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Effect of Zeta Potential on Fractional Precipitation for the Purification of Paclitaxel from Plant Cell Cultures of Taxus chinensis
Effect of Zeta Potential on Fractional Precipitation for the Purification of Paclitaxel from Plant Cell Cultures of Taxus chinensis
Microbiology and Biotechnology Letters. 2014. Apr, 42(2): 114-120
Copyright © 2014, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology
  • Received : April 07, 2014
  • Accepted : April 28, 2014
  • Published : April 28, 0214
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흥곤 류
진현 김
jinhyun@kongju.ac.kr

Abstract
본 연구에서는 주목 식물세포( Taxus chinensis ) 배양 유래항암물질 paclitaxel을 정제하기 위하여, 반응액 부피당 표면적이 증가된 분별침전에서 표면적증가물질 실리카-알루미나의 제타전위가 분별침전 양상(순도, 수율, 침전시간, 침전물형태와 크기)에 미치는 영향을 조사하였다. 실리카-알루미나의 제타전위가 양(+)의 값으로 증가할수록 paclitaxel 수율은 증가하였으며 침전 시간은 감소하였다. 표면적증가물질로 제타전위가 가장 큰 알루미나(제타전위: +35.41 mV)를 이용한 경우 표면적증가물질을 이용하지 않은 경우에 비해 침전에 소요되는 시간을 12시간 정도 단축시킬 수 있었다. 반면 표면적증가물질 실리카-알루미나의 전타전위 변화에도 paclitaxel 순도는 거의 변화가 없었다. 또한 분별침전 과정에서 제타전위 절대값이 증가할수록 paclitaxel 침전물의 크기는 감소하여 제타전위 절대값에 반비례함을 알 수 있었다. 이러한 개선된 분별침전 공정은 바이오매스 유래 paclitaxel 정제 공정에 효과적으로 기여할 것으로 판단된다.
Keywords
서 론
Paclitaxel ( Fig. 1 )은 주목나무(yew tree) 표피에서 분리한 diterpenoid 계열의 항암물질로 1971년 Wani 등 [23] 에 의하여 화학적 구조가 규명되었으며 1979년 Schiff 등 [22] 에 의하여 항암기작이 밝혀졌다. 난소암, 유방암, 카포시 종양 (Kaposi's sarcoma) 및 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 치료용으로 미국 FDA (U.S. Food and Drug Administration) 허가를 취득하여 현재 가장 많이 사용되고 있는 항암제이다. 류마티스성 관절염, 알츠하이머 치료 등의 적용증이 계속 확대되고 있으며, 또한 여러 다른 치료 방법들과의 복합처방에 관한 임상시험이 진행 중에 있어 향후 paclitaxel 수요는 계속 늘어날 전망이다 [8] . Paclitaxel의 주요 생산 방법으로 주목나무에서 직접 추출하는 방법, 반합성 방법, 식물세포배양 방법이 있다. 식물세포배양 방법은 기후, 환경 등의 외부인자에 의한 영향을 받지 않고 생물 반응기 내에서 안정적으로 생산이 가능하기 때문에 일정한 품질의 paclitaxel을 대량 생산할 수 있다는 장점이 있다 [4] . 식물세포배양으로부터 paclitaxel을 생산하기 위해서는 여러 단계의 분리 및 정제 공정을 거치게 된다. 일반적으로 세포 배양액으로부터 회수한 바이오매스를 유기용매로 먼저 추출하고, 전처리 공정을 거쳐 최종 정제를 통하여 제품을 생산하는 공정으로 이루어져 있는데, 이 과정에서 특히 전처리 공정은 최종 정제 비용에 많은 영향을 미친다. 기존의 연구들은 정제를 위한 전처리 공정으로 고가의 크로마토그래피를 이용하고 있거나 전처리 없이 추출을 거친 crude paclitaxel을 high performance liquid chromatography (HPLC)에 의해서 바로 최종 정제하여 경제적 측면에서 많은 문제가 있으며 또한 scale-up에 많은 어려움이 따른다 [1 , 21] . 대체로 바이오매스로부터 유기용매를 이용하여 paclitaxel을 추출하면 순도는 0.5% 이하이며, 간단한 전처리 공정 후에도 10% 이하의 순도로 매우 낮다. 이러한 시료를 바로 HPLC에 의하여 최종 정제할 경우 많은 양의 유기용매 사용, 칼럼 충진제(resin)의 수명 단축, 처리량(throughput) 감소 등 상당히 비경제적이며 대량 생산을 위한 공정으로는 적합하지 않다. 따라서 전처리 공정을 통하여 시료의 순도를 가능하면 높여 주어야 최종 정제, 특히 HPLC를 이용한 정제에서의 비용을 줄일 수 있다. 2000년 분별침전(fractional precipitation)에 의해 높은 순도(>50%)의 paclitaxel을 얻을 수 있는 간단한 전처리 방법이 개발되었다 [13] . 식물세포배양액으로부터 식물세포를 회수하고 회수된 식물세포를 용매 추출한 후에 흡착과 헥산 침전을 거치면 시료의 순도가 대략 15% 정도인데 이를 분별침전을 통해 50% 이상의 높은 순도의 paclitaxel을 얻을 수 있다. 그러나 분별침전의 단점은 침전에 많은 시간(~3일)이 소요되어 상업적 대량생산 공정에 응용되는데 많은 어려움이 있다. 2004년과 2008년에 마이셀(micelle) 및 침전(precipitation)에 의한 전처리 공정이 보고되었는데 [9 , 11] , 최적의 계면활성제(N-cetylpridinium chloride, CPC)를 이용한 마이셀 공정을 통하여 순도 20-30% 정도의 paclitaxel을 얻었는데 이는 여전히 낮은 순도로 후속 공정에 많은 부담을 준다는 문제점을 가지고 있다. 2009년과 2010년에 개선된 분별침전이 보고되었는데 [6 , 10] , glass beads와 이온교환수지(Amberlite 200, Amberlite IRA 400)를 이용하여 반응액 부피당 표면적(surface area/working volume, S/V)을 증가시켜 분별침전 효율을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하였다. 2012년에는 분별침전에서 침전물 입자 크기와 표면적증가물질(이온교환수지) 첨가에 따른 용액의 제타전위(zeta potential) 값과의 연관성을 최초로 보고하였다 [7] . 하지만 표면적증가물질의 제타전위가 침전 효율에 미치는 영향에 대한 구체적 연구는 수행된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 제타전위 조절이 용이한 표면적증가물질 실리카-알루미나 혼합물을 제조하여 제타전위가 분별침전 양상(순도, 수율, 분별침전 시간, paclitaxel 입자 형태 및 크기)에 미치는 영향을 구체적으로 조사하였다. 이러한 연구결과를 통하여 기존의 분별침전 공정 [6 , 7 , 10 , 12 , 14] 이 가지고 있는 문제점(특히 긴 침전시간 문제)을 해결함으로써 paclitaxel 생산 공정 개선을 통한 비용 절감뿐만 아니라 paclitaxel 최종 정제를 위한 HPLC 공정에서의 정제 효율 향상에 많이 기여할 것으로 판단된다.
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The chemical structure of paclitaxel
재료 및 방법
- 식물재료와 배양조건
본 실험에 사용된 식물세포배양액은 Taxus chinensis 의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)를 이용하여 배양하였다. Taxus chinensis 로부터 기원된 현탁액 세포는 24°C 암조건에서 150 rpm으로 교반하여 배양하였다. 현탁(suspension) 세포는 수정된 Gamborg's B5 배지 [3] , 30 g/l sucrose, 10 μM naphthalene acetic acid, 0.2 μM 6-benzylamino purine, 1 g/l casein hydrolysate, 1 g/l 2-[N-morpholino] ethanesulfonic acid에서 배양하였다. 세포 배양은 2주마다 새로운 배지로 갈아 주었으며 생산과 배양을 연장시키기 위해 7일과 21일째 되는 날에 1-2%의 maltose를 첨가해 주고 elicitor로서 배양 초기에 4 μM의 AgNO3를 첨가해 주었다. 식물세포배양 후 배양액으로부터 decanter (Westfalia, CA150 Claritying Decanter)와 고속원심분리기(α-Laval, BTPX205GD-35CDEEP)를 이용하여 식물세포와 세포조각 (cell debris)을 회수하였다. 회수한 식물 세포와 세포조각(cell debris)을 합하여 바이오매스라 하였다. 본 연구에 사용된 바이오매스는 (주)삼양제넥스로부터 제공받았다.
- Paclitaxel 분석
Paclitaxel 함량 분석을 위해 HPLC system (Waters, USA)과 Capell Pak C 18 (250 × 4.6 mm, Shiseido, Japan) 칼럼을 사용하였다. 이동상은 아세토니트릴과 증류수 혼합 용액(35/65-65/35, v/v, 구배용매조성법)을 유속 1.0 ml/min으로 흘려주었다. 시료 주입양은 20 ml이며 227 nm에서 UV에 의해 검출하였다. HPLC 분석은 표준정량곡선을 이용하였으며 표준시료는 Sigma-Aldrich 제품(순도: 95%)을 사용하였다 [18] .
- 분별침전(fractional precipitation)을 위한 시료준비
식물세포배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비율을 1/1 (w/v)로 하여 실온에서 30분 동안 추출하여 여과하고, 바이오매스에 새로운 메탄올을 첨가하여 동일한 방법으로 4회 반복하여 추출을 수행하였다. 추출 여액을 모아 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)에서 40°C, 감압상태에서 농축(원액의 30%)하고 농축액에 메틸렌 클로라이드를 첨가 (농축액의 25%)하고 실온에서 30분 동안 액-액 추출을 3회 반복 수행하였다. 액-액 추출을 통해 극성불순물은 상층인 메탄올 층으로 제거하고, paclitaxel은 하층인 메틸렌 클로라이드 층으로 회수하여 실온, 감압상태에서 농축/건조하였다. 식물세포 유래 타르 및 왁스 성분을 제거하기 위하여, 건조된 시료를 메틸렌 클로라이드에 20% (v/w) 비율로 녹이고 흡착제 sylopute (Fuji Silysia Chemical Ltd., Japan)를 건조된 시료 대비 50% (w/w) 비율로 첨가하여 40oC에서 30분 동안 교반하며 반응시킨 후 여과하였다. 여과액은 30°C, 감압상태에서 건조하여 헥산 침전에 이용하였다. 건조된 시료를 메틸렌 클로라이드에 녹여 헥산 용액에 떨어뜨려 침전을 유도하여 비극성불순물(non-polar impurity)을 제거하였다(메틸렌 클로라이드/헥산 = 1/10, v/v). 헥산 침전 후 여과를 통하여 paclitaxel 침전물을 회수하고 24시간 동안 진공건조(UP-2000, EYELA, Japan)하여 분별침전에 이용하였다 [20] . 헥산 침전 후 건조된 시료의 순도는 44.3%이었다.
- 분별침전(fractional precipitation)
메탄올 용액에서 paclitaxel의 용해도 차이를 이용한 분별침전 공정의 개략도를 Fig. 2 에 나타내었다. 분별침전을 위하여, 헥산 침전을 통해 얻은 시료(순도: 44.3%)을 메탄올에 녹이고(pure paclitaxel basis: 0.5%, w/v) 메탄올 농도가 61.5%가 될 때까지 증류수를 교반(180 rpm) 하에 한 방울씩 떨어뜨렸다 [17] . 반응액 부피당 표면적(1007.6 mm −1 ) 증가 및 제타전위 조절을 위하여, Table 1 에서 보는 바와 같이 다양한 종류의 실리카-알루미나 혼합물(Al, Al 0.8 Si 0.2 , Al 0.5 Si 0.5 , Al 0.2 Si 0.8 , Si)을 제조하여 분별침전에 이용하였다. 제조된 실리카-알루미나 혼합물을 각각 분별침전 용액에 첨가한 후 저온(4-7°C)의 항온항습기(KCL-2000W, EYELA, Japan)에 보관하여 paclitaxel 침전물을 얻었다. 분별침전 용액에서의 표면적증가물질(실리카-알루미나)의 제타전위는 ELS-Z (Photal, Japan)를 이용하여 측정하였다. 분별침전 후 침전물을 여과하고 35°C에서 24시간 동안 진공오븐(UP-2000, EYELA, Japan)에서 건조하여 HPLC로 분석하였다.
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Schematic diagram of fractional precipitation for prepurification of paclitaxel.
Physical properties of Al, Al0.8Si0.2, Al0.5Si0.5, Al0.2Si0.8, Si.
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Physical properties of Al, Al0.8Si0.2, Al0.5Si0.5, Al0.2Si0.8, Si.
- 침전물 형태 및 크기 확인
분별침전 공정에서 paclitaxel 침전물 형태 확인 및 크기 측정을 위하여 전자현미경(SV-35 Video Microscope System, Some Tech., Korea)을 사용하였다 [10] . 분별침전을 통해 얻은 paclitaxel 침전물을 고배율(×100)에서 관찰하였다. 관찰 된 paclitaxel 침전물은 IT-Plus software (Some Tech., Korea)에서 동화상으로 확인하였으며 이를 통해 paclitaxel 침전물의 형태와 크기를 확인하였다.
- 실리카−알루미나 혼합 흡착제 제조
분무열분해 공정에 의해 다공성 메조기공 실리카-알루미나를 제조하였다. 알루미늄 전구체로 aluminum nitrate (Al(NO 3 ) 3 ·9H 2 O, Aldrich)를 사용하였고, 실리카 전구체로는 tetraethylorthosilicate (TEOS, Adrich)를 사용하였다. 기공 형성을 위한 주형제로는 poly(ethylene glycol)-blockpoly( propylene glycol)-block-poly(ethylene glycol) (P123, Aldrich)를 사용하였다. 분무용액은 실리카 전구체를 녹인 용액에 알루미늄 전구체를 녹이고, P123을 첨가하여 제조하였다. 알루미늄 전구체와 실리카의 전체 농도는 0.2 M로 고정하였고, 알루미늄 기준 유기 템플릿 P123의 몰 비는 0.07로 고정시켜 주었다. 알루미늄과 실리카의 몰비는 0-1로 변화시켜 주었다. 제조한 분무용액은 초음파 액적 발생장치(aerosol generator, 진동자 6개, 1.7 MHz, 동림엔지니어링)를 이용하여 액적화를 한 다음 운반기체를 통하여 반응기내로 이동시켰다. 운반기체로는 공기를 사용하였으며, 유량은 10 L/min으로 고정하였다. 건조부와 반응부의 반응기는 길이 1200 mm, 직경 55 mm인 석영관을 각각 사용하였다. 건조부를 2구역으로 나누고 각각의 온도를 T1 = 300°C, T2 = 350°C, 반응부의 온도는 T3 = 600°C로 고정시켰다. 최종 반응부를 통과한 입자들은 테플론 필터를 이용하여 포집하였다. 제조된 분말에 잔존하는 유기물들을 없애기 위해 전기로 내에서 소성시켜 제거하였다. 전기로의 온도는 550°C(승온 속도: 1°C/min) 공기분위기 하에서 4시간 동안 소성시켰다. 소성 후 얻은 분말의 질소 흡착/탈착 등온선은 200o°C에서 전처리 후 Micrometrics 사의 ASAP 2000을 이용하여 −196°C에서 측정하였다. 상대압력 0.06-0.3 범위에서 흡착 데이터와 Brunauer-Emmett-Teller (BET)법을 이용하여 표면적을 계산하였다 [5] . 기공부피는 상대압력 0.995에서 흡착 부피로부터 계산하였으며 기공크기는 17-3000 Å 범위에서 탈착 등 온선으로부터 Barrett-Joyner-Halenda (BJH)법을 이용하여 계산하였다. 제조된 실리카-알루미나 혼합물의 물성치는 Table 1 에 나타내었다.
결과 및 고찰
- 표면적증가물질 실리카-알루미나 혼합물의 영향
분별침전은 항암물질 paclitaxel을 효율적으로 정제할 수 있는 매우 간편한 방법으로, 용해도 차이를 이용하여 높은 순도의 paclitaxel을 고수율로 얻을 수 있는 대표적인 전처리 공정이다. 선행연구 [7] 에서는 분별침전에서 침전물 입자 크기와 표면적증가물질(이온교환수지) 첨가에 따른 용액의 제타전위(zeta potential) 값과의 연관성을 최초로 보고하였다. 하지만 분별침전 용액의 제타전위가 침전 효율에 미치는 영향에 대한 구체적 연구는 수행된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 분별침전 용액의 제타전위 조절이 용이한 실리카-알루미나를 제조하여 제타전위 변화에 따른 paclitaxel 순도, 수율, 분별침전 시간, 침전물 형태 및 크기를 조사하였다. 실리카-알루미나 혼합비율을 달리하여 제타전위 값이 다른 다섯 종류의 표면적증가물질 Al(제타전위: 35.41 mV), Al 0.8 Si 0.2 (제타전위: 8.16 mV), Al 0.5 Si 0.5 (제타전위: −23.08 mV), Al 0.2 Si 0.8 (제타전위: −23.95 mV), Si (제타전위: −21.57 mV)를 제조하여 실험을 수행하였다( Table 1 ). 표면적 증가에 따른 영향을 배제하기 위하여 반응액 부피당 표면적를 1007.6 mm −1 로 고정하고 분별침전 시간에 따른 paclitaxel의 수율과 순도를 확인하였다( Fig. 3 ). 표면적증가물질(실리카-알루미나)을 첨가한 경우, 표면적증가물질을 첨가하지 않은 control에 비해 paclitaxel 수율이 상당히 향상되었다. 침전 시간이 경과함에 따라 Al와 Al 0.8 Si 0.2 를 사용한 경우 paclitaxel 수율도 증가하다 12시간부터 거의 변화가 없었으며 Al 0.5 Si 0.5 , Al 0.2 Si 0.8 , Si를 사용한 경우 18시간부터 거의 변화가 없었다. Al을 첨가한 경우 분별침전 6시간에서 paclitaxel 수율은 70% 정도로 같은 침전시간에서 표면적 증가가 없는 control 경우(~23%)에 비해 3배 이상 증가하여 분별침전에 소요되는 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있었다. 이러한 현상은 분별침전 용액에서 음전하(−)는 띠고 있는 paclitaxel이 입자(control의 경우 제타전위: −8.03 mV)와 양전하(+)를 띠고 있는 Al(제타전위: +35.41 mV) 사이의 친화력(affinity)으로 표면적증가물질 표면에서 paclitaxel 과포화도가 상대적으로 증가하게 되어 침전이 더 효과적으로 이루어지는 것으로 판단된다 [17] . 반면 침전시간과 제타전위 변화에 관계없이 paclitaxel 순도(~80%)는 비슷한 경향을 보였다. 이상의 결과로부터, 분별침전 시 표면적증가물질 Al(제타전위: +35.41 mV)를 사용한 경우 가장 높은 수율(76%)로 고순도(81%)의 paclitaxel을 얻을 수 있어 표면적증가물질로 가장 효과적임을 알 수 있었다. 또한 표면적증가물질이 첨가되지 않을 경우에 비해 분별침전에 소요되는 시간을 획기적으로 단축(~12시간)시킬 수 있었다. 이러한 연구결과는 기존 연구 [6 , 10] 에서 표면적증가물질 glass beads, Amberlite 200, Amberlite IRA 400에 비해 순도, 수율, 분별침전 시간 측면에서 더 효과적임을 알 수 있었다. 실리카-알루미나의 혼합비율에 따라 제타전위 값과 수율과의 연관성을 알아보기 위하여, 분별침전 시 표면적증가물질(실리카-알루미나)을 첨가하여 분별침전 용액에서의 제타전위 값을 분석하여 Fig. 4 에 나타내었다. 알루미나의 비율이 증가할수록 제타전위 값(+)이 증가함을 알 수 있었으며, 제타전위 값(+)이 증가함에따라 paclitaxel 수율도 비례하여 증가함을 알 수 있었다. 이러한 결과는 분별침전 공정에서 제타전위가 paclitaxel 수율 에 많은 영향을 미침을 알 수 있었다.
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Effect of silica-alumina used to increase S/V (1007.6 mm−1) on yield (A) and purity (B) of paclitaxel during fractional precipitation.
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The relation between zeta potential and paclitaxel yield.
- Paclitaxel 침전물 형태와 크기 변화
분별침전 공정에서 반응액 부피당 표면적 증가를 위한 표면적증가물질 첨가에 따른 분별침전 시간별 paclitaxel 침전물의 크기 변화를 조사하였다. 분별침전 동안 전자현미경을 이용하여 paclitaxel 침전물의 형태와 크기를 측정하였다. Fig. 5 에서 보는 바와 같이 핵을 중심으로 가지가 성장하며 전체적으로 바늘 형태를 띠었다. 하지만 제타전위가 양(+)의 값으로 증가함에 따라 더 얇은 바늘 형태의 침전물이 생성되며, 음(−)의 값으로 증가할수록 두꺼운 바늘 형태를 띠는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 침전물과 표면적증가물질 간의 전기적 상호작용(electrostatic interaction)에 기인하는 것으로 판단된다 [17] . 동일한 분별침전 시간에서는 표면적증가물질을 첨가하지 않은 대조구에 비해 표면적증가물질을 첨가하였을 경우 paclitaxel 침전물의 크기가 상당히 감소함을 알 수 있었다( Fig. 6 ). 이러한 현상은 표면적증가물질이 paclitaxel 침전물의 입자 성장 과정에서 공간적 저해 요소(steric barrier) 역할을 하기 때문으로 판단된다 [17] . 분별침전 시간(6-12시간)이 경과함에 따라 paclitaxel 침전물의 형태가 핵을 중심으로 가지가 많아지며 성장하는 것을 알 수 있었으며 분별침전 12시간 이후부터는 침전물의 개수가 많아지고, 입자 크기는 작아짐을 알 수 있었다. 침전물 수가 많아진 것은 입자간 충돌이 잦아 입자들이 부숴졌거나, 2차 핵생성(nucleation)이 일어나 작은 입자들이 많이 생성되기 때문으로 판단된다. 2차 핵생성은 입자 간의 접촉 및 충돌, 또는 결정화가 일어나는 벽에 의한 물리적 충돌에 의해 이루어질 수 있다 [4 , 15 , 16] . 또한 동일한 분별침전 18시간에서의 침전물의 입자 크기와 제타전위와의 관계를 Fig. 7 에 나타내었다. Paclitaxel 침전물 크기는 표면적증가물질인 실리카-알루미나 첨가에 따른 용액의 제타전위 절대값에 반비례함을 알 수 있었다. 즉, 분별침전 용액의 제타전위 절대값이 증가할수록 분별침전을 통하여 얻은 paclitaxel 침전물의 크기가 감소하였다. 이러한 현상은 제타전위 절대값이 큰 표면적증가물질은 상호간의 반발력이 강하여 paclitaxel 침전물의 입자 성장 과정에서 서로 뭉침 현상이 없이 안정되게 유지되어 더 효과적인 공간적 저해요소 역할을 하기 때문으로 판단된다 [2 , 7 , 17] . 일반적으로 원료의약품(active pharmaceutical ingredient, API)의 경우 입자 크기를 작게하여 그 활용도를 높이고자 한다. 입자 크기가 작아질수록 제형 시 용해 속도(dissolution rate), 약물 분산의 균일성 (uniformity of drug dispersion), 경구 생체 이용률(oral bioavailability) 등을 향상시킬 수 있는 장점을 가지고 있기 때문이다 [2 , 17] . 또한 입자 크기가 작을수록 정제 후 건조 단계에서 잔류수분 및 잔류용매 제거에도 상당히 도움이 되기 때문이다 [19] . 이러한 이유로 본 연구 결과인 분별침전 공정에서 표면적증가물질(실리카-알루미나)에 의한 paclitaxel 입 자크기 감소는 의약품의 활용 측면에서도 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
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Electron micrograph of the paclitaxel precipitate formed by fractional precipitation at 6-24 h: Control (A), Al (B), Al0.8Si0.2, (C), Al0.5Si0.5 (D), Al0.2Si0.8 (E), Si (F). Scale bar indicates 100 μm.
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Effect of silica-alumina used to increase S/V (1007.6 mm−1) on the size of paclitaxel precipitate through precipitation time.
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The relationship between particle size of paclitaxel precipitate and zeta potential of reacting solution with silicaalumina mixture during fractional precipitation. The methanol composition in water, pure paclitaxel content, crude extract purity, precipitation temperature, and precipitation time were 61.5% (v/v), 0.5%(w/v), 44.3%, 4°C, and 18 h, respectively. The zeta potential values of Al, Al0.8Si0.2, Al0.5Si0.5, Al0.2Si0.8, and Si were +35.41, +8.16, −23.08, −23.95, and −21.57 mV, respectively.
Acknowledgements
This work was supported by the research grant of the Kongju National University in 2013.
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