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Purification and Characterization of an Antimicrobial Substance from Bacillus subtilis HH28 Antagonistic to Bacillus cereus
Purification and Characterization of an Antimicrobial Substance from Bacillus subtilis HH28 Antagonistic to Bacillus cereus
Microbiology and Biotechnology Letters. 2014. Dec, 42(4): 393-401
Copyright © 2014, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology
  • Received : November 25, 2014
  • Accepted : December 10, 2014
  • Published : December 28, 2014
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현아 차
다은 정
성욱 홍
건섭 정
kschung@yonsei.ac.kr

Abstract
청국장으로부터 Bacillus cereus 에 대한 항균활성이 가장 높은 균주를 분리하여 형태학적, 생화학적 특성과 16S rDNA 염기서열 결정을 통해 Bacillus subtilis HH28으로 동정 및 명명하였다. B. subilis HH28의 생육시기에 따른 항균활성을 측정해 본 결과, 생육이 대수증식기인 9시간부터 생성되어 사멸기인 60시간에 가장 높은 활성(80 AU/ml)을 나타내었고 144시간(6일)까지 항균활성을 유지하였다. 항균물질의 정제는 황산암모늄 침전과 DEAE-sepharose fast flow, sephacryl S-200HR를 이용하였고, 19.7배의 정제도와 38.4%의 수율로 정제되었다. Tricine SDS-PAGE와 directed detection을 통해 항균물질의 분자량이 약 3,500 Da임을 알 수 있었다. 또한 본 연구의 항균물질을 B. cereus 뿐만 아니라 Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus 의 식중독 균에서도 우수한 항균활성을 나타내었고, 항균작용의 기작은 미생물을 사멸시키는 살균작용이였다. 또한 온도 안정성 실험에서 40-80℃까지 안정했고, pH 안정성 실험에서는 pH 2-9까지 안정하여 비교적 온도와 pH에 안정하였다. 효소에 대한 영향 실험에서는 단백질 분해효소에 의해 항균활성이 실활되어 본 연구의 항균물질은 단백질성임을 알 수 있었다. 위와 같은 특성으로 보아 B. subtilis HH28이 생산하는 항균물질은 천연 식품 보존제 및 사료 보존제, 항생제 대체 의약품으로 사용할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 향후 이 항균물질의 정확한 구조 및 특성 규명 등의 연구가 필요하다.
Keywords
서 론
Bacillus cereus 는 자연환경에 널리 분포하며 호기적, 혐기적 조건에서 증식하는 포자형성 간균이다. 따라서 식품 제조, 가공, 조리 과정 동안에 포자형태로 존재하다가 적절한 환경에서 영양세포로 증식하여 식품의 부패를 일으키는 것으로 알려져 있다 [1] . 또한 B. cereus 는 enterotoxin과 구토독소를 생성하여 설사형, 구토형 식중독을 유발한다 [28] . 이러한 미생물 때문에 발생하는 식품 부패와 식중독을 예방하기 위해 식품 보존제를 첨가한다. 식품 보존제에는 합성 보존제와 천연 보존제가 있으며 합성 보존제는 안전성의 논란으로 인해 소비자들이 기피하는 추세이다. 따라서 천연 보존제에 대한 관심이 증가하고 있고 이러한 천연 보존제에는 유기산, 식물 추출물, 미생물이 생산하는 항균물질 등이 있다.
미생물이 생산하는 항균물질은 대부분이 박테리아가 생산하는 단백질 또는 peptide성 물질이어서 인간 또는 동물의 소화효소에 의해 분해되므로 식품에서 안전한 천연보존제로 사용 가능하다. 대표적인 예로 1928년 유산균인 Lactococcus lactis 가 생산하는 nisin이라고 명명된 bacteriocin으로 1998년 미국 FDA의 승인으로 가공 치즈의 천연식품보존제로 사용되고 있다. 이는 유산균이 생성하는 bacteriocin에 대한 연구가 활발히 이루어지는 발단이 되었다 [12] . 그러나 유산균이 생성하는 bacteriocin보다 Bacillus species가 생성하는 항균 물질은 다양한 특징을 가지고 넓은 범위의 항균력을 가지고 있다 [2] .
Bacillus species가 생성하는 항균물질은 다음과 같이 분류한다. Class I은 subtilin, sublancin 168, subtilosin A 등 이 속해 있으며, 유전자가 단백질로 발현된 후 구조가 변하여(post-translational modification) 생성된다. Class II는 13 kDa 보다 작은 분자량으로 열과 pH에 안정하고 리보솜에서 합성되며 번역 후 구조 변화가 없는 선형 펩타이드로서 coagulin, thurincin H, lichenin 등이 속한다. Class III는 30 kDa보다 큰 분자량으로 열에 약한 bacteriocin이며, megacin A group이 이에 속한다 [2] . 이 외에도 많은 다른 antimicrobial peptides가 있지만 단백질과 DNA 서열에 대한 정보 부족으로 분류되지 못하여 bacteriocin - like inhibitory substances (BLIS)로 불린다. B. subtilis LFB112가 생성하는 BLIS는 그람 양성균과 그람 음성균 모두를 저해하고 [30] , B. subtilis MJP1이 생성하는 BLIS는 그람 양성균과 진균에 항균활성을 가진다 [32] . 이와 같이 Bacillus species가 생성하는 항균물질은 종류가 다양하고 항균 범위가 넓어 식품산업 뿐만 아니라 다양한 산업에 적용할 수 있으며 적용 가능한 산업의 종류는 다음과 같다.
첫 번째 의약품산업으로 적용할 수 있다. 현재 사용하고 있는 항생제 내성균이 발견되면서 사람 또는 동물의 미생물 관련 질병에 bacteriocin으로 대체 하려는 관심이 증가하고 있다 [13] . Staphylococcus aureus 의 강한 저해능을 가지는 mersacidin [20] 과 살정제 활성을 가지고 있어서 천연 피임약으로 사용할 가능성이 있는 subtilosin A [25] 이다.
두 번째로 축산산업에 적용할 수 있다. 병원성 미생물에 감염된 가축의 치료와 성장촉진, 폐사율 감소를 위해 항생제를 사료 급여와 함께 사용하고 있다. 그러나 이러한 사용은 항생제 오남용으로 내성문제를 일으켜 몇몇 나라에서는 치료용 이외의 사용은 금지하고 있는 실정이다. 따라서 병원성 미생물의 감염을 억제하고 성장촉진이 가능한 항생제 대체제가 요구되고 있다. Pattnaik 등 [19] Bacillus licheniformis 가 생산하는 lichenin은 가축의 제1위 과산증을 일으키는 Streptococcus bovis 에 대한 항균력을 가지고, 다양한 다당류를 가수분해 할 수 있어 반추위 발효 개선에 적용될 수 있는 잠재력 가지고 있다고 보고하고 있다.
세 번째로 식품산업에 적용할 수 있다. 현대의 소비자들은 합성보존제가 첨가되지 않고 최소의 가공과정만 거치는 ‘fresh foods’을 원한다. 따라서 천연합성보존제로 사용할 수 있는 bacteriocin에 대한 관심이 급증하고 있다. 예를 들어 antimicrobial peptides P45 [26 , 27] , paenibacillin [6] 그리고 김치에서 분리한 Bacillus brevis 가 생성하는 항세균 및, 항진균 활성 peptide 등이 있다 [7] .
네 번째로 환경산업에 대한 적용이다. Bacillus species가 생성하는 항균, 항진균 활성이 있는 bacteriocin은 ‘biocontrol agents’로 사용할 수 있다. 예를 들어 대두의 뿌리에서 분리한 Bacillus thuringiensis NEB17이 생성하는 bacteriocin은 근류 형성을 도와 식물의 성장을 증진시키고, 식물의 질병 저항성을 높여준다 [9] .
따라서 본 연구에서는 청국장에서 분리한 Bacillus subtilis HH28가 생성하는 항균물질의 정제 및 특성을 규명함으로써 여러가지 산업에 적용 가능성을 검토하고자 하였다.
재료 및 방법
- 미생물 분리 및 배양
본 실험의 미생물은 전통적으로 제조한 청국장 및 이를 제조할 때 사용한 볏짚을 이용하여 분리하였다. 미생물을 분리하기 위하여 청국장과 볏짚 시료 각각을 멸균생리식염수 [0.85% (w/v) NaCl]와 1:9 비율로 혼합한 후, homogenizer (Stomacher 400, Seward, England)로 10분간 균질화하여 현탁액을 제조하였다. 이 현탁액을 멸균생리식염수로 십진 희석한 후 tryptic soy agar (TSA; Difco, Detroit, MI, USA)에 100 μl씩 적가하여 도말하고 37℃에서 14시간 동안 배양한 후 미생물 집락을 순수분리 하였다.
- 항균물질 활성 측정
실험에 사용된 피검균 B. cereus KCCM 12667는 tryptic soy broth (TSB, Difco, MI, USA)에 1% (v/v) 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 분리 미생물의 B. cereus 에 대한 항균활성은 paper disc 방법 [29] 을 사용하여 확인하였다. B. cereus 을 0.4% (v/v) 접종한 tryptic soy soft agar를 중층한 평판배지에 직경 8 mm의 paper disc (Advantec, Toyo Roshi Kaisha Ltd., Japan)를 올리고 항균물질을 50 μl을 적가하여 37℃에서 12시간 동안 배양한 후 생성된 투명환의 형성유무를 관찰하였다.
- 분리균주의 동정
항균활성을 나타내는 분리 균주를 동정하기 위해서 형태학적, 생화학학적 동정과 유전학적 동정을 실시 하였다. 형태학적인 동정은 그람 염색과 포자형성 관찰을 하였다. 생화학적 동정은 API 50 CHB kit (bioMerieux, Marcy IEtoile, France)을 사용하여 49개의 탄소원에 대한 이용성을 조사하고, API 50 CHB database V3.0(http://apiweeb.biomerieux.com)을 통해 동정결과를 얻었다. 유전학적 동정은 16S ribosomal DNA 염기서열 분석하는 것으로 분리 미생물의 chromosomal DNA를 template로 universal primer인 27 forward primer (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492 reverse primer (5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하여 16S rDNA gene 일부를 증폭하였다. 증폭된 약 1,400 bp의 fragment를 T-vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 결합시켜 형질 전환한 후 T-vector sequencing primer를 통해 염기서열을 분석하고, BLAST search program을 이용하여 GenBank (NCBI)의 ribosomal DNA gene sequence와 비교 동정하였다.
- 생육시기에 따른 항균 활성조사
분리 미생물을 glucose minimal medium (0.002% ammonium molybdate, 0.003% CaCl 2 ·2H 2 O, 0.0002% FeSO 4 ·7H 2 O, 1% Glucose, 0.7% K 2 HPO 4 , 0.15% KH 2 PO 4 , 0.05% MgSO 4 ·7H 2 O, 0.004% MnSO 4 ·4H 2 O, 0.5% yeast extract) 500 ml에 1% (v/v) 접종하여 40℃ 에서 180 rpm으로 교반하여 배양하였다. 0-144시간동안 진탕 배양하는 동안 spectrophotometer (VersaMax ELISA Microplate Reader, Molecular Devices Sunnyvale, CA, USA)로 660 nm에서 흡광도를 측정하여 생육곡선을 그리고, 생육시기에 따른 항균 활성을 측정하였다. 활성 역가는 분리 미생물 배양액 ml당 AU (activity unit)로 측정하였다. AU는 항균 물질을 2배씩 점차적으로 희석하여 투명환을 형성하는 최대 희석배수의 역수값을 취하고, 이 값을 1 ml로 환산하는 값에 곱하여 AU/ml로 정하였다.
- 항균물질의 분리 및 정제
선발 미생물을 glucose minimal medium 500 ml에 1% (v/v) 접종하여 40oC에서 3일 동안 배양하였다. 선발 미생물의 배양 상등액에 황산암모늄을 80%의 포화도 까지 첨가하고, 4℃에서 12시간 동안 방치한 후 원심분리 (20,000 × g , 4℃, 30분)하여 얻은 침전물을 10 mM Tris·HCl 완충용액(pH 8.0)에 용해시켰다. 그리고 투석막(MWCO 6-8 kDa cut-off, Spectrum Laboratories, Inc.)으로 4℃에서 12시간 동안 투석을 한 후 DEAE-sepharose fast flow (Pharmacia, Biotech. AB Uppsala, Sweden) column (25 × 400 mm)과 Sephacryl S-200HR (Pharmacia) column (15 × 960 mm)을 이용하여 정제하였다. 각 분획의 단백질 함량은 280 nm로 측정하였고, 각각 항균활성을 측정하여 활성이 존재하는 분획만 취합하여 동결건조 하였다. 모든 정제과정은 단백질성 항균물질의 변성을 최소화하기 위해서 4℃에서 수행하였다.
- 단백질 함량 측정
항균물질 단백질 정량은 Lowry 방법을 변형하여 실시하였다 [17] . 항균물질 시료 50 μl에 biuret reagent (0.75 mmol/l cupric sulfate, 94 mmol/l sodium hydroxide) 550 μl를 혼합하고 25℃에서 10분간 반응시킨 후, Folin and Ciocalteu’s phenol reagent (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 25 μl를 넣고 25℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그리고 spectrophotometer로 725 nm에서 흡광도를 측정하여 나타내었고, 표준곡선은 bovine serum albumin (BSA; Sigma Co.)를 사용하였다.
- 항균물질 분자량 측정
항균물질의 분자량을 측정하기 위해 Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (Tricine-SDS-PAGE)를 수행하였다 [21] . 20% polyacrylamide gel를 사용하여 100 V로 5시간 동안 전기영동 한 후 silver staining kit (Amersham Biosciences AB Inc., Sweden)로 염색했다. 분자량 marker는 ultra-low range molecular weight marker (1,060-26,600 Da, Sigma)을 사용했다. Tricine SDS-PAGE를 수행한 후 밴드가 항균물질인지 확인하기 위해 direct detection을 하였다 [3] . Tricine SDS-PAGE한 polyacrylamide gel을 25% (v/v) isopropanol과 10% (v/v) glacial acetic acid의 혼합물에 2시간동안 고정을 하고 멸균 증류수로 6시간동안 wash 한 후 B. cereus KCCM 12667가 중층된 배지에 올리고 40℃에서 6시간 배양하여 투명환의 유무를 확인하였다.
- 항균 spectrum 조사
Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. cereus 의 배양배지는 TSB, Staphylococcus aureus, Salmonella Typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Shigella flexineri, S. sonnei, S. boydii, Escherichia coli O157:H7의 배양배지는 nutrient broth (NB, Difco, MI, USA), Vibrio parahaemolyticus 는 2.5 % (w/v) 염화나트륨이 포함된 TSB배지를 사용하였다. Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes 는 Brain Heart Infusion broth (BHI, Difco), Candida albicans 는 Yeast Mold broth (YM, Difco, MI, USA), Aspergillus flavus, A. fumigatus, Rhizopus oryzae, Mucor circinelloides, Penicillum camemberti 는 potato dextrose agar (PDA, Difco) 배지를 사용하여 배양하였다. 피검균으로 사용한 균주들은 생명자원센터(KCTC), 한국농업미생물자원센터(KACC) 그리고 한국미생물보존센터(KCCM)에서 분양받았다( Table 2 ). 배양온도는 C. albicans 는 30℃, A. flavus, A. fumigatus, R. oryzae, M. circinelloides, P. camemberti 는 25℃, 나머지 균들은 37℃에서 배양하였고 이들 균주에 대한 길항력은 분리 균주 배양상등액의 황산암모늄 침전액을 사용하여 측정하였고 paper disc 주변의 투명환의 직경으로 비교하였다.
- 항균 작용 기전
항균작용 기전은 Nicolas 등 [16] 의 방법으로 수행하였다. B. cereus KCCM 12667를 TSB에 5% (v/v) 접종한 후 2시간 진탕 배양한 배양액에 항균물질(32 AU/ml)를 첨가하였고, 항균물질을 첨가하지 않은 B. cereus 배양액을 대조군으로 사용하였다. 항균물질 첨가 후 12시간동안 진탕 배양하며 2시간 간격으로 생균수를 측정하였다.
- 항균물질의 안정성
항균물질의 pH 안정성을 측정하기 위해 pH 2.0-4.0은 0.1 M glycine-HCl 완충용액, pH 4.0-6.0은 0.1 M sodium acetate 완충용액, pH 6.0-8.0은 0.1 M sodium phosphate 완충용액, pH 8.0-10.0은 Tris-HCl 완충용액을 사용하였다. 각각의 pH 완충용액과 정제 항균물질을 1:15 비율로 혼합하여 배양온도인 40℃에서 12시간 방치한 후 잔존 항균활성을 측정하였다. 대조군으로는 항균물질을 첨가하지 않은 각각의 pH 완충용액을 사용하였다. 항균물질의 온도안정성을 측정하기 위하여 정제한 항균물질을 40-80℃에서 12시간, 100℃는 1시간 방치한 후 잔존 항균활성을 측정하였다. 각종 효소의 영향을 측정하기 위해 lysozyme (EC 3.2.1.17, Sigma), α-amylase (EC 3.2.1.1, Sigma), lipase (EC 3.1.1.3, Type VII, Sigma), trypsin (EC 3.4.21.4, Sigma), protease (EC 3.4.24.31, Sigma), Proteinase K (EC 3.4.21.64, Sigma), pronase E (EC 3.4.24.4, Merck)를 10 mM sodium phosphate 완충용액(pH 7.0)에 4 mg/ml이 되도록 준비하였다. 정제한 항균물질에 각각의 효소를 2 mg/ml 첨가하여 37℃에서 30분 동안 방치한 후 항균물질의 잔존활성을 측정하였다
결과 및 고찰
- 항균활성 균주의 분리 및 동정
전통적인 방법으로 제조한 청국장과 제조할 때 사용한 볏짚을 멸균 생리식염수로 희석한 후, TSA 배지에서 14시간 동안 배양한 후, 미생물의 집락을 관찰하였고 다양한 미생물의 집락이 관찰되었다. B. cereus 에 대한 항균활성 실험결과, 항균활성이 가장 높은 분리균주 1종을 선발하였다.
분리한 미생물은 포자를 형성하는 그람 양성 간균이며, API 50 CHB system을 이용한 당이용성 조사를 통한 동정 결과는 Bacillus subtilis 로 판정되었다. 보다 정확한 동정을 위하여 16S rDNA의 염기서열을 결정하고, GenBenk에 등록된 다른 균주의 염기서열과 비교한 결과 B. subtilis 와 98%의 상동성을 보였다. 따라서, 선발균주는 B. subtilis 로 동정 되었고, B. subtilis HH28로 명명하였다.
- 분리균주의 생육시기에 따른 항균활성
B. subtilis HH28의 생육에 따른 항균활성 특성을 조사하였다( Fig. 1 ). 생육곡선 측정 결과, 배양 12시간까지 대수증식기이고 24시간까지 정체기이며 그 이후 사멸기에 도달하였음을 알 수 있다. B. cereus 에 대한 항균활성은 생육이 대수기인 9시간부터 생성되어 사멸기인 60시간에 가장 높은 활성(80 AU/ml)을 보였다.
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Growth and antimicrobial activity of Bacillus subtilis HH28 in the glucose minimal medium.
많은 항균물질이 영양원이 고갈되는 정체기에 축적되는 것과 같이 본 연구의 항균물질 또한 정체기인 12시간 이후부터 항균활성이 나타나는 것을 알 수 있다 [22] . 또한 항균활성이 가장 높은 시기인 60시간부터 실험이 종료된 시점 144시간(6일)까지 활성이 감소하지 않고 유지되는 것을 확인할 수 있다. 반면 Guo 등 [5] B. licheniformis B11이 생산하는 bacteriocin - like substance (BLIS)는 배양 후 20시간이 지난 후에 항균활성이 감소하고, 또한 Yang 등 [32] 의 항균물질도 배양시간이 길어짐에 따라 항균활성이 감소하는 것을 확인할 수 있다.
- 항균물질의 분리 및 정제
B. subtilis HH28의 배양상등액 500 ml을 0-80% 황산암모늄 침전한 후, 크로마토그래피 방법으로 정제하였다. 황산암모늄 침전시료를 DEAE-sepharose fast flow를 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하였고, 0-1 M의 이온강도를 사용하여 항균물질을 용출하였다( Fig. 2 ). 이온 교환 크로마토그래피에서 활성이 있는 분획 143-156번을 취합한 후 sephacryl S-200HR을 사용하여 겔 크로마토그래피를 하였다( Fig. 3 ). 겔 크로마토그래피의 항균활성이 있는 분획 46-56번을 모아 정제된 항균물질로 사용하였다. 항균물질 정제의 결과를 Table 1 에 나타냈고, 19.7배의 정제도와 38.4%의 수율로 정제되었다.
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Ion exchange chromatography of the antimicrobial substance from Bacillus subtilis HH28 on the DEAE-sepharose FF. The DEAE-sepharose FF ion exchange column (25 × 400 mm) was equilibrated with 10 mM Tris·HCl buffer (pH 8). The column was eluted with a linear gradient of 0-1 M NaCl in 10 mM Tris·HCl buffer (pH 8) at a flow rate of 1 ml/min. The volume of each fraction was 5 ml.
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Gel chromatography of the antimicrobial substance from Bacillus subtilis HH28 on the sephacryl S-200HR. Sephacryl S-200HR column (15 × 960 mm) equilibrated with 10mM Tris·HCl buffer (pH 8). The column was eluted with 10 mM Tris·HCl buffer (pH 8) at a flow rate of 0.5 ml/min. The volume of each fraction was 2 ml.
Purification summary of antimicrobial substance produced byBacillus subtilisHH28.
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*AS, ammonium sulfate precipitation; IEX, ion exchange chromatography; GF, gel chromatography
- 항균물질의 분자량 측정
정제한 항균물질의 분자량을 측정하기 위해 Tricine SDS-PAGE를 실시하였고, 항균물질 유무를 확인하기 위해 direct detection 방법을 수행하였다. 정제된 항균물질의 전기영동과 direct detection을 한 결과로 밴드가 하나이고 그 위치에 투명환이 형성됨을 확인하였다( Fig. 4 ). 또한 marker와 시료의 이동성을 비교하여 항균물질의 분자량이 약 3,500 Da임을 예측하였다.
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Tricine SDS-PAGE and direct detection of purified antimicrobial substance from Bacillus subtilis HH28. Lane 1, Ultra-low range molecular weight marker (26,600 Da, Triosephosphate isomerase from rabbit muscle; 17,000 Da, Myoglobin from horse heart; 14,200 Da, α-Lactalbumin from bovine milk; 6,500 Da, aprotinin from bovine lung; 3,496 Da, insulin chain B.); Lane 2, Purified antimicrobial substance eluted by sephacryl S-200HR; Lane 3, Gel overlayed with Bacillus cereus KCCM 12667.
B. subtilis 가 생산하면서 항균물질 중 약 3,500 Da 분자량을 가지는 것은 lantibiotic에 속하는 subtilin, subtilosin A, sublancin 168, ericin S 등이 있다. Subtilin은 pentacyclic peptide 형태로 3,319 Da이고 [24] , ericin S는 3,442 Da이며 subtilin과 4개의 아미노산 잔기만 다르고 매우 유사한 특성을 가진 물질 [23] 이다. subtilosin은 3,399 Da으로 posttranslational modification을 통해 macrocyclic 형태가 되며 [15] , sublancin 168은 3,877 Da이고 두개의 이황화 결합으로 연결된 lanthionine이 포함되어 있는 형태 [18] 로 알려져 있다.
본 연구의 항균물질의 정확한 구조를 파악하기 위해 아미노산 서열을 분석 방법인 Edman 법 [4] 을 시행하였다. 그러나 N-terminal이 block되어 아미노산 서열을 분석하지 못하였고, 따라서 추후의 본 연구의 항균물질의 자세한 구조 분석이 필요한 것으로 판단되었다
- 항균 spectrum
B. subtilis HH28이 생성하는 항균물질의 병원성 세균 및 곰팡이, 효모에 대한 항균효과는 Table 2 에 요약되어 있다. Paper disk method를 통하여 항균 활성을 측정한 결과, 그람 양성균인 B. cereus KCCM 12667, KCCM 11204, KCCM 40168, KCCM 40935, B. licheniformis KCCM 11237, B. subtilis KCCM 11314, Listeria monocytogenes KCCM 40307에 대한 저해 활성을 나타내었으며, 특히 B. cereus L. monocytogenes 의 활성이 큰 것을 확인 할 수 있다. 그람 음성균에서는 Shigella boydii KCCM 41649에 약한 저해 활성을 나타내었고, Vibrio parahaemolyticus KCCM 11965에서 큰 저해 활성을 나타내었다. 그리고 곰팡이와 효모에서는 활성이 없었다.
Inhibitory spectrum of antimicrobial substance fromBacillus subtilisHH28.
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−, no inhibition zone; ±, below 10 mm; +, below 13 mm; ++, 13-15 mm; +++, above 15 mm.
대부분의 Bacillus spp.가 생산하는 bacteriocin은 그람 음성균을 억제하지 못하고 그람 양성균 만을 억제하였다 [8] . 예를 들어 청국장에서 분리한 B. subtilis W42의 경우도 B. cereus L. monocytogenes 에 큰 항균활성을 나타내지만 그람 음성균에는 활성을 없었다 [11] . 그러나 본 연구의 항균물질은 그람 음성균의 V. parahaemolyticus 에 높은 활성을 보였는데 이 균은 해산물에 의한 식중독을 일으키는 균으로 잘 알려져 있으며, 중국 전통 콩 발효 식품에서 분리한 B. subtilis NT-6가 이에 대한 항균활성이 있음을 보고한 바 있다 [31] . 또한 그람 양성균 중 장류의 식중독균인 B. cereus 와 샐러드와 같은 최소 가공처리를 한 채소에서 식중독을 일으키는 L. monocytogenes 에 대한 항균활성이 매우 우수하여 천연 식품 보존제로 사용할 경우 큰 효과를 나타낼 것으로 사료되었다. 그러나 장류 발효 시 유용하게 작용하는 B. subtilis B. licheniformis 에 대한 항균활성을 가지고 있지만 그 활성이 매우 작아 큰 영향을 미치지 못할 것으로 사료되었다.
- 항균 작용 기전
2시간 동안 배양한 B. cereus 에 정제한 항균물질을 첨가한 후 2시간 만에 B. cereus 가 사멸한 것을 확인할 수 있었다( Fig. 5 ). 2시간 동안 배양한 B. cereus 의 생균수 8.4 log (CFU/ml)에서 B. subtilis HH28이 생성하는 항균물질을 첨가 한 2시간 후에는 B. cereus 의 콜로니를 확인하지 못했다. 이러한 결과를 보아 본 연구에서 정제한 항균물질은 B. cereus 에 대한 살균작용(bactericidal action)이 있음을 확인하였다. Kindoli 등 [10] 의 청국장에서 분리한 B. subtilis H27의 항균 물질 또한 살균작용을 하며, 1,600 AU/ml을 처리했을 때 12시간 동안 서서히 L. monocytogenes 가 사멸되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 본 연구의 항균물질은 32 AU/ml을 처리하여 2시간 만에 B. cereus 가 모두 사멸되고 12시간 동안 유지되는 것으로 보아 항균물질의 살균작용이 높다는 것을 확인할 수 있었다.
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Inhibition mode of antimicrobial substance from Bacillus subtilis HH28. Opened circle, Bacillus cereus KCCM12667 culture with purified antimicrobial substance; closed circle, Bacillus cereus KCCM12667 culture without purified antimicrobial substance.
- 항균물질의 안정성
pH 안정성을 측정하기 위해 pH 2-10까지 각각 완충용액으로 정제된 항균물질을 희석하여 배양온도인 40℃에서 12시간 방치 후 잔존 항균활성을 측정하였다. 본 연구의 항균물질은 pH 2-8까지 100%의 항균활성을 유지 하였고, pH 9에서는 50%로 pH 10에서는 25%로 항균활성이 감소하였다( Table 3 ). pH의 영향으로 B. cereus 의 성장을 저해한 것인지 확인하기 위하여 대조군으로 완충용액의 항균활성 실험을 실시하였는데 완충용액으로 인해 B. cereus 가 저해되지 않았다. 이 결과로 보아 본 연구의 항균물질은 염기성보다 산성일 때 안정성이 더 높다는 것을 확인할 수 있었다. Lee 등 [14] B. subtilis SC-8이 생성하는 항균물질은 pH 3에서 항균활성이 감소하고 pH 4-10은 항균활성이 유지됨을 알 수 있다. 본 연구의 항균물질과 반대로 산성에서 안정성이 낮고 염기성에서 안정성이 높다.
Effect of enzyme treatment, heat and pH on the antimicrobial activity ofB. subtilisHH28.
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Effect of enzyme treatment, heat and pH on the antimicrobial activity of B. subtilis HH28.
온도 안정성 측정은 정제한 항균물질을 40-80℃는 12시간 동안 방치하였고, 100℃는 1시간 방치 후의 잔존 항균활성을 측정하였다. 40-60℃에서 12시간 동안 방치한 후, 100%의 잔존 항균활성을 유지하였고, 80℃에서 12시간동안 방치한 경우, 12.5%로 잔존 항균활성이 감소하였다( Table 3 ). Lee 등 [14] 에서 80℃와 100℃에서 1시간 방치하였을 때 B. cereus 에 대한 항균활성이 소실되었다. Kindoli 등 [11] 의 경우 60-80℃에서 15분동안 방치하였을 때 항균활성이 50%가 감소하였고, 100℃ 10분 방치하였을 때 20%로 L. monocytogenes 의 항균활성이 감소하였다. 이러한 결과로 보아 본 연구의 항균물질은 온도에 대한 안정성이 높음을 알 수 있다.
단백질 분해 효소인 trypsin의 처리로 50%로 항균활성이 감소하였고, protease, proteinase K, pronase E의 처리시 항균활성이 소실되었다. Lysozyme, α-amylase, lipase를 처리하였을 경우, 모두 100% 활성이 유지됨을 알 수 있었다( Table 3 ). 단백질 분해효소에 의해 항균활성이 소실되므로 본 연구의 항균물질을 단백질성 물질임을 확인하였다.
Acknowledgements
This study was supported by the 2012 Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture, Forestry and Fisheries (iPET), Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (MAFRA).
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