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Resveratrol Suppresses CD4+ T Cell Activation and Differentiation in vitro
Resveratrol Suppresses CD4+ T Cell Activation and Differentiation in vitro
Korean Journal of Plant Resources. 2014. Sep, 27(5): 567-575
Copyright © 2014, The Plant Resources Society of Korea
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
  • Received : September 09, 2014
  • Accepted : October 10, 2014
  • Published : September 28, 2014
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동원 서
영주 이
상명 이
leesangm@jbnu.ac.kr
Abstract
Resveratrol은 천연 stilbene으로 안전성 있는 항염증 활성을 가진 화합물로 알려져 있다. 최근의 연구들에서 resveratrol이 천식, 만성 대장염, 류마티스성 관절염과 같이 염증에 의해 발생하는 다양한 질병을 억제한다고 보고되었다. 이러한 연구들은 resveratrol이 CD4 + helper T cells (Th cells)에 의한 면역반응을 조절할 것이라고 제시하였다. 그러나 resveratrol이 직접적으로 Th cells의 활성화와 분화를 조절하는지 완전히 밝혀지지 않았다. C57BL/6에서 Th cells을 분리하여 다양한 농도의 resveratrol을 세포에 처리하였다. 본 연구에서는 resveratrol이 직접적으로 Th cells의 활성화와 증식을 억제하는 것을 확인하였다. Th cells에 resveratrol을 처리하였을 때 IFN-γ, IL-4, IL-17 사이토카인 생성이 농도에 따라 유의하게 감소하였고 또한 Th cells이 이러한 사이토카인들을 분비하는 Th1과 Th2과 Th17으로 분화되는 것이 억제되었다. 그리고 고농도의 resveratrol이 Th cells의 세포사멸을 유도하는 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 resveratrol이 Th cells의 활성화와 분화를 직접적으로 억제하는 것을 확인하였으며, 이는 resveratrol이 CD4 + Thcells에 의해 발생되는 자가면역질환의 효과적인 치료법이 될 수 있을 것이라고 제시한다.
Keywords
서 언
적포도에 다량 존재하는 resveratrol (3,5,4’-trihydroxystilbene) 은 1940년 중국 박새( Veratrum grandiflorum O. Lose) 에서 처음 발견되었으며, 1963년 중국과 일본에서 전통약재로 이용되는 중국 호장( Polygonum cuspidatum )에서 발견되었다(Takaoka, 1940; Nonomura et al ., 1963). 1997년 적포도주의 심장 보호 효과가 밝혀지기 전까지 resveratrol에 대한 관심은 적었으나, 그 이후로 스트레스에 대한 저항력 증가, 수명 연장뿐만 아니라 암, 심혈관질환, 허혈성 부상과 같은 질병의 예방과 진행속도 완화에 도움이 된다는 연구들이 보고 되었다(Jang et al ., 1997; Sinha et al ., 2002; Wang et al ., 2002; Howitz et al ., 2003; Bradamante et al ., 2004). 또한 resveratrol은 지질단백질대사, 에이코사노이드(eicosanoid) 합성, 지방산화, 혈소판 응집 등에 효과가 있으며, nitric oxide 합성 효소를 저해하고 아라키돈산 대사를 억제한다고 보고된 바 있다(Frankel et al ., 1993; Pace-Asciak et al ., 1995; Chan et al ., 2000; Moreno, 2000). Resveratrol이 히스톤 디아세틸화(histone deacetylase) 효소인 Sirt1을 활성화시킨다고 밝혀지면서 resveratrol에 대한 관심은 더욱 고조되었다(Borra et al ., 2005; Kaeberlein et al ., 2005). Sirt1은 염증반응, 세포 노화, 세포 증식 및 사멸, 세포분화, 대사, 세포 전분화능, 세포 주기 조절 등 생리병리학적 과정을 조절한다(Leibiger and Berggren, 2006; Chung et al ., 2010; Donmez and Guarente, 2010). 그러므로 resveratrol이 Sirt1의 활성화를 통해 다양한 질병을 예방 또는 치료 효능을 보일 것으로 기대하고 있다.
면역은 외부로부터 들어오는 병원체로부터 우리의 몸을 방어하고 무해한 환경물질에 대한 과도한 반응을 억제하기 위해 굉장히 복잡한 기전을 통해 조절되고 있다. 대식세포(macrophages)는 다량의 염증성 사이토카인(cytokine)을 생성함으로써 다양한 염증성 질환에서의 염증반응을 개시하고 증폭시켜 선천성 면역반응에서 중추적인 역할을 한다(Ariel et al ., 2012). Resveratrol 이 대식세포 활성화에 의한 과도한 염증반응을 여러 신호전달체계를 차단시킴으로써 완화시킨다는 연구들이 발표되었다(Tsai et al ., 1999; Zhong et al ., 1999; Leiro et al ., 2004; Qureshi et al ., 2012). 최근 논문에서 Walker et al . (2014) 은 resveratrol 뿐만 아니라 resveratrol 대사산물도 대장균 유래 lipopolysaccharide (LPS)에 의한 염증성 작용을 억제하여 IL-6와 TNF-α생성을 감소시킨다고 보고하였다(Walker et al ., 2014). 후천성 면역반응에 관여하는 CD4 + helper T cell (Th cells)은 다양한 종류의 사이토카인을 분비하여 다른 면역세포의 활성화, 증식, 분화를 조절함으로써 항원 특이적 면역반응에 중심적인 역할을 수행한다. 이러한 Th cells의 활성에 문제가 생기면 감염에 대해 취약해질 뿐만 아니라 암 발생, 알레르기(allergy), 자가면역질환 등의 원인이 된다(Hirahara et al ., 2013). Resveratrol이 천식, 만성 결장염, 류마티스성 관절염, 제1형 당뇨병 등의 자가면역질환에서 CD4 + Th cells의 활성을 억제한다는 논문들이 발표 되었다(Lee et al ., 2009; Youn et al ., 2009; Abdallah and Ismael 2011; Aich et al ., 2012; Xuzhu et al ., 2012; Chen et al ., 2014). 이러한 결과들은 resveratrol이 CD4 + Th cells 매개 면역반응을 조절할 수 있음을 시사한다. 따라서 본 연구에서는 resveratrol이 직접적으로 CD4 + Th cells의 활성화와 분화를 조절하는지를 마우스에서 분리한 CD4 + Th cells을 이용하여 평가하였다.
재료 및 방법
- 실험동물
생후 8-10주령의 C57BL/6 마우스를 (주)샘타코(오산, 경기도)로부터 구입하여 시험에 사용하였다. 마우스는 환기 시설이 갖춰지고 실내온도 25 ± 1℃, 상대습도 40 ± 5%, 명암조건 12 h/day가 유지되는 실험동물사에서 고형사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 사육되었다. 모든 실험동물은 동물보호법 13조 및 전북대학교 동물실험 윤리위원회 규정에 따라 관리하였다(CBU 2013-0043).
Resveratrol 처리
Resveratrol (Sigma, St. Louis, MO, USA)은 dimethyl sulfoxid (DMSO, Sigma)에 녹여 최종 농도 1 M로 제조하여 −20℃에서 보관하였으며, RPMI 배지로 희석하여 세포에 처리하였다.
- CD4+Th cells 준비
마우스의 림프절과 비장에서 채취한 단일 세포들로부터 Dynabeads FlowComp mouse CD4 + T cell isolation kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 CD4 + Th cell을 분리하였다. 채취한 림프구 5 × 10 7 개를 25 ㎕의 mouse CD4 antibody와 10분간 반응시킨 후 75 ㎕의 Dynadead와 15분간 반응시킨다. 자석을 이용하여 Dynabead와 결합하지 않은 CD4 세포를 제거한 후 release buffer를 이용하여 CD4 + T 세포에 부착된 Dynabead를 제거한다. CD4 + T 세포 순도(purity)는 약 90-95%로 유세포분석기(Accuri, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 측정하였다.
- CD4+Th cells 증식 측정
CD4 + Th cells의 증식을 측정하기 위하여 [ 3 H] thymidine incorporation test를 실시하였다. 96 well plate에 세포를 5 × 10 5 cells/well로 넣어주고 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 20 ng/㎖; Sigma, St Louis, MO, USA)과 ionomycin (ION, 500 ng/㎖, Sigma)으로 72시간 자극하였다. 배양 종료 6시간 전에 각 well에 4 µCi의 [ 3 H] thymidine을 넣어주었다. Cell harvester로 세포를 모은 후 incorporation 된 [ 3 H] thymidine을 scintillation counter (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA, USA)로 측정하였다. CD4 + Th cells의 증식을 아래의 방법으로 anti-CD3 antibody (eBioscience, San Diego, CA, USA)와 anti-CD28 antibody (eBiosicence)을 이용해 유도한 후 [ 3 H] thymidine incorporation test를 수행하였다. 또한 CD4 + Th cells의 분열을 측정하기 위하여 Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Easter (CFSE, eBiosicence) 희석법에 의해 분석하였다. CD4 + Th cells은 CFSE로 제조회사 방법에 따라 염색되었다. 96 well plate에 anti-CD3 antibody를 1 ㎕/㎖ 농도로 Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)에 희석하여 16시간 동안 코팅한 후, CFSE로 염색된 CD4 + Th cells을 5 × 10 5 cells/well로 넣어주고 anti-CD28 antibody를 3 ㎕/㎖ 농도로 첨가하여 72시간 동안 배양하였다(37℃, 5% CO 2 ). 배양 후 세포 증식은 유세포 분석기(BD Biosciences)로 측정되었다.
- 세포 내 사이토카인 (intracellular cytokine) 측정
CD4 + Th cells을 anti-CD3 antibody와 anti-CD28 antibody가 있는 48-well plate에 1 × 10 6 cells/well 농도로 48시간 동안 배양하고, 세포 내 사이토카인 측정을 위하여 단백질 수송 억제제가 포함된 cell stimulation cocktail (eBioscience)을 4시간 동안 처리하였다. 그 후 세포는 4% paraformaldehyde solution 으로 고정하고, 1×permeabilization solution (eBioscience)을 처리하였다. Fluorochrome이 결합된 사이토카인 특이적인 항체로 세포를 염색한 뒤, 유세포분석기(Accuri, BD Biosciences)로 측정되었다.
- Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
세포 외로 분비된 사이토카인 측정을 위하여 세포배양액에서의 IL-2, IL-4, IL-17, IFN-γ (eBioscience)를 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 사이토카인에 특이적으로 결합하는 capture antibody를 coating한 96 well plate에 assay diluent를 이용하여 blocking한다. 세포배양액 시료를 처리한 후 실온에서 2시간 반응시킨다. 시료를 제거하고 well plate를 washing buffer (0.05% Tween20 in PBS)로 세척해준다. Detection antibody를 처리한 후 실온에서 1시간 반응시킨 후 세척한다. Peroxidase가 결합된 avidin이 detection antibody와 결합할 수 있게 30분간 암조건에서 반응시킨다. 세척 후 peroxidase의 기질용액인 TMB substrate를 넣어 암조건에서 반응을 유도하였으며 1 N의 황산용액을 이용하여 반응을 정지시켰다. 반응액의 흡광도는 microplate reader (Polarstar Optima plate reader, BMG Labtech, Melbourne, Austria)을 이용하여 450 ㎚에서 측정한 후 사이토카인의 농도를 kit 내 표준용액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
- Annexin V 염색에 의한 세포사멸 측정
CD4 + Th cells에 resveratrol을 처리한 다음 72시간 후 세포를 회수하여 500 × g 에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 세포는 Annexin V apoptosis detection kit (eBioscience)를 사용하여 제조회사의 방법에 따라 apoptosis를 측정하였다. Resveratrol이 처리된 세포를 1 × binding buffer에 1 × 10 6 cells/㎖로 준비한 후 fluorochrome-conjugated Annexin V와 15분간 실온에서 반응시킨다. Binding buffer를 이용하여 세척한 후 Propidium Iodide Staining Solution을 처리하여 염색한다. 유세포분석기를 이용하여 분석한다.
- 통계분석
본 실험의 결과는 mean ± SEM으로 나타내었고, 각 군간의 통계적 유의성은 Graphpad Prism 통계 프로그램(Graphpad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 이용하여 분산분석(one-way ANOVA)을 하였으며, 사후 검정을 위해 Duncan test를 실시하였다. P<0.05 범위에서 유의차를 인정하였다.
결 과
- Resveratrol에 의한 CD4+T cells 증식 억제
생쥐의 비장에서 분리한 CD4 + T cells에 PMA/ION으로 자극하면서 동시에 resveratrol을 다양한 농도로 처리한 후 세포증식을 thymidine incorporation assay로 측정하였다( Fig. 1A ). Resveratrol을 3.125 µM농도로 처리한 경우CD4 + T cell의 증식이 증가하였으나 resveratrol의 농도가 증가함에 따라 CD4 + T cell의 증식이 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었으며 이러한 억제효과는 CD4 + T cells을 CD3와 CD28에 대한 항체로 자극시킨 경우에도 유사하게 나타났다( Fig. 1B ). CFSE로 표지한 CD4 + T cell에 12.5 µM resveratrol을 처리한 실험에서 항체CD3과 CD28에 의해 유도된 활발한 세포분열(cell division)이 resveratrol을 처리한 군에서 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. 특히, 가장 높은 농도인 50 µM에서는 세포분열이 완전히 차단되었다. 이러한 결과들은 resveratrol이 CD4 + T cells의 활성화와 증식을 직접적으로 억제한다는 것을 제시한다.
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Resveratrol suppresses CD4+ T cell proliferation. CD4+ T cells were treated with resveratrol (RES) at indicated concentrations and simultaneously stimulated with PMA/ION (A) or anti-CD3/CD28 antibodies (B) for 3 days. Proliferation was assessed by pulsing the cell culture with [3H] thymidine for the last 6 h. The data are expressed as the mean ± SEM. CFSE labeling assay. (C) CD4+ T cells were labeled with CFSE and treated with different concentrations of RES in the presence of anti-CD3/CD28 antibodies. After 3 days, CFSE dilution was evaluated by flow cytometry. Representative histograms are shown. *P < 0.05 and ***P < 0.001.
- Resveratrol에 의한 CD4+T cells 사이토카인 생성 억제
CD4 + T cells이 활성화되면 다양한 종류의 사이토카인을 생성한다. 그 중에서 IL-2는 CD4 + T cells의 성장인자로서 CD4 + T cells의 증식을 유도한다. Fig. 2A 에서 보는 바와 같이, resveratrol은 CD4 + T cells의 활성화에 의해 생성되는 IL-2를 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시켰다. 이는 앞의 세포증식 억제효과와 상호 연관된 것으로 여겨진다. 세포매개성 면역반응에 중요한 역할을 하는 IFN-γ의 생성 또한 resveratrol처리에 의해 유의하게 감소하였으며, 12.5 µM의 농도에서 처리하지 않은 군에 비해 40% 이하로 낮게 검출되었다 ( Fig. 2B ). 알레르기와 같은 과민성 면역반응에 관여하는 IL-4와 다양한 자가면역질환에서 중요한 역할을 하는 IL-17 또한 resveratrol 처리 농도가 증가함에 따라 생성이 억제되었다( Fig. 2C 2D ). Resveratrol의 농도를 12.5 µM이상 처리하였을 때 사이토카인(IL-2, IL-4, IL-17, IFN-γ) 생성이 유의적으로 억제되었다. 이로써 resveratrol이 CD4 + T cells의 활성화와 증식을 억제하고 사이토카인 생성까지 차단함을 확인하였다.
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Resveratrol suppresses cytokine production by CD4+ T cell. CD4+ T cells were treated with RES at indicated concentrations and simultaneously stimulated with anti-CD3/CD28 antibodies for 2 days. The production of cytokine in the supernatant of cell cultures were measured by ELISA. The data are representative of at least three independent experiments with similar results and are expressed as the mean ± SEM . *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
- Resveratrol에 의한 CD4+T cell 분화 억제
앞의 실험에서 resveratrol이 CD4 + T cell에 의한IFN-γ, IL-4, IL-17의 생성을 억제함이 관찰되었는데 이는 resveratrol이 CD4 + T cells의 분화를 조절할 수 있음을 시사한다. 이러한 가능성을 확인하기 위해 세포내 사이토카인 염색을 통해 Th1(IFN-γ), Th2 (IL-4), Th17 (IL-17)의 비율을 측정하였다( Fig. 3 ). Resveratrol을 처리하지 않았을 경우 13.69%의 세포가 Th1으로 분화하였으나 resveratrol의 농도가 12.5µM과 50 µM로 증가함에 따라 Th1으로의 분화가 각각 5.52%와 0.13%로 급격히 감소하였다. 이러한 현상은 Th2와 Th17으로의 분화에서도 유사하게 관찰되었다. 특히, 가장 높은 농도인 50 µM에서는 Th2세포로의 분화가 1.52%에서 0.18%, Th17으로의 분화는 0.81%에서 0.28%로 억제되었다. 즉, resveratrol이 CD4 + T cells의 활성화뿐만 아니라 Th1, Th2, Th17으로의 분화 또한 강력하게 억제하는 것으로 판단된다.
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Resveratrol suppresses CD4+ T cell differentiation. CD4+ T cells were treated with RES at indicated concentrations and simultaneously stimulated with anti-CD3/CD28 antibodies for 3 days. CD4+ T cell differentiation in to Th1, Th2 and Th17 were assessed by ICS using IFN-γ, IL4, and IL-17, respectively. Percentages of each cell population was evaluated by flow cytometry. The data are representative of at least three independent experiments with similar results.
- Resveratrol에 의한 CD4+T cells의 세포사멸 유도
마지막으로 resveratrol에 의한 CD4 + T cell의 활성화 및 분화억제가 세포사멸 (apoptosis)에 의한 것인지를 annexin V 염색방법을 이용해 평가하였다. Fig. 4 에서 보는 바와 같이 resveratrol을 3.125 µM과 12.5 µM 농도로 3일간 처리하였을 때 CD4 + T cell의 apoptosis율이 3.45%에서 4.68%와 7.55%로 약간의 증가추세를 보였으며 실험에 사용된 가장 높은 농도인 50 µM에서는 37.64%의 세포가 apoptosis에 의해 사멸하는 것으로 나타났다. 이는 CD4 + T cells에 대한 resveratrol의 억제효과가 50 µM 과 같은 높은 농도에서는 apoptosis유도에 의한 것일 수 있다는 가능성을 제시한다.
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Resveratrol induces CD4+ T cell apoptosis at a high concentration. CD4+ T cells were treated with RES at indicated concentrations and simultaneously stimulated with anti-CD3/CD28 antibodies for 3 days. Apoptosis were assessed by staining cells with Annexin V-PE and analyzed by flow cytometry. The data are representative of at least three independent experiments with similar results.
고 찰
1992년에 적포도주의 심장보호 효능이 resveratrol에 의한 것이라고 발표된 이후 수많은 연구들이 resveratrol이 다양한 질환을 예방할 수 있음을 제시하였다(Svajger and Jeras, 2012; Marchal et al ., 2013). 면역체계에 대한 효과로 일부 논문들은 resveratrol이 T cell, B cell과 macrophages의 활성화를 억제한다고 보고하였다. 하지만, resveratrol에 의한 CD4 + T cell 활성화 및 분화 조절은 잘 알려져 있지 않았다(Svajger and Jeras, 2012). 본 연구에서는 resveratrol이 CD4 + T cells의 활성화를 억제할 뿐만 아니라 Th1, Th2, Th17으로의 분화도 차단함을 밝혔다. 또한 이러한 억제효과의 일부분이 resveratrol에 의한 apoptosis 유도가 원인임을 제시하였다. 최근에 Zou et al .은 resveratrol이 Sirt1의 발현과 활성을 증가시킴으로써 CD4 + T cells활성화를 억제한다고 보고하였다(Zou et al ., 2013). 하지만, Sirt1이 resveratrol의 직접적인 표적인지는 아직 논란의 여지가 있다(Tennen et al ., 2012). 또한 Zou et al .은 resveratrol이 직접적으로 CD4 + T cells의 분화 또는 apoptosis에 어떠한 영향을 주는지는 확인하지 않았다.
본 연구 결과, resveratrol이 CD4 + T cell의 활성화와 분화를 억제함을 알 수 있었다. CD4 + T cell은 다양한 사이토카인을 분비함으로써 병원체에 대한 면역반응에서 중요한 기능을 수행한다. CD4 + T cell의 비정상정인 활성화와 분화는 류마티스성 관절염, 천식, 제1형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창 등과 같은 자가면역질환을 유발한다(Jang et al ., 1997; Hall et al ., 2009). 따라서 CD4 + T cell에 의한 비정상적인 또는 과도한 면역반응을 억제하는 것은 다양한 자가면역질환을 예방하거나 치료하는데 효과적인 전략으로 평가되고 있다(Hall et al ., 2009). CD4 + T cells은 크게 Th1, Th2, Th17, regulatory T cells (Treg)의 subclass로 나뉜다(Peck and Mellins, 2010). Th1은 IFN-γ를 주로 생성하여 세포성 면역(cellular immunity)을 통해 세포내 병원체에 대한 방어작용을 한다(Mosmann et al ., 1986). Th2는 IL-4, IL-5, IL-13을 생성하여 항체생성을 조절하고 체액성 면역(humoral immunity)을 통해 세포외 병원체에 대한 방어작용에 중요한 역할을 한다(Mosmann et al ., 1986). Th17는 염증성 사이토카인인 IL-17을 생성하고 병원체에 대한 면역반응 뿐만 아니라 자가면역질환(autoimmune diseases) 발생에 관여한다(Crome et al ., 2010). Treg은 Th1과 Th2의 증식과 사이토카인 생성을 억제하고 B cell의 항체 생성을 억제하며 자연살해세포(NK cell)의 세포독성 활성을 저해하는 등의 면역조절과 면역관용(immune tolerance)에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Sakaguchi 2005; Akbar et al ., 2007). 위에서 언급한 바와 같이 T 세포는 직·간접적으로 면역반응을 조절하는데 중심적인 역할을 수행한다. 그렇기 때문에 T 세포의 활성, 증식, 분화는 효과적인 후천성 면역 작용을 위하여 정밀하게 조절되어야 한다. 또한 CD4 + Th cells의 부적절한 활성화와 분화는 알레르기, 이식조직 거부반응(transplant rejection), 자가면역질환과 같은 질병의 유발에 관여한다(Romagnani, 1994; Asano et al ., 1996; Epstein et al ., 1998; Wu et al ., 2005). 이러한 이유로 CD4 + Th cells은 질병의 치료에 있어서 좋은 표적이 될 수 있을 것이다. 따라서 본 연구결과를 토대로 resveratrol이 앞서 언급한 다양한 질병의 예방 또는 치료에 활용가능 할 것으로 사료된다. CD4 + Th cells 활성화와 분화는 여러 신호전달체계의 활성화에 의한 유전자 발현을 통해 조절된다. 특히, NF-κB, AP-1, NFAT는 CD4 + Th cells 활성화에 필수적인 전자조절인자로 잘 알려져 있다. 이전 연구들은 NF-κB와 AP-1신호경로가 resveratrol에 의해 억제됨을 보고하였다. Ren et al . (2013)은 resveratrol이 NF-κB의 subunit인 p65의 핵내 이동을 억제하고 IkappaB kinase활성을 차단하여 NF-κB신호경로를 억제함을 증명하였다(Ren et al ., 2013). 또한 resveratrol에 의한 NF-κB와 AP-1 신호경로 억제가 이 물질의 항염증 활성과 항암활성의 주요 작용기전임을 제시하였다(Kundu and Surh, 2004; Ren et al ., 2013). 따라서, resveratrol에 의한 CD4 + Th cells 활성화와 분화억제도 NF-κB와 AP-1 신호경로의 활성화 차단에 비롯한 것일 가능성이 높지만, 추가적인 실험을 통해 이러한 상관관계를 증명할 필요가 있다.
Resveratrol은 다양한 종류의 종양세포에서 증식을 억제하고 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 것으로 알려졌다(Estrov et al ., 2003; Shimizu et al ., 2006; Rayalam et al ., 2008; Ge et al ., 2013). 특히, 종양세포에 대한 이러한 효과는 resveratrol이 우수한 항종양 물질임을 제시한다. 본 연구에서는 resveratrol이 50 µM농도에서 CD4 + Th cell의 세포사멸을 유도함을 확인하였는데, 이전의 연구들은 resveratrol이 이보다 높은 농도인 25-200 µM에서 종양세포의 세포사멸을 유도하였다고 보고 하였다. 예를 들어 resveratrol이 T cell acute lymphoblastic leukemia cell에서 Akt/mTOR경로를 억제하고 p38-MAPK기전을 활성화시켜 세포사멸을 유도함을 밝힌 논문에서는 200 µM을 적정농도로 제시하였다(Ge et al ., 2013). 또 다른 보고에서는 resveratrol이 50 µM농도에서 miR-21를 통한 BCL-2발현을 억제함으로써 췌장암세포의 사멸을 유도하였다(Liu et al ., 2013). 따라서 resveratrol은 종양세포의 종류에 따라 다양한 수준의 농도에서 세포사멸을 유도하며 이는 종양세포 특이적인 작용기전에 의한 것으로 여겨진다. 하지만, 현재까지 resveratrol이 종양세포가 아닌 CD4 + T cells에서 세포사멸을 유도하는지 그리고 어떠한 작용기전에 의한 것이지는 연구가 되어있지 않다. 본 연구에서는 resveratrol 이 CD4 + T cells의 세포사멸을 유도함을 보여 주었으며 분자생물학적 작용기전은 향후 추가적인 연구를 통하여 규명할 계획이다.
결론적으로 resveratrol이 CD4 + Th cells 활성화와 분화를 직접적으로 억제하는 활성을 보유하고 있으며 이러한 특성은 CD4 + Th cells이 주요한 역할을 하는 다양한 면역매개 질환의 예방 또는 치료에 있어 활용가능성이 있을 것으로 기대된다.
Acknowledgements
본 연구는 2013년 농촌진흥청 “신 기능성 농식품 및 부가가치 향상 기술 개발” 사업(PJ009126)과 2013년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 기초연구사업(NRF-2013R1A6A3A04063769)의 지원에 의해 이루어진 연구이며 이에 감사드립니다.
References
Abdallah D.M. , Ismael N.R. 2011 Resveratrol abrogates adhesion molecules and protects against TNBS-induced ulcerative colitis in rats Can. J. Physiol. Pharmacol. 89 811 - 818
Aich J. , Mabalirajan U. , Ahmad T. , Khanna K. , Rehman R. , Agrawal A. , Ghosh B. 2012 Resveratrol attenuates experimental allergic asthma in mice by restoring inositol polyphosphate 4 phosphatase (INPP4A) Int. Immunopharmacol. 14 438 - 443
Akbar A.N. , Vukmanovic-Stejic M. , Taams L.S. , Macallan D.C. 2007 The dynamic co-evolution of memory and regulatory CD4+ T cells in the periphery Nat. Rev. Immunol. 7 231 - 237
Ariel A. , Maridonneau-Parini I. , Rovere-Querini P. , Levine J.S. , Muhl H. 2012 Macrophages in inflammation and its resolution Front. Immunol. 3 324 -
Asano M. , Toda M. , Sakaguchi N. , Sakaguchi S. 1996 Autoimmune disease as a consequence of developmental abnormality of a T cell subpopulation J. Exp. Med. 184 387 - 396
Borra M.T. , Smith B.C. , Denu J.M. 2005 Mechanism of Human SIRT1 Activation by Resveratrol J. Biol. Chem. 280 17187 - 17195
Bradamante S. , Barenghi L. , Villa A. 2004 Cardiovascular protective effects of resveratrol Cardiovasc. Drug Rev. 22 169 - 188
Chan M.M. , Mattiacci J.A. , Hwang H.S. , Shah A. , Fong D. 2000 Synergy between ethanol and grape polyphenols, quercetin, and resveratrol, in the inhibition of the inducible nitric oxide synthase pathway Biochem. Pharmacol. 60 1539 - 1548
Chen X. , Lu J. , An M. , Ma Z. , Zong H. , Yang J. 2014 Anti-inflammatory effect of resveratrol on adjuvant arthritis rats with abnormal immunological function via the reduction of cyclooxygenase-2 and prostaglandin E2 Mol. Med. Rep. 9 2592 - 2598
Chung S. , Yao H. , Caito S. , Hwang J.W. , Arunachalam G. , Rahman I. 2010 Regulation of SIRT1 in cellular functions:role of polyphenols Arch. Biochem. Biophys. 501 79 - 90
Crome S.Q. , Wang A.Y. , Levings M.K. 2010 Translational mini-review series on Th17 cells: Function and regulation of human T helper 17 cells in health and disease Clin. Exp. Immunol. 159 109 - 119
Donmez G. , Guarente L. 2010 Aging and disease:connections to sirtuins Aging Cell 9 285 - 290
Epstein F.H. , Sayegh M.H. , Turka L.A. 1998 The role of T-cell costimulatory activation pathways in transplant rejection N. Engl. J. Med. 338 1813 - 1821
Estrov Z. , Shishodia S. , Faderl S. , Harris D. , Van Q. , Kantarjian H.M. , Talpaz M. , Aggarwal B.B. 2003 Resveratrol blocks interleukin-1beta-induced activation of the nuclear transcription factor NF-kappaB, inhibits proliferation, causes S-phase arrest, and induces apoptosis of acute myeloid leukemia cells Blood 102 987 - 995
Frankel E.N. , Waterhouse A.L. , Kinsella J.E. 1993 Inhibition of human LDL oxidation by resveratrol Lancet 341 1103 - 1104
Ge J. , Liu Y. , Li Q. , Guo X. , Gu L. , Ma Z.G. , Zhu Y.P. 2013 Resveratrol induces apoptosis and autophagy in T-cell acute lymphoblastic leukemia cells by inhibiting Akt/mTOR and activating p38-MAPK Biomed. Environ. Sci. 26 902 - 911
Hall A.M. , Vickers M.A. , Barker R.N. , Erwig L.P. 2009 Helper T cells point the way to specific immunotherapy for autoimmune disease Cardiovasc. Hematol. Disord. Drug Targets 9 159 - 166
Hirahara K. , Poholek A. , Vahedi G. , Laurence A. , Kanno Y. , Milner J.D. , O'Shea J.J. 2013 Mechanisms underlying helper T-cell plasticity: implications for immune-mediated disease J. Allergy Clin. Immunol. 131 1276 - 1287
Howitz K.T. , Bitterman K.J. , Cohen H.Y. , Lamming D.W. , Lavu S. , Wood J.G. , Zipkin R.E. , Chung P. , Kisielewski A. , Zhang L.L. , Scherer B. , Sinclair D.A. 2003 Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan Nature 425 191 - 196
Jang M. , Cai L. , Udeani G.O. , Slowing K.V. , Thomas C.F. , Beecher C.W. , Fong H.H. , Farnsworth N.R. , Kinghorn A.D. , Mehta R.G. , Moon R.C. , Pezzuto J.M. 1997 Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes Science 275 218 - 220
Kaeberlein M. , McDonagh T. , Heltweg B. , Hixon J. , Westman E.A. , Caldwell S.D. , Napper A. , Curtis R. , DiStefano P.S. , Fields S. , Bedalov A. , Kennedy B.K. 2005 Substratespecific Activation of Sirtuins by Resveratrol J. Biol. Chem. 280 17038 - 17045
Kundu J.K. , Surh Y.J. 2004 Molecular basis of chemoprevention by resveratrol: NF-kappaB and AP-1 as potential targets Mutat. Res. 555 65 - 80
Lee M. , Kim S. , Kwon O.K. , Oh S.R. , Lee H.K. , Ahn K. 2009 Anti-inflammatory and anti-asthmatic effects of resveratrol, a polyphenolic stilbene, in a mouse model of allergic asthma Int. Immunopharmacol. 9 418 - 424
Leibiger I.B. , Berggren P.O. 2006 Sirt1: a metabolic master switch that modulates lifespan Nat. Med. 12 34 - 36
Leiro J. , Alvarez E. , Arranz J.A. , Laguna R. , Uriarte E. , Orallo F. 2004 Effects of cis-resveratrol on inflammatory murine macrophages: antioxidant activity and down-regulation of inflammatory genes J. Leukoc. Biol. 75 1156 - 1165
Liu P. , Liang H. , Xia Q. , Li P. , Kong H. , Lei P. , Wang S. , Tu Z. 2013 Resveratrol induces apoptosis of pancreatic cancers cells by inhibiting miR-21 regulation of BCL-2 expression Clin. Transl. Oncol. 15 741 - 746
Marchal J. , Pifferi F. , Aujard F. 2013 Resveratrol in mammals: effects on aging biomarkers, age-related diseases, and life span Ann. N. Y. Acad. Sci. 1290 67 - 73
Moreno J.J. 2000 Resveratrol modulates arachidonic acid release, prostaglandin synthesis, and 3T6 fibroblast growth J. Pharmacol. Exp. Ther. 294 333 - 338
Mosmann T.R. , Cherwinski H. , Bond M.W. , Giedlin M.A. , Coffman R.L. 1986 Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins J. Immunol. 136 2348 - 2357
Nonomura S. , Kanagawa H. , Makimoto A. 1963 Chemical Constituents Of Polygonaceous Plants. I. Studies on the components of KO-J O-KON. (Polygonum cuspidatum SIEB. ET ZUCC.) Yakugaku Zasshi 83 988 - 990
Pace-Asciak C.R. , Hahn S. , Diamandis E.P. , Soleas G. , Goldberg D.M. 1995 The red wine phenolics trans-resveratrol and quercetin block human platelet aggregation and eicosanoid synthesis: Implications for protection against coronary heart disease Clin. Chim. Acta 235 207 - 219
Peck A. , Mellins E.D. 2010 Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example Immunology 129 147 - 153
Qureshi A.A. , Guan X.Q. , Reis J.C. , Papasian C.J. , Jabre S. , Morrison D.C. , Qureshi N. 2012 Inhibition of nitric oxide and inflammatory cytokines in LPS-stimulated murine macrophages by resveratrol, a potent proteasome inhibitor Lipids Health Dis 11 76 -
Rayalam S. , Yang J.Y. , Ambati S. , Della-Fera M.A. , Baile C.A. 2008 Resveratrol induces apoptosis and inhibits adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes Phytother Res 22 1367 - 1371
Ren Z. , Wang L. , Cui J. , Huoc Z. , Xue J. , Cui H. , Mao Q. , Yang R. 2013 Resveratrol inhibits NF-kB signaling through suppression of p65 and IkappaB kinase activities Pharmazie 68 689 - 694
Romagnani S. 1994 Regulation of the development of type 2 T-helper cells in allergy Curr. Opin. Immunol. 6 838 - 846
Sakaguchi S. 2005 Naturally arising Foxp3-expressing CD25+ CD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self Nat. Immunol. 6 345 - 352
Shimizu T. , Nakazato T. , Xian M.J. , Sagawa M. , Ikeda Y. , Kizaki M. 2006 Resveratrol induces apoptosis of human malignant B cells by activation of caspase-3 and p38 MAP kinase pathways Biochem. Pharmacol. 71 742 - 750
Sinha K. , Chaudhary G. , Gupta Y.K. 2002 Protective effect of resveratrol against oxidative stress in middle cerebral artery occlusion model of stroke in rats Life Sci 71 655 - 665
Svajger U. , Jeras M. 2012 Anti-inflammatory effects of resveratrol and its potential use in therapy of immune-mediated diseases Int. Rev. Immunol. 31 202 - 222
Takaoka M. 1940 The phenolic substances of white hellebore (Veratrum grandiflorum Loes. Fill). V. Synthesis of resveratrol (3, 5, 4-trioxystilbene) and its derivatives Nippon Kagaku Kaishi 61 1067 - 1069
Tennen R.I. , Michishita-Kioi E. , Chua K.F. 2012 Finding a target for resveratrol Cell 148 387 - 389
Tsai S.H. , Lin-Shiau S.Y. , Lin J.K. 1999 Suppression of nitric oxide synthase and the down-regulation of the activation of NFkappaB in macrophages by resveratrol Br. J. Pharmacol. 126 673 - 680
Walker J. , Schueller K. , Schaefer L.M. , Pignitter M. , Esefelder L. , Somoza V. 2014 Resveratrol and its metabolites inhibit pro-inflammatory effects of lipopolysaccharides in U-937 macrophages in plasma-representative concentrations Food Funct 5 74 - 84
Wang Q. , Xu J. , Rottinghaus G.E. , Simonyi A. , Lubahn D. , Sun G.Y. , Sun A.Y. 2002 Resveratrol protects against global cerebral ischemic injury in gerbils Brain Res 958 439 - 447
Wu S.L. , Pan C.E. , Yu L. , Meng K.W. 2005 Immunosuppression by combined use of cyclosporine and resveratrol in a rat liver transplantation model Transplant Proc 37 2354 - 2359
Xuzhu G. , Komai-Koma M. , Leung B.P. , Howe H.S. , McSharry C. , McInnes I.B. , Xu D. 2012 Resveratrol modulates murine collagen-induced arthritis by inhibiting Th17 and B-cell function Ann. Rheum. Dis. 71 129 - 135
Youn J. , Lee J.S. , Na H.K. , Kundu J.K. , Surh Y.J. 2009 Resveratrol and piceatannol inhibit iNOS expression and NF-kappaB activation in dextran sulfate sodium-induced mouse colitis Nutr. Cancer 61 847 - 854
Zhong M. , Cheng G.F. , Wang W.J. , Guo Y. , Zhu X.Y. , Zhang J.T. 1999 Inhibitory effect of resveratrol on interleukin 6 release by stimulated peritoneal macrophages of mice Phytomedicine 6 79 - 84
Zou T. , Yang Y. , Xia F. , Huang A. , Gao X. , Fang D. , Xiong S. , Zhang J. 2013 Resveratrol Inhibits CD4+ T cell activation by enhancing the expression and activity of Sirt1 PLoS One 8 e75139 -