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Anti-atopic Activity of Sargassum micracanthum Ethanol Extracts
Anti-atopic Activity of Sargassum micracanthum Ethanol Extracts
Microbiology and Biotechnology Letters. 2014. Jan, 42(1): 82-88
Copyright © 2014, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology
  • Received : January 06, 2014
  • Accepted : March 11, 2014
  • Published : January 28, 2014
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다현 정
꽃봉우리 김
민지 김
보경 강
시우 박
원민 박
보람 김
홍민 박
무혁 임
동현 안
dhahn@pknu.ac.kr

Abstract
Atopic dermatitis (AD) is a common chronic inflammatory disease preceding the development of allergic disorders. The aim of this study was to evaluate the effect of Sargassum micracanthum ethanol extract (SMEE) on AD. AD was induced by spreading 2,4-dinitrochlorobenzen (DNCB) on the back sides of BALB/c mice. The efficacy of SMEE was tested by observing the skin clinical severity score, proliferations of Raw 264.7 cells and the secretion of cytokines and IgE. The secretion of IL-4, and IgE was significantly decreased by SMEE in a dose dependent manner, while IFN-γ was increased. In addition, SMEE alleviated the AD symptoms better when compared to the positive controls. In conclusion, these results suggest that SMEE has an inhibitory effect on AD, and may serve as a useful biomaterial for the development of cosmeceuticals.
Keywords
서 론
아토피 피부염은 알레르기성 질환 중 대표적인 난치성 질환으로 지속적인 소양증을 일으키는 피부 표층의 염증을 뜻한다 [5] . 일반적으로 피부 건조, 가려움, 염증을 동반한 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 습진을 말하며, 이러한 질병들은 개인 및 가족력과 밀접한 관련을 맺고 있다 [2 , 24] . 피부염의 종류에 따라 다양한 위험 인자가 존재하나, 각 질환에 있어 유전적인 원인은 공통의 원인으로 작용하지만 식생활 변화 및 공해, 피부건조, 집먼지진드기, 동물의 털과 분비물 등 다양한 환경적인 요인들이 유발 물질로서 작용하기도 한다 [3 , 5 , 6 , 31] . 아토피 피부염에 있어 Th2 면역 소인은 가장 큰 위험 인자로 피부염 환자의 혈청 내 면역글로불린 E(IgE)의 생성량을 높이는데 영향을 미친다 [7] . 면역학적 기전을 살펴보면, 항원에 의해 Th1과 Th2 cytokines 사이의 균형이 깨지게 되고, 과잉 생산된 Th2 cytokine인 IL-4,5,9,13이 B cell을 자극하여 IgE를 증가시킨다 [1] . 증가된 IgE는 비만세포(mast cell) 표면의 FcRI 수용체에 결합을 하는데(cross-linked), 알레르겐이 다시 인체에 침투하는 경우, 이 알레르겐과 위 FcRI 수용체에 붙은 specific IgE가 결합하여 비만세포를 감작시킨다. 비만세포가 더한 자극을 받아 결합이 깨지면서 세포 내에 저장되어 있는 히스타민, 류코트리엔 등의 화학물질들이 탈과립되면, 혈관과 피부를 자극하여 피부에 붉은 반점과 부종 그리고 가려움증을 동반한 아토피 피부염을 유발하거나 악화시킨다 [21 , 24] . 대부분의 아토피 피부염 환자의 치료에 있어 국소 요법이 주로 사용되고 있으나, 좋은 효능에도 불구하고 부작용으로 인한 임상적 한계를 지니고 있다 [11 , 20] . 현재 사용 중인 아토피 피부염 치료제들은 대부분 외용제 중심의 증상 완화제들이며, 심각한 전신성 질환 치료제의 경우 독성(부작용)이 발현되고 고가로 인해 장기간 사용하기 어려워 특히 빈번하게 발생하고 있는 소아나 유아에 있어 최적 치료제가 없는 실정이다 [11 , 20 , 27 , 34] .
지구 생물 중 약 80%를 차지하는 해양생물 [15] 은 육상생물에 비해 고염, 고압의 특수한 환경에서 생육하면서 다양한 미네랄 성분을 함유하고 있어 오래 전부터 한국, 일본 등 극동아시아 지역에서 우수한 먹거리로 이용되어 왔다 [13] . 그중 식용으로 쓰이는 해조류는 일반적으로 열량 및 영양성분은 낮은 편이지만 다양한 생리활성 물질들을 함유하고 있는 것으로 보고되고 있다. 해조류는 건강에 필수적인 다양한 무기염류들을 다량 함유하고 있으며, 특히 비소화성 복합다당류(agar, alginic acid, fucoidan, laminaran, starch)들은 다양한 생리활성 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 또한 항균, 항염증, 항암, 항당뇨 및 항산화 등 많은 생리활성을 가지고 있는 것으로 밝혀지면서 해조류에 대한 생리활성 연구가 활발히 진행되고 있다 [14 , 16 , 19 , 22 , 23] . 해조류에는 알긴산과 칼슘이온, 요오드 성분이 많기 때문에 대장의 연동 운동 촉진과 골다공증 예방 및 갑상선 부종을 억제시키는 역할을 하는 것으로 보고되어 있다 [4] .
잔가시 모자반( Sargassum micracanthum )은 모자반목 모자반과에 속하는 갈조류로 우리나라 인근 해역에서 쉽게 채취할 수 있는 대표적인 해조류이다. 잔가시 모자반에 관한 연구는 현재, 항비만 [18] 및 항산화 [8 , 12] 에 관한 일부가 수행되고 있다. 따라서 본 연구에서는 DNCB(2,4-Dinitrochlorobenzene)로 유발된 접촉성 피부염 동물 모델에 잔가시 모자반 에탄올 추출물을 도포하여 세포 배양액 내의 cytokine 분비량, 혈청 내 IgE 분비량 측정 및 육안 평가 등을 통해 잔가시 모자반 에탄올 추출물의 아토피 억제 효과를 밝히고 기능성 소재로의 이용 가능성을 제시하고자 연구하였다.
재료 및 방법
- 실험재료
잔가시 모자반( Sargassum micracanthum )은 2011년 부산 연화리에서 채취한 것으로 담수로 깨끗이 수세, 건조, 분쇄한 후 −20℃에서 보관하며 실험에 사용하였다.
- 잔가시 모자반 추출물 제조
잔가시 모자반 분말에 10배량의 에탄올을 가하고, 교반기(H-0820, Dongwon Science Co., Busan, Korea)를 이용하여 24시간 추출하였다. 원심분리기(UNION 32R, Hanil Co., Incheon, Korea)를 이용하여 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취하였고, 남은 잔사를 이와 동일한 방법으로 2회 반복하여 추출하였다. 추출한 상층액은 37℃에서 감압농축기(RE200, Yamoto Co., Tokyo, Japan)로 농축하여 사용하였다.
- 실험동물
생후 4주령의 수컷 BALB/c 마우스를 사용하였다. 마우스는 오리엔트바이오(Orient Co., Seongnam, Korea)로부터 구입하여 온도 20±2℃, 습도 50±10%, 12시간 명암주기가 유지되는 동물실에서 6주간 예비사육 한 후 실험에 사용하였다.
- 아토피 피부염 유발 및 시료처리
Ahn 등 [2] 의 방법을 약간 변형하여 아토피 피부염을 유발하였다. 생후 6주령의 수컷 BALB/c 마우스의 등 부위를 깨끗하게 제모 한 후, 미세상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 24시간 후, 아세톤과 올리브오일 혼합액(3:1)에 용해시킨 1% (w/v) DNCB(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 200 μl을 일주일에 3번 마우스의 귀 뒤쪽과 등 부위에 도포하였다. 일주일 후부터는 0.3% (w/v) DNCB 200 μl을 하루에 한 번 동일한 부위에 고르게 도포하였다. 시료(30 mg/ml)는 0.3% (w/v) DNCB 용액과 12시간 간격으로 하루에 한번, 200 μl씩 2주 동안 마우스의 귀 뒤쪽과 등 부위에 고르게 도포하였다.
- 비장 세포 분리 및 배양
Mishell 등 [25] 의 방법을 약간 변형하여 비장 세포를 분리하였다. 실험이 끝난 마지막 날에 각 실험군(NC: Negative control, PC: Positive control, and SMEE)별로 5마리의 수컷 BALB/c 마우스를 diethyl ether로 마취하여 희생시킨 후, 비장을 무균적으로 적출하였다. 적출한 비장은 RPMI 배지(RPMI Medium 1640, GIBCO, NY, USA)로 세척한 후, tissue grinder로 균질화하여 세포를 유리시켰다. 세포 현탁액을 1,800 rpm, 4℃에서 5분간 원심 분리 한 후, RBC (Red blood cells, Tris-buffered ammonium chloride; 0.87% (w/v) NH 4 Cl, pH 7.2) lysis buffer에 10분간 정치시켜 적혈구를 제거하였다. 그 후, 10% (w/v) FBS (Fetal bovine serum)-RPMI 배지를 첨가하여 2×10 6 cells/ml 농도로 희석된 비장 세포 현탁액을 37℃, CO 2 incubator (MCO-15 AC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 72시간 배양하였다.
- 비장 세포 배양액의 cytokine 분비량 측정
비장세포로부터 생성되는 IFN-γ 및 IL-4 cytokine의 분비량을 ELISA-kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, San Diego, USA)를 이용하여 측정하였다. Micro-plate에 capture antibody로 anti-mouse IFN-γ 및 IL-4를 처리하고 4℃에서 하룻밤 동안 coating시켰다. 이를 PBST (Phosphate bufferd saline-Tween 20, 0.01M PBS, pH 7.2, 0.05%(w/v) Tween 20)로 세척한 뒤, 10% (w/v) FBS 용액으로 실온에서 1시간 동안 blocking하였다. 1시간 후에 PBST로 세척한 뒤, 배양 상층액을 분주하고 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBST로 다시 세척을 하고 희석한 biotinylated anti-mouse IFN-γ, IL-4 detection antibody와 streptoavidin-horseradish peroxidase conjugated를 분주하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 이를 다시 PBST로 세척한 다음, OPD ( o -phenylenediamine, Sigma Chemical Co., USA) 및 H 2 O 2 를 첨가한 citrate buffer (pH 5.0)을 첨가하여 실온에서 30분간 암반응 시켰다. 2 N H 2 SO 4 로 반응을 종료시킨 후, micro-plate reader (Model 550, Bio-rad, Richmond, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 비장세포의 증식능 측정
비장세포 현탁액을 2×10 6 cells/ml 농도로 96 well-plate에 분주한 후, 37℃, CO 2 incubator에서 72시간 배양하였다. 배양 후, 5 mg/ml MTT (thiazol blue tetrazolium bromide, Sigma Chemical Co., USA) 용액을 첨가하고 2시간 재 배양하여 formazan crystal 형성을 유도하였다. 이를 2,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리한 후, 상층액을 제거하고 DMSO (dimethyl sulfoxide, Sigma Chemical Co., USA)를 첨가하고 micro-plate reader (Model 550, Bio-rad, Richmond, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 비장 세포 증식능은 다음 식에 의해 계산하였다.
Proliferation Index (%) = (Sample의 흡광도/Control의 흡광도) × 100
- 혈액 채취 및 혈청 내 total IgE 함량 측정
실험 종료일에 마우스를 Diethyl ether로 마취시키고 대동맥으로부터 Disposable syringe (Sungshim medical Co., LTD, Bucheon, Korea)를 이용해서 혈액을 대략 1.0 ml 채취하였다. 혈액은 10,000 rpm, 4℃에서 5분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청은 실험에 사용하기 전까지 −20℃에서 보관하였으며 마우스 혈청 내 total IgE 함량은 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. 먼저 ELISA micro-plate에 anti-mouse IgE를 분주하고 4℃에서 하룻밤 동안 coating시켰다. 이를 PBST로 세척한 뒤, 2% (w/v) BSA (Bovine serum albumin, Sigma Chemical Co., USA) 용액으로 실온에서 1시간 동안 blocking하였다. 1시간 후에 PBST로 세척한 뒤, 배양 상층액을 분주하고 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBST로 다시 세척을 하고 희석한 biotinylated anti-mouse IgE detection antibody와 streptoavidin-horseradish peroxidase conjugated를 분주하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 이를 다시 PBST로 세척한 다음, OPD 및 H 2 O 2 를 첨가한 citrate buffer (pH 5.0)을 첨가하여 실온에서 30분간 암반응시켰다. 2 N H 2 SO 4 로 반응을 종료시킨 후, micro-plate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Skin clinical severity score
시험 물질 도포 후 0, 7, 14일이 되는 시점에 실시하였다. 본 평가 방법은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 육안 평가 방법으로써 아토피성 피부염의 심각성 정도를 다음의 5가지 항목을 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타내었다. 평가 항목은 홍반(erythema), 가려움과 건조피부(pruritus & dry skin), 부종과 혈종(edema & excoriation), 짓무름(erosion) 및 태선화(lichemification)로 나누었고 각각의 항목을 없음(0), 약함(1), 보통(2), 심함(3)으로 채점한 후 합산함으로써 최소 0점에서 최고 15점 사이의 점수를 부여하였다 [33] .
- 통계 처리
모든 실험에 대한 통계 처리는 SAS program (Statistical analytical system V8.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 one way ANOVA법으로 분산 분석을 실시하였으며, 조사 항목들 간의 유의성 검정은 Duncan의 다중 검정법으로 p < 0.05 수준에서 실시하였다.
결과 및 고찰
- 비장 세포 배양액의 cytokine 분비량 측정
IFN-γ는 Th1 세포에서 생산되는 cytokine으로써 macrophage의 활성을 강력히 유도하고 natural killer cell의 활성을 증가시켜 암의 감시 및 감염에 대한 세포성 면역 효과를 증진시키며, Th2 세포의 증식을 억제하여 IL-4의 생산을 저해함으로써 알레르기에 대한 보호효과를 갖는다 [26] . 본 연구에서 아토피를 유발한 마우스 비장세포의 IFN-γ 분비량( Fig. 1 )은 negative control (1583.23±4.14 pg/ml)과 비교하여 현저히 낮은 값(509.12±12.42 pg/ml)을 나타냈으며, SMEE 처리구의 경우 그 분비량이 1273.02±12.42 pg/ml으로 비장 세포의 IFN-γ 생산을 촉진시킴으로써 Th1 세포의 기능을 활성화시켜 세포성 면역을 증진시킬 것으로 사료된다. 또한 아토피 피부염은 정상인에 비해 IL-4 생산은 많아지고 IFN-γ는 생산이 줄어들어 그 현상으로 IgE 생산이 증가한다고 알려져 있는데 [17] , IL-4 cytokine의 분비량을 측정한 결과( Fig. 2 ), Th2 cytokine인 IL-4의 생성을 유의적으로 억제시킴을 확인할 수 있었다. Negative control은 2.38±3.63 pg/ml으로 positive control 군은 81.89±5.44 pg/ml으로 나타나 PC가 NC에 비하여 큰 폭으로 증가하였고 잔가시모자반 SMEE 처리구는 28.03±0.00 pg/ml으로 나타나 PC에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 이처럼 아토피 피부염을 유발한 동물 모델에 잔가시모자반 에탄올 추출물을 도포함으로써 Th1 세포와 Th2 세포의 각기 특징적인 cytokine의 분비량을 조절하는 데에 효과적인 것으로 사료된다.
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Effects of Sargassum micracanthum ethanol extract on IFN-γ production in splenocytes from atopic dermatitis-like skin lesions mice. Negative control (NC, n = 5): untreated, Positive control (PC, n = 5): DNCB and vehicle, SMEE (n = 5): DNCB and Sargassum micracanthum ethanol extract, a-cMeans with different superscripts are significantly different (p < 0.05).
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Effects of Sargassum micracanthum ethanol extract on IL-4 production in splenocytes from atopic dermatitis-like skin lesions mice. Negative control (NC, n = 5): untreated, Positive control (PC, n = 5): DNCB and vehicle, SMEE (n = 5): DNCB and Sargassum micracanthum ethanol extract, a-cMeans with different superscripts are significantly different (p < 0.05).
- 비장세포의 증식능 측정
DNCB로 아토피 피부염을 유발한 마우스에 2주간 SMEE를 도포한 후, 비장세포를 분리 및 배양하여 MTT assay를 실시하였다. 그 결과( Fig. 3 ), positive control군에서 DNCB로 아토피를 유발한 경우 비장세포의 증식능이 확연히 증가한 반면, SMEE 처리구의 경우 negative control 군과 유사한 수준까지 감소함을 보였다. 따라서 SMEE의 도포는 DNCB에 의해 자극된 비장세포의 증식을 억제시키며, 또한 SMEE가 비장세포의 증식능에 있어 세포독성을 보이지 않는 것을 확인하고 실험을 진행하였다.
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Effects of Sargassum micracanthum ethanol extract on the proliferation in splenocytes from atopic dermatitis-like skin lesions mice. Negative control (NC, n = 5): untreated, Positive control (PC, n = 5): DNCB and vehicle, SMEE (n = 5): DNCB and Sargassum micracanthum ethanol extract, a-bMeans with different superscripts are significantly different (p < 0.05).
- 혈청 내 total IgE 함량 측정
아토피 피부염 환자의 급성 질환에서 Th1 cytokine인 IFN-γ가 감소해있으며, 이는 IgE 과생산과 Th2 면역 반응을 유도한다. 이러한 결과들에서 아토피 피부염은 Th2 cytokine이 중요한 기능을 하는 것을 알 수 있으며, IgE는 아토피 피부염을 진단하는 표식자라고 할 수 있다 [30] . 일반적으로, 아토피 피부염 환자의 80~85%가 혈청 중 총 IgE의 함량이 상승되어 있으며 아토피 피부염뿐만 아니라 천식, 비염 등의 알레르기성 질환의 발현에 IgE가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다 [9] . 본 연구에서는 DNCB로 아토피 피부염을 유발하고 3주간 SMEE를 도포한 뒤, BALB/c 마우스의 혈청으로부터 IgE의 함량을 ELISA 방법으로 정량했다( Fig. 4 ). 그 결과, negative control군의 혈청 중 총 IgE의 함량은 29.86±0.14 pg/ml이었으며 positive control군의 혈청 중 총 IgE 함량은 330.57±0.29 pg/ml으로 나타났다. 반면에 SMEE 처리에 따른 결과는 160.31±0.58 pg/ml의 IgE 농도를 나타내어 SMEE 도포에 의해 혈청 중 IgE의 생성이 유의적으로 억제된 것을 확인하였다. 이는 Jeong [10] 등의 해조류 추출물의 아토피 완화 효과에 관한 연구 결과와 유사하며, 계피나무 추출물 [32] , 생약복합제 [35] 등의 IgE 함량억제 연구와 비슷한 결과를 나타낸다.
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Effects of Sargassum micracanthum ethanol extract on total lgE production in sera from atopic dermatitis-like skin lesions mice. Negative control (NC, n = 5): untreated, Positive control (PC, n = 5): DNCB and vehicle, SMEE (n = 5): DNCB and Sargassum micracanthum ethanol extract. a-cMeans with different superscripts are significantly different (p < 0.05).
- Skin clinical severity score
본 연구에서는 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 육안평가 법 [33] 을 이용하여 홍반(erythma), 가려움과 건조피부(pruritus & dry skin), 부종과 혈종(edema & excoriation), 짓무름(erosion), 태선화(lichenification)와 같은 5가지 항목을 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타냈다. DNCB 처리한 BALB/c mice는 실험군 별로 각각 5마리씩 실험에 이용하였다. SMEE의 아토피 피부염에 대한 회복 정도를 조사하기 위하여 negative control 군과 DNCB로 아토피 피부염을 유발시킨 positive control 군 및 DNCB로 유발 후에 SMEE를 도포한 처리구로 나누어 실험을 실시하였다. SMEE 처리 1주 후, PC는 등 부위에 피부 반점, 홍반, 피부 건조, 부종 및 출혈 등이 심하게 나타났으나 SMEE를 1주간 지속적으로 도포한 경우 환부의 피부염이 어느 정도 회복되는 양상을 볼 수 있었으며 2주간 지속적으로 도포했을 경우에는 거의 정상 피부 상태로 회복되는 것을 확인하였다( Fig. 5 ). 또한 severity score 그래프도 육안평가 결과와 같은 양상으로 나타났다( Fig. 6 ). Positive control 군과 비교 시 유의적인 차이는 없었으나 2주째까지 SMEE를 지속적으로 도포하였을 경우에는 positive control군과 비교하여 score가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 참소리쟁이 물 추출물 [2] , 도라지 추출물 [28] , 어성초 추출물 [29] 등을 이용한 항아토피 연구 결과와 유사하였다. 따라서 SMEE를 피부에 도포함으로써 아토피 피부염을 효과적으로 완화시킬 것으로 사료된다.
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Effects of Sargassum micracanthum ethanol extract on clinical skin features of DNCB-applied BALB/c mice. Negative control (NC, n = 5): untreated, Positive control (PC, n = 5): DNCB and vehicle, SMEE (n = 5): DNCB and Sargassum micracanthum ethanol extract.
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Effects of Sargassum micracanthum ethanol extract on clinical score of DNCB-applied BALB/c mice. Negative control (NC, n = 5): untreated, Positive control (PC, n = 5): DNCB and vehicle, SMEE (n = 5): DNCB and Sargassum micracanthum ethanol extract. a-bMeans with different superscripts are significantly different (p < 0.05).
요 약
본 연구는 DNCB 도포를 통해 아토피 피부염을 유발시킨 BALB/c mice에 SMEE를 2주 동안 지속적으로 처리하여 SMEE의 아토피 피부염 완화 효과에 대해 연구하였다. 따라서 IFN-γ 및 IL-4 cytokine의 분비량, 비장세포 증식능, 혈청 중 총 IgE 함량, 육안 평가 및 skin clinical severity score를 실시하였다. 그 결과 SMEE를 지속적으로 도포함으로써 IL-4 cytokine과 총 IgE 함량이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었으며 IFN-γ cytokine은 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 세포증식능 측정결과, SMEE 처리구의 경우 negative control군과 유사한 수준까지 억제됨을 나타냈으며, 비장세포의 비이상적인 증식에 SMEE 도포처리가 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 육안평가 및 skin clinical severity score 결과, SMEE를 2주간 지속적으로 도포 처리하였을 때, 그 증상이 눈에 띄게 완화되는 것을 확인할 수 있었으며 score 또한 positive control과 비교 시 유의적으로 감소하였다. 결과적으로 SMEE는 Th1 cytokine 생성은 증가시키고 Th2 cytokine 생성은 억제하여 IgE의 과다발현을 억제함으로써 아토피 피부염의 개선에 뛰어난 효능을 가지고 있는 것으로 사료된다.
Acknowledgements
This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2012R1A6A1028677).
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