 조건하에 배양하였다 [20] . 광주기는 12 h : 12 h(명 : 암)으로 명반응시 형광등을 이용하여 조사하였다. 상기 f/2 배지는 1L의 인공해수 [1] 에 NaNO 3 ; 150 mg, NaH 2 PO 4 · 9H 2 O; 8.69 mg, ferric EDTA; 10 mg, MnCl 2 ; 0.22 mg, CoCl 2 ; 0.11 mg, CuSO 4 ·5H 2 O; 0.0196 mg, ZnSO 4 · 7H 2 O; 0.044 mg, Na 2 SiO 3 ·9H 2 O; 50 mg, Na 2 MoO 4 ·2H 2 O; 0.012 mg, Vitamine B 12 ; 1 mg, Biotin 1 mg, Thiamine· HCl; 0.2 mg을 첨가하여 제조하였다. 제조한 배지는 멸균 후 사용하였다.
- 자외선 조사 변이주 유도 및 선별
자외선 조사는 UV-B (254 nm)의 파장으로 자외선 램프 스탠드(15 W, 76 µM/cm 2 , VILBER Lourmat, France)를 이용하여 균체에 직접 조사하였다. 조사거리는 약 15 cm였다. 대수 증식기의 C. vulgaris 균주를 인산완충액으로 세척한 후, 세포 흡광도(680 nm)를 0.5로 조정하여 5 ml씩 60 mm dish에 담아 자외선을 1, 2, 3, 4, 5분 조사하였다.
자외선 조사 후 세포를 적정량 희석하여 f/2 한천 고체평판배지에 도말하여 콜로니가 생성될 때가지 약 3주간 배양하였다. 생성된 콜로니는 f/2 액체배지에 접종하여 세포가 일정 농도가 될 때까지 배양한 후 돌연변이주의 특성을 분석하였다 [13] .
- 균체량 분석
균체량은 UV/Vis 분광기(Optizen 2120 UV, Mecacy Ltd, Korea)를 사용하여 흡광도 680 nm에서 측정하였다. 건조 균체량(Dry cell weight, DCW)은 항량된 여과종이를 이용하여 105℃ 건조기에서 3시간 동안 건조시킨 후 얻어진 건조무게로부터 좋은 직선성(R 2 = 0.992)으로 나와 아래의 상관관계식을 산출하였다 [14] .
단백질 분석은 bovine serum albumin (BSA)을 이용하였다. 680 nm에서 흡광도 0.5로 세포를 조정하여 Bradford 법 [17] 에 따라 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Protein (µg/ml) = (A 595 + 0.0035) / 0.0349
- 지질함량 분석
미세조류의 총 지질 함량은 Chen 등 [3] 의 방법에 따라 측정하였다. 680 nm에서 흡광도를 0.5로 조정한 세포; 10 µl와 증류수; 138 µl, nile red; 2 µl, DMSO; 50 µl를 혼합한 후, 40℃에서 10분간 반응시켰다. Nile red로 염색한 세포는 형광 광도계(Infinite F200 pro, Tecan, Austria)를 이용하여 excitation 495 nm, emisson 620 nm로 측정하였다. 형광값(fluorescence intensity)은 미세조류 자체의 형광값을 뺀 값으로 나타내었으며, 지질 정량을 위해 triolein으로 표준 정량 곡선을 작성하였다. 그 결과 좋은 직선성(R 2 = 0.99935)으로 나와 야생균주 및 변이주의 지질 함량을 정량하였다.
- 색소 추출
미세조류의 광합성 색소를 측정하기 위해 21일 동안 배양한 세포( C. vulgaris ) 1 ml을 13,000 rpm에서 2분간 원심분리 하여 상등액은 버리고 methanol 1 ml을 첨가하였다. 60℃에서 30분간 추출하고 0℃에서 5분간 냉각시킨 후, 상등액만 분리하여 UV/Vis 분광기로 650, 665, 461, 664 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 클로로필과 카로티노이드의 양은 다음과 같은 식으로 계산하였다 [5] .
Chlorophyll (mg/l) = 25.5 × A 650 + 4 × A 665
Carotenoids (mg/l) = [A 461 − (0.046 × A 664 )] × 4
결과 및 고찰
- 자외선 유도 돌연변이주 선별 및 세포생장
미세조류 C. vulgaris 의 돌연변이 유도를 위해 자외선을 1, 2, 3, 4, 5분 조사하였다. 자외선을 조사한 균주는 f/2 고체 배지에 접종하여 약 3주간 배양한 후, 생성된 콜로니 중 크기가 크고 진한 초록색을 띄는 단일 콜로니를 선별하였다. 자외선 조사시간 별로 얻어진 단일 콜로니를 8개씩 선별하여 f/2 액체 배지에 옮겨 배양하였다. 세포 생장에 큰 영향을 미치지 않으며, 색소함량이 가장 증대된 변이주 2종을 최종 선별하여 이를 UBM1-2, UBM2-57로 명명하였다.
UBM1-2, UBM2-57 변이주 2종을 21일 동안 3일 간격으로 세포생장을 측정하였다. UBM1-2, UBM2-57 균주는 야생균주(WT)에 비해 각각 10%, 20% 가량 더디게 생장함을 확인할 수 있었다( Fig. 1A ). UBM1-2와 UBM2-57의 세포건조중량은 각각 0.92 g/l, 0.77 g/l로 WT (1.06 g/l)에 비해 약 14%, 28% 감소함을 확인하였다( Fig. 1B ). 배양 21일 차에 세포 내 단백질 함량을 측정하였다. UBM1-2는 2.44 µg/ml, UBM2-57은 2.36 µg/ml로 WT (3.02 µg/ml)에 비해 약 20%, 22% 감소하였다( Fig. 1C ). 따라서 UBM1-2, UBM2-57 두 종 모두 WT에 비해 세포생장률, 세포 건조중량, 단백질 함량 모두 낮음을 확인하였다.
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Cell growth, dry cell weight and protein of wild type and mutants of C. vulgaris. (A) Cell growth, (B) Dry cell weight(DCW), (C) Protein content. Data are expressed as mean ± SD (n = 3).
한 등 [7] 은 자외선이 식물의 광합성 색소를 파괴하며 세포 생장을 억제시킨다고 보고하였다. 본 실험결과로 얻어진 변이주도 세포 생장 및 단백질 발현이 WT보다 느리게 증식함을 확인하였다. 이처럼 강한 자외선(UV-B) 조사로 얻어진 변이주는 작물의 생체량과 수량감소를 수반한다.
- 자외선 유도 돌연변이주 2종의 지질 함량
클로렐라의 지방산 함량은 온도, 태양광선, 배지 내 영양원(질소원) 함량 등의 생장환경에 의해 변화된다 [15] . 본 연구는 미세조류의 효과적인 염색을 위하여 흡광도 0.5로 세포를 조정하여 측정하였다. WT는 지질함량이 51.17 µg/ml 이였고, UBM1-2와 UBM2-57 변이주의 지질함량은 각각 61.91 µg/ml, 31.28 µg/ml이였다( Fig. 2 ). UBM1-2는 WT에 비해 21% 증가하였으나, UBM2-57은 39% 감소하였다. UBM1-2 균주는 세포생장과 정반대의 결과로 세포생장은 감소하였지만, 지질 함량은 증가하는 경향을 보였다. 일반적으로 세포 생장이 낮을수록 지질 함량이 높다고 알려져 있다 [13] . 본 연구에서도 UBM1-2 균주는 WT에 비해 세포 생장율이 9.6% 가량 더디게 생장하였지만, 지질 함량은 세포생장에 대비하여 지질을 약 11% 가량 더 많이 축적하고 있음을 확인하였다. 이는 외부로부터 스트레스에 대응하기 위해 미세조류 세포 내 지질 합성 대사가 활발히 일어남을 유추할 수 있다. C. vulgaris 를 질소원이 제한된 배지에서 배양하였을 경우 대조군에 비해 약 40%의 지질 함량이 증가된다고 보고되며 [8] , 미세조류가 스트레스에 노출되면 외부로부터 보호하기 위하여 지질 대사를 변경하거나 지질 축적량이 변화한다고 알려져 있다 [4] . 스트레스 환경에서의 미세조류 생장은 지질 축적량을 증대시키는 요인이기도 하나 세포 내 생장을 더디게 만드는 작용을 하는 것으로 보고되고 있다.
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Relative lipid content of wild type and two mutants of C. vulgaris. Data are expressed as mean ± SD (n = 3).
- 자외선 유도 돌연변이주 2종의 색소 함량
21일간 배양한 미세조류 2종의 클로로필 및 카로티노이드 함량을 분석 하였으며, 클로로필과 카로티노이드 함량은 세포 건조 중량당 함량(DCW)으로 계산하였다. 클로로필( Fig. 3A ) 함량은 UBM1-2, UBM2-57 균주가 각각 6.82 mg/g, 9.40 mg/g으로 WT (4.98 mg/g)에 비해 각각 37%, 89% 증가되었고, 카로티노이드( Fig. 3B ) 함량은 UBM1-2, UBM2-57 균주가 각각 1.77 mg/g, 2.37 mg/g으로 WT (1.39 mg/g)에 비해 각각 27%, 70% 증가하였다. 식물에 자외선 조사는 광합성 저해를 초래하게 된다. 한 예로, 녹조 구멍갈파래 식물에 자외선을 2시간 가량 노출 시 광합성 색소가 50% 이상 감소하였으며 [18] , N. oculata 에 자외선을 조사하여 분리한 변이주의 클로로필 함량은 야생균주 보다 낮았다 [13] .
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Pigments content of wild type and two mutants of C. vulgaris (A) Chlorophyll content per dry cell weight, (B) Carotenoids content per dry cell weight. Data are expressed as mean ± SD (n = 3).
하지만 본 연구에서는 자외선을 조사하여 분리한 변이주는 야생의 C. vulgaris 보다 색소함량이 증가되었다. 박 등 [19] H. pluvialis 에 자외선을 조사하여 유도된 돌연변이주에서 총 카로티노이드 함량이 1.68배 증가하였다. 미세조류는 스트레스 환경에 노출되었을 경우 지질과 색소와 같은 유용 물질을 다량 축적하고 있다고 알려져 있다 [5] . 이러한 보고들을 바탕으로 본 연구에서의 자외선 조사는 스트레스 요인으로 작용하여 C. vulgaris 의 색소함량 변화에 영향을 주었을 것이라 사료된다.
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