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Anti-Oxidative and Anti-Inflammatory Activities of Euptelea Pleiosperma Ethanol Extract
Anti-Oxidative and Anti-Inflammatory Activities of Euptelea Pleiosperma Ethanol Extract
Microbiology and Biotechnology Letters. 2014. Apr, 42(2): 170-176
Copyright © 2014, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology
  • Received : March 07, 2014
  • Accepted : April 07, 2014
  • Published : April 28, 0214
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경숙 진
정애 박
지영 이
지숙 강
현주 권
병우 김
bwkim@deu.ac.kr

Abstract
본 연구에서는 Euptelea pleiosperma 에탄올 추출물(EPEE)의 항산화능과 항염증 생리활성을 in vitro assay system 및 cell culture model system을 이용하여 분석하였다. 먼저 EPEE의 항산화능을 DPPH radical scavenging activity로 분석한 결과 radical 소거능의 정도가 양성 대조군으로 사용한 ascorbic acid 보다 높은 활성을 보여 매우 강한 항산화능을 보유함을 확인하였다. 또한 RAW 264.7 세포주를 이용한 H 2 O 2 및 LPS의 유도에 의해 생성된 ROS에 대한 소거능을 분석한 결과에서도 농도의존적인 강한 소거능을 보였다. 뿐만 아니라 대표적인 항산화효소 중 하나로 천연물에 의한 항산화능 활성에 의해 주로 발현이 유도되는 hemeoxygenase 1 (HO-1) 및 그 전사 인자인 nuclear factor-E2-related factor 2 (Nrf2)의 단백질 발현이 EPEE의 처리에 의해 유의적으로 증가됨을 보였으며 이러한 HO-1 및 Nrf2의 발현 변화는 상위신호전달계인 MAPKs 및 PI3K/Akt 에 의해 조절될 가능성을 보였다. 한편 EPEE가 LPS에 의해 유도된 NO 생성에 미치는 영향을 분석한 결과 농도의존적인 NO 생성 저해능을 보였으며 이는 NO 생성 단백질인 iNOS의 발현 저해에서 기인함을 확인하였다. 이와 같은 EPEE의 NO 생성 억제 효과는 염증 상위신호전달계인 NF-κB 및 AP-1의 조절을 통해 일어날 가능성을 보였다. 이러한 결과를 통해 EPEE의 높은 항산화능과 항염증 활성을 처음으로 확인하였으며 향후 기능성 소재로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
Keywords
서 론
생명체의 대사과정에서 끊임없이 발생하는 활성산소종 (Reactive Oxygen Species, ROS)은 산화적 스트레스의 유발을 통해 세포조직에 치명적인 손상을 유발하며 암, 뇌 질환, 심장질환, 동맥경화, 당뇨병, 천식 등 생체 내에서 발생하는 수 많은 질환의 원인이 될 뿐 아니라, 노화를 일으키는 직·간접적인 원인물질로 작용하는 것으로 알려져 있다 [3 , 7 , 12 , 24 , 25] . 또한 염증은 외부자극에 대한 생체조직의 방어 기전의 하나로 지속적인 염증 반응은 조직의 손상을 일으켜 암을 비롯한 각종 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다 [5 , 8] . 이에 따라 최근 많은 연구들이 항산화 및 항염증 활성을 바탕으로 한 생리활성 보유 신소재 개발 및 그 활성 기전의 규명에 주력하고 있으며 특히 천연유래 소재로부터 유용성분을 추출하고 생리활성을 규명하여 기능성 소재로서의 가능성을 타진하는 연구가 활발히 이루어지고 있다 [16 , 17 , 26] .
대표적인 cellular defensive phase 2 detoxifying antioxidant enzyme으로 알려진 heme oxygenase (HO)-1, NAD(P)H dehydrogenase 1 (NQO1), thioredoxin reductase 1 (TrxR1)의 유도는 산화적 스트레스를 방어하는 중요한 기전 중 하나로 다양한 carcinogen으로부터 세포를 보호하는 chemoprevention에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다 [6 , 33] . 특히 천연에서 유래한 다양한 dietary phytochemical은 nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2)에 의해 조절되는 phase 2 detoxifying antioxidant enzyme의 발현 증가를 통해 chemopreventive function을 나타내며 extracellular signalregulated kinase (ERK), c-jun N-terminal kinase (JNK), and p38과 같은 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)와 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt와 같은 상위신호 전달기전의 영향을 받는다 [13 , 18 , 20 , 28] . 이러한 chemoprevention은 항산화 활성을 기초로 하여 함암 뿐만 아니라 염증, 뇌 및 심혈관계 질환, 노화 등의 예방 및 치료 기전과도 상호작용하는 것으로 알려져 있어 그 중요성이 더욱 커지고 있다 [4 , 14 , 27 , 31] .
생체 내 염증 반응은 대식세포(macrophage)에서 과량 생산되는 염증 매개인자(inflammatory mediators)로 부터 유래되는데 inducible nitric oxide synthase (iNOS)로 부터 생산되는 nitric oxide (NO)와 cyclooxygenase 2 (COX-2)로부터 생산되는 prostaglandin E2 (PGE2) 등이 대표적이다. 외부 자극에 의해 과량 생산된 염증 매개인자는 tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 1β (IL-1β) 등과 같은 사이토카인을 생산하여 다양한 염증 반응을 일으킨다 [14 , 15] . 염증 반응의 대표적인 세포 실험계 중 하나인 RAW 264.7 murine macrophage에 lipopolysaccharide (LPS) 등의 염증 유발 인자를 처리하면 iNOS 및 COX-2의 발현 유도에 의해 NO와 PGE2 등 염증 매개인자의 생성 및 이를 통한 사이토카인 분비량 증가를 확인할 수 있으며 이러한 일 련의 반응은 대표적인 염증 상위신호전달기전인 nuclear factor (NF)-κB와 activator protein (AP)-1에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다 [20 , 22 , 28] . 그러므로 이러한 염증 매개인자와 그 상위신호전달기전을 효과적으로 제어할 수 있는 물질들이 염증의 예방 및 치료를 위한 소재로서 각광받고 있다.
Euptelea pleiosperma 는 Eupteleaceae과에 속하는 낙엽수이며 영춘목으로도 불린다. 동아시아 지역, 주로 중국 및 히말라야 일대에 분포한다. 잎은 식용 가능하며, 꽃과 가지의 껍질은 약용으로 알려져 있으나 그 구체적인 효능에 대해서는 알려진 바가 없으며, 특히 항산화 및 항염증 효과에 대해서는 전혀 알려진 바 없다. 이에 본 연구에서는 천연에서 유래한 생리활성 보유 신소재 개발의 일환으로 E. pleiosperma 95% 에탄올 추출물(EPEE)이 보유한 항산화 및 항염증 활성을 in vitro assay system 및 cell culture model system을 이용하여 분석함으로써 기능성 소재로서의 활용 가능성을 확인해 보고자 하였다.
재료 및 방법
- E. pleiosperma추출물의 제조
본 연구에서 사용한 E. pleiosperma 95% 에탄올 추출물 (EPEE)은 한국생명공학연구원, 해외생물소재허브센터에서 구입(분양번호 FBM123-004)하여 사용하였다. 건조 및 분쇄한 시료를 95% 에탄올을 용매로하여 45°C에서 3일간 초음파 추출을 수행하였다. 추출이 끝난 시료를 filter로 여과하여 고형물을 없애고 감압농축(N-1000SW, EYELA, Japan) 및 동결 건조(FDU2100, EYELA, Japan)하여 사용 전까지 4°C에 보관하였다.
- DPPH radical 소거 활성 측정을 통한 EPEE의 항산화능 분석
항산화 작용의 주요 기전 중 하나인 전자공여능은 인체 내에서 생성되는 free radical의 전자를 공여함으로써 free radical에 의한 노화와 질병을 억제한다. 항산화 작용의 주요 지표로서의 전자공여능은 특히 천연물이 보유한 항산화능의 측정에 많이 사용되고 있으며 [7] , 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) radical 소거능 분석을 이용하여 측정하였다. DPPH는 비교적 안정한 free radical로써, ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는 원리를 이용하여 항산화 활성을 간단히 측정할 수 있는 동시에 식물체의 항산화 활성과도 연관성이 매우 높기 때문에 많이 이용되고 있는 방법이다 [11] .
DPPH radical scavenging activity 측정을 위해 EPEE를 농도별(0.1024-12.8 μg/ml)로 메탄올에 녹여 준비하고 96 well plate에 메탄올에 용해된 1.5 × 10 −4 M DPPH 40 μl와 각 시료 160 μl를 분주한 혼합액을 실온에서 30분간 반응시킨 후, multi-plate reader (Paradigm, Beckman, CA, USA)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 비교하여 free radical 소거 정도를 백분율로 나타내고, 50% 저해 농도(Inhibitory Concentration, IC 50 )를 계산하였다. 대표적인 항산화제로 DPPH radical 소거 활성 측정 시 양성 대조군으로 주로 사용되는 ascorbic acid를 함께 비교 분석하였다. DPPH radical 소거능의 백분율 공식은 다음과 같다. DPPH radical scavenging activity (%) = {1 − (A − B)/C} × 100
  • A: sample absorbance at 520 nm
  • B: color control absorbance at 520 nm
  • C: control absorbance at 520 nm
- RAW 264.7 murine macrophage의 배양
항산화 및 항염증 활성의 세포 실험 모델계로 murine macrophage cell line인 RAW 264.7을 American Type Tissue Collection (ATCC ® , TIB-71 TM , Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 10% fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin/streptomycin (Pen/Strep)이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다 [23] .
- EPEE의 세포생존율 분석
활성 분석 수행 전 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 확인함과 동시에 세포 독성을 유발하지 않는 시료의 처리 농도를 결정하기 위해 EPEE에 의한 세포 독성 유발 유무를 WST assay를 통해 수행하였다. 1.0 × 10 5 cell을 24-well tissue culture plate에 분주하여 24시간 동안 부착시키고, EPEE 처리 24시간 후 WST 시약이 든 배지로 교체하여 한 시간 동안 반응시킨 다음 multi-plate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 후 독성을 유발하지 않는 농도 범위에서 실험을 수행하였다.
- EPEE의 reactive oxygen species (ROS) scavenging activity 분석
ROS는 과량 생산 시 DNA, protein, lipid를 포함한 생체내 분자에 산화적인 변형을 유발하여 다양한 질병의 원인이 되므로 ROS 소거능은 항산화능의 중요한 지표로 활용된다 [19] . Hydrogen peroxide (H 2 O 2 )는 대표적인 ROS 중 하나로 소재의 항산화능의 규명하기 위한 많은 연구에서 ROS 유도제로 사용되고 있다 [29 , 30 , 32] . 또한 그람 음성 세균의 세포 외벽을 구성하는 주요 인자인 lipopolysaccharide (LPS)는 대표적인 염증 유발 인자로 산화적 스트레스 또한 유발하는 것으로 알려져 있어 항산화능 및 항염증 활성을 규명하기 위한 많은 연구에 사용되고 있다 [1 , 21] . 본 연구에서는 EPEE가 보유한 항산화능을 H 2 O 2 및 LPS로 유도한 ROS 생성에 시료가 미치는 영향을 통해 분석하였다. 이를 위해 RAW 264.7 cell에 cell permeable fluorescent dye인 50 μM의 dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)를 2시간 동안 전처리한 후 제거하고 500 μM의 H 2 O 2 혹은 1 μg/ml의 LPS를 농도 별 시료와 함께 처리한 후 시료에 의한 ROS 생성 억제능을 multiplate reader를 이용한 fluorescence 측정을 통해 분석하였다.
- 항산화 효소 HO-1, TrxR1, NQO1 및 그 전사인자인 Nrf2의 발현 조절능 분석
EPEE의 항산화 활성 기전을 알아보기 위해 대표적인 항산화 효소인 HO-1, TrxR1, NQO1과 그 전사인자인 Nrf2의 시료 처리에 의한 단백질 발현 변화를 Western blot hybridization으로 분석하였다. HO-1과 p-p38, p-JNK, p- ERK, 그리고 p-Akt의 일차항체는 Cell Signaling Technology (MA, USA)로부터 구입하였고, p-Nrf2의 일차항체는 Calbiochem (CA, USA)로부터 구입하였으며, TrxR1, NQO1, Nrf2, Actin의 일차항체와 anti-goat, anti-rabbit, 그리고 anti-mouse 등의 이차항체는 Santa Cruz Biotechnology (CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 시료 처리가 끝난 배양 세포에서 단백질을 추출하여 bradford assay로 단백질 농도를 결정한 후 50 μg의 단백질을 10% sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 blotting한 후 1:1,000-5,000으로 희석한 대상 단백질의 일차항체와 hybridization 하였다. Membrane washing 후 horse radish peroxidase (HRP)가 부착된 이차항체(1:1,000)로 한 시간 동안 반응시킨 후 chemiluminescence detection system (FluoChem ® FC2, AlphaInnotech, USA)을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.
- EPEE의 NO 생성 억제능 분석
대표적인 free radical 중 하나인 NO는 생체 내에서 중요한 세포신호전달물질로서 작용하나 과잉 생산 시 산화적 스트레스의 유발을 통해 염증 및 세포 손상의 원인이 된다 [10] . 이러한 NO 생성 억제능의 분석은 Park 등 [23] 의 방법을 변형하여 수행하였다. RAW 264.7 cell을 24-well tissue culture plate에 well 당 1.0 × 10 5 cell을 seeding하여 부착시킨 후 1 μg/ml의 LPS를 처리하여 NO 생성을 유도하고 식물 추출물에 의한 NO 생성 저해능을 Griess reaction을 통해 분석하였다.
- EPEE의 항염증 활성 기전 분석
EPEE가 보유한 NO 생성 억제능의 기전을 밝히기 위해 NO 생성의 핵심 단백질인 iNOS의 단백질 발현을 분석하였다. 또한 EPEE에 의한 NO 생성 및 iNOS의 발현 저해능이 NF-κB 및 AP-1에 의해 조절될 가능성을 알아보기 위해 LPS로 유도된 NF-κB p65와 inhibitory κBα (IκBα), 그리고 AP-1의 subunit인 c-Jun의 인산화에 EPEE가 미치는 영향을 분석하였다. Western blot hybridization을 위한 iNOS, p-p65, p-IκBα, 그리고 p-c-Jun의 일차항체는 Cell Signaling Technology (MA, USA)로 부터 구입하여 사용하였다. 시료 처리가 끝난 배양 세포에서 단백질을 추출하여 bradford assay로 단백질 농도를 결정한 후 50 μg의 단백질을 10% SDS-PAGE로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 blotting한 후 대상 단백질의 항체와 hybridization하였다. Membrane washing 후 HRP가 tagging된 이차항체로 한 시간 동안 반응시킨 후 chemiluminescence detection system을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.
- 데이터 처리 및 통계 분석
모든 실험 결과는 최소 3회 이상의 반복 실험을 통하여 얻은 데이터를 평균(mean) ± 표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었고, 필요 시 대표적인 그림이나 데이터를 제시하였다. 각 데이터의 통계 분석은 SPSS 20.0 software를 이용한 unpaired Student’s t -test를 통해 p 값이 0.05 미만 ( p < 0.05)인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
결과 및 고찰
- EPEE의 항산화능 분석
EPEE의 항산화능 보유 유무 및 그 정도를 알아보기 위해 먼저 항산화능의 주요 지표 중 하나인 DPPH radical scavenging activity를 분석하였다. 그 결과 Table 1 에 제시된 바와 같이 EPEE의 농도 증가에 따라 강한 radical 소거능을 보여 0.1024, 0.512, 2.56, 12.8 μg/ml의 시료 처리에 의해 DPPH radical 소거능이 각각 26.11, 40.49, 93.83, 98.00%로 나타나 50% 소거 농도를 나타내는 IC 50 값이 0.88 μg/ml로 양성 대조군으로 사용한 ascrobic acid, 즉 vitamin C의 IC 50 값인 1.53 μg/ml 보다 높은 활성을 보여 매우 강한 항산화능을 보유함을 확인하였다. 이에 EPEE가 보유한 항산화능의 정도 및 기전을 세포 수준에서 확인할 필요성이 제기되었다.
DPPH radical scavenging activity of EPEE.
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DPPH radical scavenging activity of EPEE.
- EPEE의 ROS scavenging activity 분석
DPPH radical scavenging activity 분석을 통해 EPEE가 보유한 높은 항산화능이 확인됨에 따라 그 작용 기전을 좀 더 자세히 알아보기 위해 먼저 RAW 264.7 cell에 대표적인 산화적 스트레스 유도인자인 H 2 O 2 와 LPS를 각각 처리하여 EPEE에 의한 ROS scavenging activity를 분석하였다. 그 결과 Fig. 1 에 제시한 바와 같이 H 2 O 2 와 LPS에 의해 각각 유도된 ROS 생성이 EPEE의 처리에 의해 효과적으로 저해되는 것으로 나타나 EPEE가 DPPH radical 뿐만 아니라 세포 실험계에서 H 2 O 2 와 LPS에 의해 유도된 산화적 스트레스 또한 효과적으로 감소시킴을 확인하였다.
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Effect of EPEE on H2O2- (A) and LPS- (B) induced ROS scavenging activity in RAW 264.7 cells. Values are represented as the mean ± SD (n = 6). *, #Significantly different from the vehicle control [0, H2O2 or LPS (−)] and H2O2- or LPS- induced control [0, H2O2 or LPS (+)], respectively (p < 0.05).
- EPEE가 항산화 효소 HO-1, TrxR1, NQO1 및 상위 전사인자 Nrf2의 발현에 미치는 영향
강한 항산화능을 보유한 천연 유래 소재들이 Nrf2에 의한 항산화 효소계의 발현 유도를 통해 활성을 나타낸다는 것이 여러 연구를 통해 밝혀짐에 따라 EPEE가 보유한 항산화능의 작용 기작을 알아보고자 하였다 [9 , 27] . 이를 위해 대표적인 항산화 효소들로 천연물에 의한 항산화 활성에 의해 주로 발현이 유도되는 세 효소인 HO-1, TrxR1, NQO1의 단백질 발현과 그 상위 전사인자인 Nrf2의 단백질 발현 및 인산화에 EPEE가 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과 Fig. 2A 에 제시된 바와 같이 6시간 동안 10-50 μg/ml의 시료 처리에 의해 세 효소 중 HO-1의 발현이 강한 증가를 보였다. 뿐만 아니라 HO-1의 상위 전사 인자인 Nrf2의 단백질 발현과 인산화 또한 증가되는 것으로 나타나 EPEE에 의한 HO-1의 발현 증가가 Nrf2의 발현 증가 및 인산화에 의해 나타날 가능성을 보였다. 이러한 결과는 시간의 변화에 따른 발현 형태를 관찰한 Fig. 2B 에서도 유사한 양상을 보여 50 μg/ml의 EPEE를 시간 별로 처리한 결과 세 효소 중 HO-1의 발현이 증가하는 것으로 나타났으며 이는 Nrf2의 발현 증가와 인산화에서 기인할 것으로 판단되었다 [2 , 6] .
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Modulation of anti-oxidative enzymes, HO-1, NQO1, TrxR1, and their upstream transcription factor, Nrf2 protein expression and phosphorylation in RAW 264.7 cells by EPEE. (A) Dose dependency and (B) time course study. Actin was used as an internal control.
- EPEE가 상위신호전달인자인 MAPKs와 PI3K/Akt의 인산화에 미치는 영향
EPEE가 보유한 항산화능의 상위신호전달기전을 알아보기 위해 p38, JNK, 그리고 ERK 등의 MAPKs와 Akt의 인산화에 EPEE가 미치는 영향을 분석한 결과 Fig. 3 에 제시된 바와 같이 6시간 동안 10-50 μg/ml의 시료 처리에 의해 4종 모두 인산화가 증가되는 것으로 나타났으며 그 정도 및 경향은 다소 차이를 보여 p-38과 JNK는 농도의존적인 인산화의 증가를 보였으나 ERK와 Akt는 처리 농도에 상관없이 유사한 정도의 인산화를 나타내었다. 이러한 결과를 통해 EPEE의 항산화능이 HO-1과 그 상위전사인자인 Nrf2의 발현 증가를 통해 나타나며 그러한 일련의 과정이 MAPKs와 PI3K/Akt와 같은 상위신호전달인자에 의해 나타날 가능성을 확인하였다.
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Effect of EPEE on the phosphorylation of MAPKs and PI3K/Akt signaling molecules in RAW 264.7 cells. Actin was used as an internal control.
- EPEE의 NO 생성 저해능 분석
EPEE가 항산화능 뿐만 아니라 항염증 활성 또한 보유하는지를 알아보기 위해 먼저 NO 생성에 미치는 효과를 알아보았다. LPS로 자극을 유도한 쥐 대식세포주 RAW 264.7 cell에서 농도별 EPEE의 처리에 따른 NO 생성양의 변화를 분석한 결과 Fig. 4 에 제시된 바와 같이 10-50 μg/ml의 시료 처리에 의해 세포독성의 유발없이 농도의존적인 NO 생성 저해능을 보였으며 이는 NO 생성 단백질인 iNOS의 발현저해에서 기인하는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 EPEE가 산화적스트레스 뿐만 아니라 염증성 자극에 대한 방어능 또한 보유함을 확인하였다.
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Effect of EPEE on cell viability (A), LPS-induced NO formation (B), and iNOS protein expression (C) in RAW 264.7 cells. (A, B) Values are represented as the mean ± SD (n = 3). *, #Significantly different from the vehicle control [0, LPS (−)] and LPS-induced control [0, LPS (+)], respectively (p < 0.05). (C) Actin was used as an internal control.
- EPEE가 NF-κB 및 AP-1의 인산화에 미치는 영향 분석
EPEE가 iNOS의 발현 저해에 따른 NO 생성 억제능을 보유함을 확인함에 따라 항염증 활성의 상위신호전달기전인 NF-κB와 AP-1의 연관성을 알아보기 위해 EPEE가 LPS에 의해 유도된 NF-κB p65와 IκBα, 그리고 AP-1의 subunit 중 하나인 c-Jun의 인산화에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과 Fig. 5 에 제시된 바와 같이 2시간 동안의 LPS 처리에 의해 유도된 세 전사인자의 인산화가 EPEE 농도의 증가에 따라 유의적으로 억제되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 EPEE의 항염증 활성이 항염증 상위신호전달인자들의 일련의 조절 기작을 통해 이루어질 가능성을 시사하였다.
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Modulation of EPEE on the upstream signaling pathway for anti-inflammatory activity in RAW 264.7 cells. Actin was used as an internal control.
이상의 결과를 통해 EPEE가 높은 항산화능과 항염증 활성을 보유함을 처음으로 확인하였으며, 이러한 결과는 신규 소재에 대한 새로운 기능성 데이터를 구축함과 동시에 향후 생리활성 보유 기능성 소재로서의 활용을 위한 근거자료로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
Acknowledgements
This work was supported by Blue-Bio Industry Regional Innovation Center (RIC08-06-07) at Dong-Eui University as a RIC program under Ministry of Trade, Industry and Energy (MOTIE) and Busan city.
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