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Characterization of Starch-Utilizing Yeast Saccharomycopsis fibuligera Isolated from Nuruk
Characterization of Starch-Utilizing Yeast Saccharomycopsis fibuligera Isolated from Nuruk
Microbiology and Biotechnology Letters. 2014. Dec, 42(4): 407-412
Copyright © 2014, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology
  • Received : September 25, 2014
  • Accepted : September 27, 2014
  • Published : December 28, 2014
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다혜 최
은희 박
명동 김
mdkim@kangwon.ac.kr

Abstract
누룩으로부터 MBY1276, 1280, 1282, 1320, 1322, 1324 및 MBY 1327로 각각 명명된 전분을 분해하는 효모균주를 분리하였다. 이들 균주는 18S rRNA 영역의 ITS 단편 및 26S rDNA 영역의 D1/D2 단편의 염기서열 해석 및 탄소원 대사특성 분석을 통하여 S. fibuligera 로 동정하였다. 상주지역에서 수집된 누룩으로부터 분리된 MBY1320 균주는 대조구 균주인 S. fibuligera KCTC7806 및 누룩으로부터 분리된 다른 S. fibuligera 균주에 비해 고온에서 상대적으로 높은 비성장속도를 나타내었다. 전분을 분해하는데 필요한 효소인 α-amylase 및 glucoamylase 효소활성을 측정한 결과 MBY1320 균주의 α-amylase 효소활성은 대조구 균주보다 낮지만 glucoamylase 효소활성은 고온에서 상대적으로 우수한 것으로 나타났다. 효소활성 분석결과는 MBY1320 균주가 표준균주 및 다른 S. fibuligera 균주와 비교하여 고온에서 상대적으로 높은 비성장속도를 나타내는 것을 뒷받침하는 결과로 판단되었다. 가용성 전분을 이용한 회분식 배양 결과 MBY1320 균주는 표준균주 보다 42℃에서 우수한 성장속도 및 에탄올 생산속도를 나타내었다. 본 연구를 통하여 기존에 보고된 S. fibuligera 균주보다 고온에서 glucoamylase 효소활성 및 비성장속도가 우수한 S. fibuligera 균주를 보고하는 바이다.
Keywords
진주, 용인, 상주, 예산, 제주, 광주, 부산, 상주 등 8개 지역의 재래시장에서 시판되는 누룩과 농가에서 직접 제조한 누룩 11점을 수집하였다. 분쇄한 누룩 1 g을 펩톤수 9 ml에 현탁한 후, 적정 희석배수로 희석하여 chloramphenicol (100 mg/l, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 함유된 YEPD (yeast extract 1%(w/v), peptone 2%(w/v), glucose 2%(w/v), BD, Franklin Lakes, NJ, USA) 평판배지에 도말하였다. 도말한 배지는 30℃에서 48시간 동안 배양한 후 현미경 관찰을 통하여 효모로 추정되는 집락을 분리하였다. 대조구 균주로서 S. fibuligera KCTC7806 균주를 미생물자원센터(KCTC, Daejeon, Korea)로부터 분양받아 사용하였다.
Internal transcribed spacer (ITS) 영역을 증폭할 수 있는 프라이머인 ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')과 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') [32] 를 사용하여 18S rRNA 단편을 증폭하였고, NL1(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3') 및 NL4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3') 프라이머 [31] 를 사용하여 26S rDNA 영역의 D1/D2 단편을 증폭 후, 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)의 BLAST를 사용하여 18S rRNA 및 26S rDNA 유전자 단편의 염기서열 상동성을 근거로 동정하였다 [26] .
전분분해 활성 측정을 위하여 1%의 가용성 전분을 함유한 YEPS (yeast extract 1%(w/v), peptone 2%(w/v), soluble starch 1%(w/v), BD) 고체배지를 사용하였다. 효모균주는 YEPS 액체배지에서 대수증식기로 성장할 때 회수하여 멸균수로 희석하고 동량을 고체배지에 분주한 후 세포의 성장을 관찰하였다. YEPS 고체배지에서 효모에 의한 가용성 전분의 분해를 관찰하기 위하여 요오드-전분 반응법 [14] 을 사용하였다. 요오드용액(I 2 2%(w/v), KI 0.5%(w/v), Sigma-Aldrich)을 평판배지에 분주 한 후 10분 동안 실온에서 반응하여 생성된 투명환의 크기를 관찰하였다. 배양온도에 따른 효모균주의 비성장속도를 측정하기 위하여 YEPS 액체배지에 초기세포 흡광도(OD 600 )가 0.1이 되도록 접종한 후 각각 30, 37, 42℃의 진탕배양기를 이용하여 배양하면서 각 균주의 대수증식기에서 비성장속도를 측정하였다.
α-Amylase 효소활성은 Park 등 [24] 의 방법을 수정하여 측정하였다. YEPS 액체배지에 흡광도(OD 600 )가 0.1이 되도록 S. fibuligera 균주를 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하고 균체를 제거한 상등액으로 효소활성을 측정하였다. 효소반응은 인산 완충액(50 mM, pH 6)에 조효소액 0.2 ml과 기질용액인 가용성 전분(1% w/v) 1 ml를 첨가하고 각 반응 온도에서 30분 동안 반응하였다. 반응액 0.1 ml를 취하여 1 ml의 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS, Sigma-aldrich) 용액과 100℃에서 10분간 반응시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다 [21] . 1 unit (U)의 효소활성은 1분동안 1 μmole의 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.
Glucoamylase 효소활성은 Liu [19] 등의 방법을 수정하여 측정하였다. YEPS 액체배지에서 흡광도가 0.1이 되도록 S. fibuligera 균주를 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 뒤 상등액으로 효소활성을 측정하였다. 아세트산 완충액(10 mM, pH 5)에 조효소액 0.7 ml과 기질용액인 가용성 전분(1%, w/v) 0.2 ml를 첨가하여 각 반응온도에서 30분 동안 반응시킨 후 100℃에서 10분 동안 가열하여 반응을 종결시켰다. 효소반응이 종결된 반응액은 포도당 정량키트(YD Diagnostic, Yongin, Korea)를 사용하여 생성된 포도당의 양을 측정하였다. 1 unit(U)의 glucoamylase 효소활성은 1분 동안 1 μmole의 포도당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.
Bradford Dye Reagent (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 제조사가 제시한 조건에서 단백질 농도를 측정하였으며 적정 농도로 희석된 bovine serum albumin (Biosesang, Sungnam, Korea)을 이용하여 검량선을 작성하였다. 균체농도는 흡광광도계(GE healthcare, Uppsala, Sweden)를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 에탄올 농도는 Rezex ROA-Oranic Acid H+ (Phenomenex, Torrance, CA, USA) 컬럼이 장착된 HPLC (Shimadzu, Kyoto, Japan)로 측정하였으며 0.005 N 황산용액을 이동상(0.6 ml/min)으로 사용하였다. Analytic Profile Index 20 C AUX kit (bioMérieux, Marcy-I'Etoile, France)를 제조사의 사용방법에 따라 사용하여 효모균주의 탄소원 대사특성을 조사하였다. 모든 측정은 3회 수행하였으며 평균값과 표준오차는 SigmaPlot (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)를 사용하여 분석하였다.
전국 각지에서 수집한 누룩으로부터 60점의 효모를 분리 하였으며 평판배지에서 배양하였다. 전분이 함유된 배지에서 성장한 MBY1276, 1280, 1320, 1322, 1323, 1324 및 MBY1327로 명명된 효모 7점을 18S rRNA 유전자의 ITS 염기서열 및 26S rDNA 유전자의 D1/D2 단편의 염기서열을 분석한 결과 MBY1276 및 MBY1280 균주는 기존에 보고된 S. fibuligera 와 99%의 상동성을 나타내었으며 MBY1320, 1322, 1323, 1324 및 MBY1327 균주는 S. fibuligera 와 100%의 상동성을 나타내었다. API AUX 20 키트를 사용하여 누룩에서 분리된 효모균주의 탄소원 대사특성을 조사한 결과 KCTC7806 균주와 누룩에서 분리된 균주들은 탄소원 대사 특징 [6 , 25] 이 유사하였다. 따라서 누룩으로부터 분리된 전분분해 활성을 나타내는 7점의 효모균주는 S. fibuligera 로 최종 동정하였다.
누룩에서 분리한 7점의 S. fibuligera 균주의 전분분해 활성을 요오드 염색법으로 조사하였다( Fig. 1 ). MBY1276, 1280, 1320, 1322 및 MBY1323 균주는 37℃에서 대조구인 KCTC7806 균주와 비슷한 크기의 전분 분해환을 나타냈으며, 예산지역에서 수집된 누룩에서 분리된 MBY1327 균주의 전분 분해환의 크기가 가장 작게 나타났다. 그러나 KCTC7806 균주와 MBY1324 균주는 42℃에서 전분 분해환이 거의 나타나지 않았으며 MBY1280, 1320, 1322, 1323 및 MBY1327 균주는 전분 분해환을 나타내었다.
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Hydrolysis of starch by S. fibuligera strains incubated at different temperatures. S. fibuligera strains were grown overnight in YEPS and washed twice with sterile water to achieve an OD600 of 0.2. The cell suspension taken by five-fold serial dilutions were spotted onto a YEPS plate. The plates were incubated at the indicated temperature for 2 days and iodine reagent (KI) was added to flood the growth.
배양온도에 대한 S. fibuligera 의 성장속도를 조사하기 위하여 전분을 함유한 배지에서 비성장속도를 측정하였다( Fig. 2 ). 대조구인 KCTC7806 균주의 비성장속도는 37℃에서 0.25 h -1 로 측정되었으며, 42℃에서는 93.7% 감소한 수준인 0.016 h -1 로 나타났다. 누룩에서 분리한 S. fibuligera 균주 중에서 MBY1320 균주는 37℃에서 비성장속도가 0.31 h -1 로 대조구보다 높은 비성장속도를 나타냈으며 42℃에서 비성장 속도가 0.28 h -1 로 대조구인 KCTC7806 균주의 비성장속도 보다 약 94% 높은 수준을 나타내어 대조구보다 내열성이 우수한 것으로 판단되었다.
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Specific growth rates of S. fibuligera strains utilizing soluble starch (1%) as carbon source. Cells were grown in YEPS medium at an indicated temperature and specific growth rate determined at an exponential growth phase (■: 30℃, □: 37℃, ▧ : 42℃). Different letters in indicate a significant difference between means.
가용성 전분이 함유된 배지에서 균주를 배양한 후 상등액을 회수하여 30, 37, 42℃에서 전분 분해 효소활성을 측정하였다. 대조구인 KCTC7806 균주는 37℃에서 가장 우수한 α-amylase 효소활성을 나타냈지만 반응온도의 증가에 따라 효소활성이 급격히 감소하였다. MBY1320 균주는 대조구인 KCTC7806 균주보다 낮은 수준의 α-amylase 효소활성을 나타내었지만 반응온도가 증가함에 따라 α-amylase 효소활성이 유의적으로 증가하는 경향을 나타내었지만 42℃에서 KCTC7806 균주가 나타낸 α-amylase 효소활성의 약 38.8% 수준이었다( Fig. 3A ).
대조구인 KCTC7806 균주의 glucoamylase 효소활성은 30℃에서 상대적으로 높은 효소활성을 보이지만, 반응온도가 증가할수록 효소활성이 유의적으로 감소하여 42℃에서는 효소활성이 거의 나타나지 않았다( Fig. 3B ). MBY1280, 1322, 1323 및 MBY1324 균주는 glucoamylase 효소활성이 KCTC7806 균주에 비해 상대적으로 낮았으며 MBY1276 균주는 30℃에서 583.0 U으로 높은 효소활성을 나타냈으나 37℃ 이상으로 반응온도가 상승하면서 활성이 급격히 감소하였다. 그러나 MBY1320 균주는 반응온도가 증가할수록 glucoamylase 효소활성이 증가하였으며 42℃에서 1,006.9 U로 가장 우수한 효소활성을 나타내었다. 이러한 결과는 MBY1320 균주가 대조구인 KCTC7806 균주를 비롯한 다른 S. fibuligera 균주에 비해 높은 배양온도에서도 상대적으로 빠른 비성장속도로 성장하는 것을 부분적으로 뒷받침하는 결과로 판단되었다.
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Enzyme activity of α-amylase (A) and glucoamylase (B) for starch-degrading yeast S. fibuligera strains. Extracellular protein was harvested by incubating S. fibuligera strain in YEPS for 24 h at 30℃ and culture broth obtained by centrifugation was used for an enzyme assay (■: 30℃, □: 37℃, ▧: 42℃). Different letters in indicate a significant difference between means.
가용성 전분을 탄소원으로 사용하여 42℃에서 S. fibuligera KCTC7806 및 MBY1320 균주의 균체 성장속도와 에탄올 생산속도를 비교하였다( Fig. 4 ). 대조구인 KCTC7806 균주는 42℃에서 에탄올 생산량이 배양 36시간 경과 후 약 0.25 g/l이었으나( Fig. 4A ), MBY1320 균주는 0.32 g/l로 상대적으로 우수한 에탄올 생산성을 나타내었다 (Fig. 4B ). 또한 가용성 전분을 탄소원으로 이용하여 성장할 때 MBY1320 균주의 비성장속도가 KCTC7806 균주보다 유의적으로 높은 수준을 나타내었다. 이러한 결과는 42℃에서 MBY1320 균주의 glucoamylase의 효소활성이 상대적으로 높은 것과 관련이 있는 것으로 판단되었다.
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Shake flask cultivation of S. fibuligera strain KCTC 7806 (A), and MBY 1320 (B) at 42℃. Soluble starch (1%) was used as carbon source and initial medium acidity was adjusted to pH 6. Agitation speed was maintained at 200 rpm throughout the cultivation (●: OD600, ○: ethanol).
전분의 당화에 필요한 공정을 생략 또는 축소할 경우 에탄올 생산경비를 절감할 수 있으므로 전분 분해활성이 우수한 효모를 이용하여 전분을 직접 에탄올로 전환시키는 방법이 개발되고 있다 [4] . 또한, 에탄올 생산에 적합한 효모 종균으로서 내열성, 에탄올 내성, 전분 발효능 및 응집성 등이 요구되고 있으므로 [1] 기존의 S. fibuligera 균주보다 높은 온도에서 전분분해 활성 및 성장속도가 우수한 S. fibuligera MBY1320 균주는 육종 및 개량을 통하여 전통주 및 에탄올 생산에 사용할 수 있는 후보균주로서 사용할 수 있을 것으로 판단된다.
Acknowledgements
This work was supported by “Cooperative Research Program for Agriculture Science & Technology Development (Project No. PJ009993)”, Rural Development Administration Republic of Korea.
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