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Direct Conversion of L-Selenomethionine into Methylselenol by Human Cystathionine γ-Lyase
Direct Conversion of L-Selenomethionine into Methylselenol by Human Cystathionine γ-Lyase
Microbiology and Biotechnology Letters. 2014. Jan, 42(1): 11-17
Copyright © 2014, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology
  • Received : December 11, 2013
  • Accepted : December 24, 2013
  • Published : January 28, 2014
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현남 조
광환 지
khjhee@kumoh.ac.kr

Abstract
Selenium(Se)은 사람에게 필수성분이지만 독성이 강한 물질이다. 따라서 생체에서 Se(셀레늄)의 농도조절은 정확하고 효율적으로 이루어져야 한다. 사람은 Se을 음식의 형태로 섭취해야 하고 주로 seleno-L-methionine (L-SeMet)의 형태로 섭취한다. 섭취된 L-SeMet은 methionine 대사와 동일한 효소를 이용하여 Se-adenosyl-L-SeMet으로 대사된다고 알려져 있었다. 그러나 최근 쥐의 간 추출물의 실험에서, L-SeMet이 cystathionine γ-lyase (mouse CGL)의 작용으로 methylselenol(CH 3 SeH)로 직접적으로 대사된다는 보고가 있었다. CGL은 원래 cystathionine을 L-cysteine과 α-ketobutyrate, 그리고 NH 3 로 분해하는 효소로 알려져 있었다. 따라서 본 연구에서는 쥐의 간 추출물 대신에 인간의 CGL을 분리 정제하여 L-SeMet에서 methylselenol의 형성을 확인하고자 하였다. Methylselenol의 표준시료는 dimethyldiselenide를 sodium tetrahydroborate로 환원시켜 준비하였다. 그리고 L-SeMet을 기질로 사용한 효소 반응액 중에서 가스상의 생성물은 GC/MS 스펙트럼으로 분석하였다. 분석 결과 methylselenol의 유도체인 dinitrophenyl selenoether와 일치하였다. 또한 인간 CGL이 L-SeMet에서 methylselenol을 형성하는 반응의 kinetic parameter를 mouse CGL과 비교 분석하였다. 결과적으로 human CGL은 섭취된 L-SeMet의 대사를 책임지고 있는 중요한 효소이다.
Keywords
서 론
Selenium (Se, 셀레늄)은 포유류에 있어 필수성분이지만 과다 복용 시 독성으로 작용한다 [22] . 이전에 중국의 흑룡강성 극산현에서 다발한 심장병(Keshan disease)이 Se 결핍에 의한 풍토병으로 판명된 적이 있다 [8] . 이 지방에서는 토양과 하천에 Se 함량이 적은 이유로, 이 지역에서 재배된 음식에는 Se 함량이 적어 풍토병의 원인이 되었던 것이다. Se이 생체에서 필수인 이유는 cytosolic glutathione peroxidase(cGPx, EC 1.11.1.9), thioredoxin reductase (TR, EC 1.6.4.5)등 필수 효소의 활성중심에 seleno-L-cysteine (L-SeCys) 잔기의 형태로 함유되어 중요한 생리적 기능을 담당하고 있기 때문이다 [26 , 27] . cGPx와 TR 두 효소는 각각 glutathione과 thioredoxin과 함께 생체 내에서 발생하는 과산화지질을 포함하는 다양한 활성산소를 제거하여 생체 내의 산화적 스트레스에 대한 방어 역할을 수행하고 있다 [23] . 또한 TR에 의해 환원되는 thioredoxin은 전사인자인 NF-κB의 활성화 기능을 갖는 산화환원 조절인자이기도 하다 [10] . 따라서 면역담당 세포의 증식촉진과 cytokine의 생산 등 다양한 세포응답에 있어서 Se의 역할이 중요하다 [2] . 더욱이 Se은 항암제인 cisplatin(cis-diamminedichloroplatinum)의 부작용을 경감시키는 효과와 [16] 암의 화학적 예방작용을 갖는다 [6] . 비록 정확한 Se의 항암작용 메커니즘은 밝혀지지 않았지만, 주로 세포증식 억제작용에 의한 것으로 추정되며 이러한 효과를 나타내는 Se 대사물의 하나로 methylselenol (monomethyl selenol, CH 3 SeH)이 주목을 받고 있다 [11] .
따라서 사람은 Se를 함유한 음식을 섭취해야 하고 연구에 따르면 주로 식물성 식품의 seleno-L-methionine (L-SeMet)의 형태로 섭취되며 [14 , 28] , L-SeMet은 Se의 공급에 적합한 형태라고 알려져 있다 [24] . 섭취된 L-SeMet의 대사는 특이한 효소가 없이 methionine과 동일하게 최초 adenosylation으로 시작해 demethylation되어 L-selenohomocystein이 되고, selenocystathionine을 거쳐 L-SeCys으로 전환된다고 알려져 있다 [4 , 5] ( Fig. 1 ). 이렇게 생성된 L-SeCys은 selenocysteine β-lyase에 의해 분해되어 H 2 Se (hydrogen selenide)가 생성되거나 또는 selenocysteinyl-tRNA에 의해 단백질의 구성 아미노산이 된다 [15] . H 2 Se는 Se를 함유한 단백질(selenoprotein) 생합성에 필요한 selenophosphate의 합성에 Se를 전달시키는 역할을 하는 대사 중간체이다 [9] . H 2 Se는 반응성이 매우 높고 Se 화합물 중에서 가장 강한 독성을 나타내므로 [7] 사용되지 않고 남은 H 2 Se는 빠르게 methyltransferase의 작용을 받아 methylselenol (CH 3 SeH), dimethylselenide [(CH 3 ) 2 Se], trimethylselennonium ion [(CH 3 ) 3 Se + ] 등으로 변환 시키거나 Se를 포함한 당의 형태(1β-methylselenol-N-acetyl-D-galactosamine)로 배출되게 된다 [13 , 17] . 한편 섭취된 L-SeMet이 H 2 Se에 이르기까지의 일련의 대사과정에서 adenosylhomocysteinase (EC 3.3.1.1)가 Se-adenosylselenohomocysteine에서 selenohomocysteine으로의 반응을 촉매 한다는 명확한 증거가 없어 생체 내의 L-SeMet의 대사경로에 의문이 남는다.
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Metabolic pathway of selenium compounds in mammal tissues. SeMet: selenomethionine, SeCys: selenocysteine, MMSe: monomethylselenol or methylselenol, DMSe: dimethylselenide, TMSe: trimethylselenonium ion, GS: glutathione.
그러나 세균의 경우에는 Psudomonas putida 등에서 methionine γ-lyase (EC 4.4.1.11)가 L-SeMet의 α, γ-elimination 반응을 촉매하여( Fig. 2 ), 직접적으로 CH 3 SeH, α-ketobutyrate, NH 3 를 형성하는 반응을 촉매한다 [4] .
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Methionine γ-lyase catalyzes the conversion of L-SeMet into methylselenol, α-ketobutyrate and ammonia.
따라서 포유동물도 세균 유래의 methionine γ-lyase처럼 L-SeMet의 α, γ-elimination 반응을 촉매하는 신규효소가 있을 가능성을 배제할 수 없다. 최근 쥐에게 L-SeMet을 투여한 후 대사물을 관찰하기 위해 L-SeCys을 형성하는 대사를 특이적으로 저해시킨 상태에서, 대사산물의 생성동태를 검토한 보고가 있었다 [19] . 그들은 쥐의 간에서 L-SeMet의 α, γ-elimination 반응을 촉매하는 미지의 효소를 극소량 정제하여 질량분석법에 의해 동정한 바, cystathionine γ-lyase(EC 4.4.1.1)라는 결론을 얻었다. 즉 쥐의 cystathionine γ-lyase (mouse CGL)가 L-SeMet에서 CH 3 SeH을 생성한다는 것이다. 이는 mouse CGL이 L-SeMet 대사에 직접 작용하여 L-SeMet의 독성을 제거하며 전체적인 Se 대사에 중심적 역할을 한다는 것이다 [20] . 이 결론의 근거는 다음과 같다. 첫째 쥐의 간세포에서 처음으로 CH 3 SeH을 검출하였다. 둘째 mouse CGL의 저해제인 DL-propaglyglycine (PPG)의 존재 하에서 L-SeMet 대사가 저해 받았으며, 셋째 Se을 함유한 효소인 cGPx의 mRNA와 단백질 생성 양이 PPG 투여시 현격하게 저하한 점이다. 하지만 이 연구에서 정제에 성공한 mouse CGL 양은 0.29 mg 정도의 매우 소량이어서 정제한 효소를 이용하여 직접적인 CH 3 SeH의 검출에는 성공하지 못하였고 단지 MALDI-TOF MS/MS 스펙트럼 분석에 의한 결론이었다 [18] . 따라서 본 연구에서는 인간의 효소 cystathionine γ-lyase (human CGL)를 이용하여 정말 human CGL이 L-SeMet의 α, γ-elimination 반응을 촉매하여 LSeMet에서 직접적으로 CH 3 SeH를 형성하는 가를 검증하고 human CGL의 다양한 기능에 대하여 알아보고자 한다.
재료 및 방법
- 실험재료
Kanamycin, isopropyl β-D-1-thiogalgctopyranoside (IPTG), L-SeMet, 5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), 3-methyl-2-benzothiazolone hydrazine (MBTH)는 Nacalai tesque (Japan)에서, dimethyldiselenide, 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene, DL-propagylglycine, hydroxylamine, α-ketobutylic acid, β-mercaptoethanol, pyridoxal 5' phosphate (PLP)는 Sigma (USA)에서, tobacco etch virus (TEV) kit는 Invitrogen (USA)에서, His bind column resin은 Novagen (Germany)에서 각각 구입하여 사용하였다. 균의 파쇄는 Fisher Scientific (Korea)의 ultrasonic dismembrator를, UVvisible 흡수 스펙트럼은 Agilent 8453 (Agilent Technologies, USA)를 사용하였고 측정 중 큐벳 홀더를 일정 온도로 유지할 수 있는 Peltier 시스템을 사용하였다. GC/MS 분석은 Autosystem (XL) gas chromatograph와 TurboMass mass spectrometer (PerkinElmer, USA)를 사용하여 수행하였고, CG capillary column은 ULBON HR-1 (25 m × 0.25 mm inside diameter, Shinwa Chemical Industries Ltd, Japan)을 사용하였다.
- Human CGL의 발현과 정제
E.coli BL21 (DE3)을 cloning의 숙주세포로 사용하였다. Human CGL 유전자는 TEV 단백질 분해효소로 제거가 가능한 N-말단 His tag를 포함하고, T7 promoter와 lac operator, kanamycin 내성유전자로 연결된 pNIC-28-BsaI을 스웨덴 그룹(Dr. Sivaraman)에서 받아 사용하였다 [25] . E.coli BL21의 형질 전환은 CaCl 2 방법으로 만든 competent cell을 이용하였으며, 선별된 유전자 재조합 형질전환체는 kanamycin (50 ug/ml)이 포함된 potassium phosphate-buffered Terrific Broth medium (TB)에서 OD 600 nm 의 값이 2.0이 될 때까지 37°C에서 성장시켰고, 이후 18°C 환경에서 0.5 mM IPTG를 첨가하여 human CGL의 발현을 유도하였다. 집균은 20시간 후 원심분리기를 이용하여 8,000 rpm (10,000 × g)에서 20분간 원심분리 하고, 0.85% NaCl로 현탁하여 균체를 세척하고 다시 원심분리를 하였다 [12] .
Human CGL의 정제는 보고된 방법으로 하였다 [12] . 간단히 설명하면, human CGL을 과발현 시킨 균체는 lysis buffer (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 10 mM imidazole, 0.5 mM tris (2-carboxyethyl)phosphine (TCEP), EDTAfree protease inhibitor, 20 μM PLP, pH 7.9)에 현탁하고, 30분간(pulse: 5min on, 1min off) 초음파 분쇄(80% amplitude)를 하였고, 20분간 8,000 rpm에서 원심분리하여 crude extract를 제조하였다. His-TEV-human CGL의 정제는 Hi-Trap chelating nickel column (Novagen, Germany)을 이용하여 활성분획을 얻었다. 활성분획은 CGL이 β-mercaptoethanol과 L-cysteine을 기질로 한 반응에서 H 2 S를 생성하는 반응을 이용하여 형성된 황화수소를 lead acetate와 반응시켜 생성된 lead sulfide (PbS) 침전을 UV-visible 분광광도계의 390 nm에서의 흡광도를 측정하였다 [12] . 활성분획은 centricon tube (Millipore, 30 kDa molecular weight cut-off)를 이용하여 농축한 후, TEV protease의 활성 buffer [50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, 1mM 1,4-Dithiothreitol (DTT), 20 μM PLP]로 희석과 농축을 3회 반복하여 탈염 및 buffer 교환을 하였다. 그리고 TEV protease (Invitrogen, USA)를 첨가하여 21°C에서 4시간 반응시킨 후, Hi-Trap chelating nickel column을 이용하여 N-말단의 히스티딘 잔기가 제거된 순수한 human CGL을 얻었다. 정제된 효소의 보효소 PLP 함량은 보고된 방법으로 측정하여 1 mol의 PLP가 한개의 subunit에 포함되어 있음을 확인하였고 [1] 정제효소의 순도는 SDS-PAGE, western blot, UV-visible spectrum으로 확인하였다 [12] .
- Human CGL 효소 반응시료 준비
효소반응은 10 mM L-SeMet가 포함된 활성측정 buffer (0.1 M KPB, 20 uM PLP, pH 7.9) 300 ul에 150 ug의 human CGL을 첨가하여 37°C에서 1시간 반응시킨 후 HCl 150 ul (12 N)을 첨가하고 argon gas를 10분간 bubbling 하면서 표준 시료와 동일한 방법으로 효소반응에 의해 생성된 methylselenol을 포집하였다. 생성된 methylselenol이 효소반응에 의한 것인지를 확인하기 위하여 반응액에 효소를 첨가하지 않은 시료와 효소를 100°C에서 10분간 열처리한 후의 효소를 사용하였다. 또한 반응액에 기질을 첨가하지 않은 시료도 이용하였는데 이는 생성물이 기질로부터 생성되었는 지를 확인하기 위함이었다. 그리고 CGL의 보효소인 PLP와 결합하여 활성을 특이적으로 억제하는 hydroxylamine을 첨가한 시료와 CGL의 특이적 저해제인 DL-propargylglycine를 전처리한 시료도 대조군으로 사용하여, 반응물을 생성하는 효소가 CGL에 의함을 확인하고자 했다.
- L-SeMet을 기질로 이용한 human CGL 효소 반응액의 GC/MS 분석
Human CGL의 α, γ-elimination 반응에 의해 L-SeMet로 부터 생성되는 methylselenol (CH 3 SeH)은 GC/MS를 이용하여 분석하였다. 기준 methylselenol 시료의 준비는 보고된 방법을 사용하였다 [20] . 간단히 설명하면 dimethyldiselenide를 sodium tetrahydroborate로 환원하여 제조하였다. 100 ul ethanol에 10 ul (50 umol)의 dimethyldiselenide가 녹아 있는 vial에 ethanol 100 ul에 녹인 0.18 g의 sodium tetrahydroborate를 천천히 첨가하여 5분간 반응시키고, argon gas로 충분히 bubbling 시킨 효소활성 측정 buffer 200 ul에 신속하게 첨가하였다. 이어 200 ul (12 N)의 HCl을 첨가한 후 10분간 argon gas로 bubbling 하면서 생성된 gas를 methylselenol 포집 혼합용액 (50 mM 1-fluoro-2, 4-dinitrobenzene, 83mM NaHCO3 in 63% dimetylfomamid:34% water)으로 이동시켰다. 포집 혼합용액에 생성된 안정한 dinitrophenyl selenoether를 benzene으로 추출하여 기준 시료로 사용하였다. Human CGL 반응물의 조제 부분에서 언급한대로 전 처리를 거친 대조군 시료들과 실험군 시료를 이용하여 동일한 조건에서 실험을 하였다. GC/MS의 분석조건은 injector의 온도를 260°C로 하였고, oven 온도는 최초 50°C에서 2분간 유지, 15°C/min으로 300°C로 상승시킨 후 11분간 유지하였다. Detector는 EI mode에서 70 eV의 에너지로 이온화 하였고 TIC의 SCAN mode에서 검출이온 질량범위를 50-300으로 설정하여 각 질량스펙트럼을 확인하였다.
- L-Methionine과 L-SeMet의 α, γ-elimination 활성측정
L-methionine과 L-SeMet의 α, γ-elimination 등은 기존의 방법을 사용하였다 [12] . 즉 두 기질로부터 생성되는 α-ketobutyrate를 MBTH (3-methyl-2-benzothiazolone-hydrazone) 측정방법을 통해 확인하였다. 효소반응은 0.1 M KPB (pH 8.0)에 20 μM PLP와 기질인 L-methionine과 L-SeMet의 농도(0, 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 mM)를 변화시켜 첨가한 혼합액에 각각 7 μg의 효소를 가하여 37°C에서 5분간 반응시켰고, 5% TCA를 첨가하여 반응을 종결시키고, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 상층액을 취하였다. 반응액을 MBTH용액과 50°C에서 40분간 반응시킨 후 시료의 안정화를 위하여 25°C에서 30분간 방치하였다. MBTH 반응액은 UV-visible 흡수 스펙트럼을 이용하여 324 nm에서의 흡광도로 생성된 α-ketobutyrate의 농도를 측정하여 기질 농도에 따른 최고 반응속도( Vmax )와 Km 값을 측정하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복 시행되었으며, 효소반응의 fitting과 회귀분석은 컴퓨터 소프트웨어인 KaleidaGraph를 이용하였다.
결과 및 고찰
- Human CGL 단백질의 발현과 정제
1.5 L TB 배지(50 ug/ml kanamycun 포함)에 형질전환 된 BL21을 배양하여, 14.2 g의 균을 얻었고, 초음파 분쇄 후 원심분리하여 100 ml (9.8 mg/ml)의 crude extract를 얻었다. 표적 단백질인 human CGL은 N-말단에 hexahistidine을 포함하고 있어 nickel과 강한 친화성을 갖게 된다. 균의 crude extract를 흡착시킨 nickel chelating column에 고농도의 imidazole (1 M)를 흘려주어 68.8 mg의 단백질을 용출하였고, 이 분획을 TEV protease 처리 후 다시 nickel chelating column chromatography를 수행하여 human CGL에서 분리된 hexahistidine을 제거하였다. Hexahistidine이 제거된 단백질은 nickel과의 친화성이 낮아져 세척단계인, 낮은 농도의 imidazole (60 mM)에 의해 용출되고, 총 14.45 mg의 human CGL 단백질을 얻었다. 각 단계의 시료를 이용하여 SDS-PAGE를 수행한 결과 첫 번째 chromatography 수행 이후의 시료에서 47 kDa 정도의 단일 띠를 관찰할 수 있었고, hexahistidine 제거 후 44 kDa 정도로 기존 문헌과 일치하는 크기의 띠를 관찰할 수 있었다 [12] . 또한 SDS-PAGE에서 polyvinylidene fluoride (PVDF) 막으로 옮겨진 단백질들을 human CGL과 특이한 결합을 하는 항체로 처리하고 발색시킨 결과 형질전환된 균에서 human CGL이 과발현 되었고, nickel chelating column chromatography를 통해 human CGL이 순수하게 정제됨을 확인할 수 있었다 [12] . 정제된 단백질의 UV-visible 흡수 스펙트럼 측정에서 단백질내의 tyrosine과 tryptophan에 의한 280 nm에서의 흡광과 단백질과 PLP 간의 Schiff base 결합으로 인한 427 nm에서의 흡광의 비가 5.5:1 정도로 관찰되었고, 다른 UV-visible 흡광이 관찰되지 않았다. 이는 보고된 자료의 280 nm/427 nm 흡광계수와 유사한 값이다 [12] . 따라서 정제 된 단백질과 PLP간의 Schiff base 결합하고 있음을 의미하고, 순수하게 정제되었음을 나타낸다.
- Methylselenol의 GC/MS 분석
CH 3 SeH는 불안정하므로 CH 3 SeH의 유도체를 준비하여 authentic 물질로 이용하였다( Fig. 3 ). 분석결과 14.6 min에서 단일 GC peak가 관찰되었고, MS 분석을 통하여 dinitrophenyl selenoether로 확인하였고, 이를 기준 물질로 사용하였다( Fig. 4A ). 기질 L-SeMet의 human CGL 효소반응 생성물은 기준 물질과 동일하게 유도체화 하여 GC/MS로 분석하였다( Fig. 4B ).
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Procedure for the preparation of dinitrophenyl selenoether.
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GC/MS analysis. (A) Authentic dinitrophenyl selenoether, (B) enzymatic product of human cystathionine γ-lyase (human CGL). Sample 1; reaction mixture with human CGL and L-SeMet., Samples 2; reaction mixture without human CGL, sample 3; reaction mixture without L-SeMet, sample 4; reaction mixture with preheated human CGL at 100°C for 10 min before incubation, sample 5; reaction mixture with preincubated human CGL with hydroxylamine, sample 6; reaction mixture with preincubated human CGL with DL-propargylglycine.
기준물질과 동일한 시간에서 GC peak가 관찰되었고, MS 분석결과 dinitrophenyl selenoether로 확인되었다( Fig. 4B , sample 1). 또한 효소를 첨가하지 않은 시료와 기질인 L-SeMet를 첨가하지 않은 시료 그리고 효소를 100°C에서 10분간 전 처리 한 시료들을 이용한 동일 실험에서는 dinitrophenyl selenoether의 peak가 관찰되지 않았다( Fig. 4B , sample 2~4). 이와 같은 대조군 실험을 통하여 실험군에서 GC/MS로 분석된 dinitrophenyl selenoether의 전구체인 methylselenol은 L-SeMet로부터 물리적 또는 화학적인 반응에 의해 생성된 것이 아니라, human CGL의 효소반응에 의해서 생성된 것으로 확인하였다. 또한 human CGL은 PLP를 보효소로 사용하는 효소이므로, PLP와 결합하여 PLP 의존 효소만을 특이적으로 억제하는 hydroxylamine을 전 처리한 시료도 대조군으로 준비하였다. 결과 GC/MS 분석에서 dinitrophenyl selenoether가 검출되지 않았다( Fig. 4B , sample 5). 이는 methylselenol이 PLP 의존 효소에 의해 생성된 것을 의미하고, human CGL에서 PLP의 제거에 의해 human CGL이 촉매하는 여러 반응처럼 methylselenol의 형성 활성도 억제됨을 확인할 수 있었다. 또한 DL-propargylglycine은 human CGL의 활성자리에 있는 tyrosine 114 잔기의 hydroxyl group과 공유 결합하여, vinyl ether를 형성하고, 활성자리 주변 아미노산 잔기 (aspartic acid 161 , lysine 212 , serine 340 , arginine 375 )들과 수소결합을 형성함에 의하여 활성자리의 3차 구조의 변형을 유발함으로써 활성을 억제한다 [25] . 이렇게 human CGL에 대한 특이성 억제제인 DL-propargylglycine을 전 처리한 시료에서도 역시 dinitrophenyl selenoether는 검출되지 않았다( Fig. 4B , sample 6). 이러한 결과는 기존에 보고된 여러 효소가 관여하는 transmethylation 대사 경로가 아닌 human CGL의 α, γ-elimination 반응을 통하여 직접적으로 CH 3 SeH을 형성하는 반응을 촉매할 수 있음을 처음으로 확인하였다( Fig. 5 ). 이와 같이 독성물질인 L-SeMet을 신속한 분해할 수 있고, 항암력을 갖는 methylselenol을 직접 생성할 수 있는 human CGL의 능력은 생화학적 또는 의약적으로 다양한 응용이 가능할 것으로 판단된다.
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Metabolic pathway of L-SeMet in human. L-SeMet is enzymatically converted to seleno-L-cysteine through a pathway similar to L-methionine. And human Cystathionine γ-lyase is confirmed to catalyze the direct metabolism of L-SeMet into methylselenol (CH3SeH). Human CGL reactions were represented by the asterisk symbol ‘*’.
- Human CGL의 kinetic 분석
정제된 human CGL (10 ug)의 셀레늄을 포함한 아미노산인 L-methionine과 L-SeMet에 대한 농도에 따른 활성변화를 측정하고, Lineweaver-Burk plots에 의해 Michaelis constant ( Km )와 최대 반응속도( Vmax )를 구하고, Kcat 값과 Kcat/Km 값을 계산하여 비교하였다( Table 1 ). 기질에 따른 Km 은 L-methionine이 0.32 mM, L-SeMet가 2.82 mM이었다. 즉 human CGL은 L-SeMet에 대하여 L-methionine보다 약 9배 높은 값을 보이는데 이는 L-SeMet의 비교적 낮은 기질 친화력에 기인한다고 생각된다. 그러나 최대 반응속도( Vmax )에서는 L-methionine보다 L-SeMet가 70배 정도 높게 측정되었는데 methionine의 Kcat 는 0.002/sec로 거의 반응이 진행되지 않는 정도였다. 그리고 전체적인 활성 효율( Kcat/Km )은 L-methionine이 0.006, L-SeMet이 0.05이었다. 즉 실험결과는 human CGL은 실질적으로 methionine은 기질로 사용하지 않다고 보인다. 이는 보고된 mouse CGL의 L-SeMet에 대한 Km 값이 15.5 mM, Vmax 값이 0.29, Kcat/Km 값이 0.02인 것을 비교하면 [20] 효소 효율(catalytic efficiency)면에서는 mouse CGL과 human CGL의 활성이 비슷함을 알 수 있다. 그리고 미생물 유래의 methionine γ-lyase가 methionine과 L-SeMet 모두를 기질로 하여 α, γ-elimination 반응을 촉매하는 것에 비해 human CGL은 L-SeMet 만 기질로 사용하는 점이 다르다 [4] . 또한 human CGL이 L-SeMet의 분해를 담당하고 있음이 밝혀졌으므로 이 효소의 부재로 인하여 발생하는 유전병인 cystathioninuria 환자 [21] 의 경우는 L-SeMet에서 CH 3 SeH의 생성이 억제됨을 상상할 수 있다. 즉 영양소로서 섭취한 L-SeMet의 대사가 억제되어 L-SeMet의 이용과 배출에 심각한 영향을 줄 수 있다고 사료된다. 본 효소는 L-SeMet과 methionine을 엄격하게 구분하여 L-SeMet의 과량투여에 대한 해독작용을 담당하는 생리학적으로 중요한 역할을 하리라 생각된다.
Comparison of kinetic parameters of human CGL using L-methionine and L-SeMet as substrates.
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Comparison of kinetic parameters of human CGL using L-methionine and L-SeMet as substrates.
Acknowledgements
This work was supported by Research Fund, Kumoh National Institute of Technology.
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