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Physiological Characteristics of Actinomycetes Isolated from Turfgrass Rhizosphere
Physiological Characteristics of Actinomycetes Isolated from Turfgrass Rhizosphere
Weed & Turfgrass Science. 2015. Dec, 4(4): 348-359
Copyright © 2015, The Korean Society of Weed Science and The Turfgrass Society of Korea
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted noncommercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
  • Received : September 07, 2015
  • Accepted : November 02, 2015
  • Published : December 31, 2015
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Jung Han Lee
Gyu Young Min
Gyu Yul Shim
Chang Wook Jeon
Youn-Sig Kwak
kwak@gnu.ac.kr

Abstract
방선균을 대상으로 생물적 방제 균주를 선발한 결과 총 248개의 균주가 분리되었다. 분리된 균주의 셀룰로스 분해능력은 S11 균주와 S4 균주의 투명환의 크기는 약 1.2mm로 셀룰로스 분해 능력이 가장 좋은 것으로 나타났다. 키틴분해 능력을 검정한 결과 S12 균주의 투명환의 크기가 2.1mm로 가장 키틴분해 능력이 우수한 것으로 나타났다. Skim milk agar 배지를 이용하여 15개 균주의 단백질 분해능력을 검정한 결과 S2 균주가 접종된 배지의 투명환의 크기가 7.5mm로 단백질 분해 능력 가장 우수한 것으로 나타났다. Chrome azurol S agar 배지를 이용하여 병원균에 대한 중요한 항균 기작으로 알려져 있는 siderophore 생성 정도를 조사한 결과 S1 균주의 투명환의 크기가 0.6mm으로 가장 높게 나타났다. 선발된 4개 균주가 분비하는 휘발성 물질의 달라스팟과 라지패취 병원균에 대한 항균활성능력 검정한 결과 달라스팟의 경우 S8 균주가 94.8% 억제하는 것으로 나타났다. Rhizoctonia solani AG2-2균사생장에 미치는 영향은 S8 균주가 72.9%로 가장 높게 억제하였으며 다음으로 S2 균주가 62.1%로 S5 균주가 37.8%로 S12 균주가 27% 억제하는 것으로 나타났다.
Keywords
서 론
Streptomyces 는 방선균목(Actinomycetales)의 Streptomycetaceae에 속하는 그람 양성균으로 주로 토양에서 발견되는 균으로 흙냄새의 원인물질인 Geosmin이라는 중성오일을 분비하는 특징이 있다 (Gerber and Lechevalier, 1965) . 또한 많은 종류의 생리활성물질을 생성하는 것으로 보고되어있다 (Bérdy, 2005) . 미생물에서 발견되어 의학용으로 사용되는 항생물질은 대략 10,000가지 종류로 알려져 있으며 이중 75%가 방선균으로부터 생산되는 것으로 보고되어 있으며 (Datta et al., 2000) 대표적인 항생제로는 Streptomycin, Chloramphenicol 과 Tetracycline 등이 있다. 그들은 병원균으로부터 작물을 보호하기 위한 재료로도 이용되고 있다. Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia solani, Alternaria brassicola Botrytis spp. 등의 다양한 병원균에 대하여 항균활성능력이 검정되었고 방제에도 이용되고 있다(Cao et al., 2004). 이 외에도 방선균이 분비하는 이차대사산물은 살균제, 제초제 그리고 살충제의 원료로도 쓰이고 있다 (Sanglier et al., 1993) .
잔디를 재배하는데 있어 대취의 축적은 뿌리층을 약하게 하거나 건조에 대한 저항성을 감소시키고 더위나 추위에 대한 스트레스를 증가시키는 원인이 된다 (Beard, 1973 ; Turgeon et al., 1977) . 이로 인하여 골프장에서는 물리적으로 대취층을 제거하는데 많은 비용을 투입한다 (Martin and Dale, 1980) . 또한 골프장 그린에서 Streptomyces 속의 균주를 이용하여 대취를 분해하는 연구가 보고되어있다 (Chamberlain and Crawford, 2000) .
식물 내의 Chitinase는 진균의 세포벽을 분해하는 역할을 하며 병저항성과 관련이 있다고 알려져 있다 (Abeles et al., 1971 ; Boller et al., 1983 ; Kucuk and Kivanc, 2004 ; Nawani et al., 2002) . 잔디의 병은 대부분 진균에 의해 발생하며 진균의 세포벽은 chitin 등의 성분으로 이루어져 있다. 이는 Chitin을 분해하는 유용균을 선발하면 병 방제에 효과적으로 사용할 수 있음을 의미한다. Streptomyces 속 세균을 포함하여 Serratia, Klebsiella Pseudomonas 등 많은 균들이 chitinase는 생성하는 것으로 보고되어있다 (Shirai, 2006) . Streptomyces 속의 종류 중 S. clavuligerus, S. griseus, S. rimouses, S. thermoviolaceus S. thermovulgaris 는 세포 외부로 단백질 분해효소를 분비하며 항균작용을 하는 단백질을 세포외부로 분비한다고 알려져 있다 (Gupta et al., 1995 ; James et al., 1991) .
Siderophore는 분자량이 500~1,000의 저분자 물질로 펩티드성 킬레이트 물질로 알려져 있다 (Glick et al., 1999 ; Loper et al., 1999) . Siderophore를 생성하는 균은 이온영양경쟁을 통하여 병원균을 억제하는 역할을 한다고 알려져 있다. 그 예로 Phytophthora parasitica, Phythium ultimum, Fusarium oxysporum Sclerotinia sclerotiorum 등의 방제에 효과가 있다는 보고가 있다 (Buysens et al., 1996 ; Hamdan et al., 1991 ; Mc Loughlin et al., 1992 ; Seuk et al., 1988) . 세균이 생성하는 이차대사산물 중에는 휘발성 물질(volatile compound)도 포함되어 있다 (Fernando et al., 2005 ; Fravel, 2005) . Streptomyces 속 세균이 생성하는 휘발성 물질은 Alkane, Alkene, Alken, Alcohol, Ketone, Aldehyde, Acid와 Ester 등 다양한 종류들이 알려져 있으며 (Schöller et al., 2002) 이런 휘발성 물질은 병원균의 포자 발아와 균사체의 성장을 억제한다는 연구 결과가 있다 (Anitha and Rabeet, 2010 ; Du et al., 2008) .
본 연구는 잔디 재배지에서 Streptomyces 를 선발하여 생물적 방제제로 이용하기 위하여 수행하였으며, 선발된 균주의 생리적 특징인 cellulose 분해 능력, Chitinase 활성, 단백질 분해효소, siderophore의 생성과 휘발성 물질의 항균 활성능력 조사하였다.
재료 및 방법
- 균주 선발
장성 4개 지역의 20개 재배지, 진주 3개, 산청지역 4개 재배지와 남해는 2개 지역의 18개 재배지에서 각 포장 당 10개의 토양시료를 수집하였다. 수집시기는 2013년 5월 중순이며 지름 20 cm 홀커터를 이용하여 토양 10 cm 깊이까지 채취하였다. 장성, 진주 그리고 산청지역의 토양은 논토양이었으며 남해는 모래토양이었다. 방선균 분리는 Humic acid–vitamin agar (배지 조성: 1 L 기준으로 disodium phosphate 0.5 g, potassium chloride 1.71 g, magnesium sulfate 0.05 g, ferrous sulfate 0.01 g, calcium carbonate 0.02 g과 agar 15.0 g을 넣고 pH를 상온에서 7.2±0.2가 되게 제조)를 이용하는 방법 (Hayakawa and Nomura, 1987) , Bennett’s agar medium (배지 조성: 1 L 기준으로 yeast extract 1 g, beef extract 1 g, casein enzymic hydrolysate 2 g, dextrose 10 g과 agar 15 g을 넣고 pH를 상온에서 7.3±0.2가 되게 제조)을 이용하는 방법(Hirsch and Christensen, 1983), 페놀(phenol)을 전 처리하여 분리하는 방법(Hayakawa et al., 2004)과 TSA(Tryptic Soy Agar) (배지 조성: 1 L 기준으로 bacto tryptone 15 g, bacto soytone 5 g, sodium chloride 5 g과 agar 15 g을 넣고 pH를 상온에서 7.3±0.2가 되게 제조)배지에 도말하는 4가지 방법으로 실시하였다. 각 배지에서 도말한 후 27℃ 에서 7일간 배양하였으며 방선균으로 판단되는 균총을 이쑤시개로 PDK (Potato dextrose peptone Agar) (배지 조성 : 1L 기준으로 bacto peptone 10 g, PDB 10 g과 agar 15 g을 넣고 pH를 상온에서 7.3±0.2가 되게 제조)배지에 옮겨 배양하였다( Fig. 1 A). 분리된 방선균은 PDK broth에 5일간 배양한 후 배양액과 균체를 글리세롤 농도가 30%가 되게 첨가하여 −80℃에 넣어 보관하며 시험에 사용하였다.
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Method for screening of Actinomycetes isolates from turfgrass rhizosphere. A: colonies on PDK medium; B: Highthroughput screening of antifungal actinomycetes; C: Antagonism assay of the isolates.
- 항균활성 능력 검정
선발된 423 균주의 라지패취( Rhizoctonia solani ) 병원균에 대한 항균활성 능력을 검정하기 위하여 각각의 균주를 PDK 배지에 이쑤시개를 이용하여 옮긴 후 균이 충분히 활성화될 수 있게 28℃에서 4일간 배양하였다. 그 후 PDA 배지(배지 조성: 1 L 기준으로 dextrose 20 g, potato extract 4 g과 agar 15 g을 넣고 pH를 상온에서 5.6±0.2가 되게 제조)에서 배양된 Rhizoctonia 의 균사를 방선균 사이에 접종하고 2일간 배양하였다( Fig. 1 B). 항균활성 능력을 가진 균주를 1차로 선발하였으며 그 중 우수한 항균능력을 보이는 15개 균주를 2차로 선발하였다( Fig. 1 C).
- 셀룰로스(Cellulose) 분해 능력 검정
항균활성 능력 검정을 통하여 선발된 균주의 셀룰로스 분해능력을 검정하기 위하여 CMC agar 배지를 제조하였다. 제조방법 (Ariffin et al., 2006 ; Sazci et al., 1986) 은 1 L 기준으로 KH 2 PO 4 1.0 g, MgSO 4 ·7H 2 O 0.5 g, NaCl 0.5 g, FeSO 4 ·7H 2 O 0.01 g, MnSO 4 ·H 2 O 0.01 g, NH 4 NO 3 0.3 g, CMC (carboxymethyl cellulose) 10.0 g과 Agar 12 g을 첨가하고 1 M NaOH를 이용하여 pH 7로 조정하여 배양기에 분주하였다. 만들어진 CMC agar 배지에 선발된 균주를 접종하여 28℃ 에서 5일간 배양하였으며 상온에서 0.1% Congo red (Sigma, USA)로 20분간 충분히 염색한 후 1 M NaCl 용액으로 15 분간 세척하고 8℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. 셀룰로스가 분해된 균의 주변에 형성된 투명환 크기를 측정하여 분해 능력을 검정하였다.
- 키틴(Chitin) 분해 능력 검정
Chitin agar 배지에서 선발된 균주의 키틴분해 능력을 검정하기 위하여 Tanaka et al. (1999) Sandhya et al. (2004) 이 제시한 방법을 변형하여 colloidal chitin을 제조하였다. 10 g의 chitin (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan)을 염산 175 mL에 넣고 3시간 동안 천천히 저으면서 녹인 후 거름종이에 통과시켜 여과하였다. 여과액에서 염산을 제거하기 위하여 증류수 2 L를 첨가하여 흰색의 키틴을 침전시킨 후, 4℃에서 10,000 rpm 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이 후 4℃의 증류수를 첨가하면서 pH가 5.5가 될 때까지 세척과정을 반복하여 colloidal chitin 을 제조하였다. Chitin agar 배지는 1 L를 기준으로 Yeast extract 0.2 g, colloidal chitin 2 g, agar 20 g, (NH 4 ) 2 SO 4 3 g, K 2 HPO 4 3 g, MgSO 4 ·7H 2 O, 0.2 g, H 3 BO 3 5.6mg, CuSO 4 ·5H 2 O 0.4 g, ZnSO 4 ·7H 2 O 0.5mg, NaMoO 4 ·2H 2 O 1.5 mg, Fe citrate 1.0 mg과 CaCl 2 10mg을 첨가하여 pH 7.0으로 조정하고 고압 멸균한 후 페트리디쉬에 분주하여 사용하였다. 만들어진 Chitin agar 배지에 균을 접종하여 28℃에서 5일간 배양하였으며, 셀룰로스 분해 능력 검정 시험 때와 같이 0.2% Congo red (Sigma, USA)로 염색하여 키틴이 분해된 균의 주변에 형성된 투명환 크기를 측정하여 분해 능력을 검정하였다.
- 단백질(Protin) 분해 능력 검정
Skim milk agar 배지를 제작하여 단백질 분해 능력을 검 정하였다. 1 L를 기준으로 skim milk (10 g), agar (18 g), peptone (1 g), NaCl (2 g)을 첨가하여 고압 멸균한 후 페트 리디쉬에 분주하여 사용하였다 (Alnahdi, 2012) .
- Sidrophore 생성 능력 검정
미생물의 영양원 경합을 통한 항균 기작 중 하나인 siderophore 생성 여부를 확인하기 위하여 Chrome azurol S (CAS) agar 배지를 제조하였다 (Schwyn and Neilands, 1987 ; Alexander and Zuberer, 1991) . 배지의 조성은 4가지의 용액 조합하여 만든 blue dye 용액 100 ml을 Minimal media 9(M9)에 첨가하여 제조하였다. 10×M9 salt를 제조하기 위하여 800ml 증류수에 Na 2 HPO 4 ·7H 2 O 64 g, KH 2 PO 4 15 g, NaCl 2.5 g과 NH 4 Cl 5.0 g을 첨가하여 완전히 녹인 후 증류수를 첨가하여 1000ml로 맞춘 후 멸균하여 사용하였다. Blue dye 용액의 조성으로는 첫 번째 용액(solution 1)으로 CAS 60.5mg을 50 ml 3차 증류수에 녹여 제조하였으며, FeCl 3 ·6H 2 O 0.0027 g을 10 mM HCl 용액에 녹인 것을 두 번째 용액(solution 2)으로, HDTMA (Hexadecyltrimethylammonium bromide) 0.073 g을 40 ml의 3차 증류수에 녹인 것(solution 3)을 세 번째 용액으로 사용하였다. Solution 1, solution 2와 solution 3을 4:1:5로 혼합한 후 멸균하여 blue dye 용액을 제조하였다. Chrome azurol S (CAS) agar 배지 제작은 증류수 750 ml에 제조된 M9 salt 100ml을 붓고 1 M MgSO 4 2ml, 1M CaCl 2 100 μl 넣고 PIPES Piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid) 32.24 g과 Bacto agar 15 g을 첨가하여 녹인 후 멸균하였다. 상온에서 50℃까지 식힌 후 casamino acid 3 g을 27 ml의 증류수에 녹인 후 3% 8-hydroxyquinoline 이 포함된 chloroform을 이용하여 철 성분을 제거한 casamino acid 용액 30ml과 0.22 micron syringe filter (Millex GV, Millipore Corp, Bedford MA)를 이용하여 거른 20% glucose 를 10 ml를 첨가하여 M9/PIPES를 제조하였다. 제조된 M9/PIPES에 blue dye 용액 100ml을 천천히 첨가한 후 페트리디쉬에 분주하여 Chrome azurol S (CAS) agar 배지를 제작하였다. 제작된 배지에 선발된 균주를 접종하고 5일 후 균주가 생산하는 Sidrophore에 의해 배지의 푸른색이 오렌지 색으로 바뀌는 것을 관찰하여 Sidrophore 생성 능력 검정하였다.
- 선발된 균주가 분비하는 휘발성 물질(volatile compound)의 항균활성 능력 검정
선발된 균주가 분비하는 휘발성물질의 항균활성 능력 검정은 본 연구에서 개발한 방법으로 시험되었다. PDK (Potato dextrose peptone agar) 배지에 배양된 균주의 균총 10개를 loop를 이용하여 1 ml 멸균수에 옮겨 vortex 하여 혼탁하였다. 희석된 균 혼탁액 50 μl를 PDK 배지에 접종하고 도말하여 28℃에서 7일간 배양하였다. 휘발성물질 처리방법은 2.7 L 플라스틱 컨테이너에 각각의 균주가 배양된 배지의 페트리디쉬 뚜껑을 열고 10개씩 나누어 넣었다. 다음으로 잔디 병원균인 Sclerotinia homoeocarpa Rhizoctonia Solani AG2-2를 5 mm 코르크보어로 뚫어 PDK배지에 치상하고 페트리디쉬 뚜껑을 열고 플라스틱 컨테이너에 넣어 휘발성물질이 병원균에 접촉되게 하였다. S. homoeocarpa 는 4일 후, R. solani 는 5일 후 균사 억제 정도를 조사하였다. 대조구로는 PDK배지를 사용하였으며 반복수는 10반복이었다.
- 통계분석
본 연구에서 균주가 분비하는 휘발성 물질의 항균활성 및 효소활성 시험은 SAS (SAS Institute, Inc., 1989, Cary, NC) program을 이용하여 ANOVA 분석을 하였으며, 처리간의 비교를 위하여 Turkey’s test (p=0.05)를 실시하였다.
결과 및 고찰
- 균주 선발
방선균을 대상으로 생물적 방제 후보균주를 선발한 결과 장성 지역에서 228개 균주를 분리되었고 진주지역 33개 균주가 분리되었으며 남해 지역에서는 185개 균주가 분리되었다. 균주는 Humic acid–vitamin agar 배지에서 총 127개 균주, Bennett’s agar 배지에서 107개 균주, 페놀(phenol)을 전 처리하여 분리하는 방법을 사용하여 14개 균주, Tryptic Soy Agar 배지에서는 195개 균주가 분리되었다(Table 2)
List of actinomycetes isolates from turfgrass rhizosphere.
Location Fields Isolate

Jangseong Region 1 (JSR1) JSR1A 1(Hw) 2(H) 3(H) 4(Bx) 5(B) 6(Py) 7(Tz) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) --
JSR1B 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(P) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
JSR1C 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(P) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) -- --
JSR1D 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
JSR1E 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) -- --
JSR1F 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
Jangseong Region 2 (JSR2) JSR2A 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) -- --
JSR2B 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
JSR2C 1(H) 2(H) 3(H) 4(H) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) -- -- --
JSR2D 1(H) 2(H) 3(H) 4(H) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
JSR2E 1(H) 2(H) 3(H) 4(H) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
Jangseong Region 3 (JSR3) JSR3A 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
JSR3B 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) -- --
JSR3C 1(H) 2(H) 3(H) 4(H) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
JSR3D 1(H) 2(H) 3(H) 4(H) 5(B) 6(P) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
Jangseong Region 4 (JSR4) JSR4A 1(H) 2(H) 3(H) 4(H) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
JSR4B 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) -- -- --
JSR4C 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
JSR4D 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(P) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) -- --
JSR4E 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
Jinju Region 1 (JJR1) JJR1A 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(P) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
JJR1B 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) -- -- --
JJR1C 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
Jinju Region 1 (JJR1) JJR1A 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(P) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
JJR1B 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) -- -- --
JJR1C 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
Namhae Region 1 NHR1) NHR1A 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) --
NHR1B 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) --
NHR1C 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) --
NHR1D 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(P) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
NHR1E 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) -- -- --
Namhae Region 2 NHR2 NHR2A 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
NHR2B 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
NHR2C 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(P) 7(T) 8(T) -- -- -- --
NHR2D 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(P) 7(P) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
NHR2E 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(P) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
Namhae Region 3 NHR3 NHR3A 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) 12(T)
NHR3B 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(P) 7(T) 8(T) -- -- -- --
NHR3C 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) -- --
NHR3D 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(P) 7(T) 8(T) -- -- -- --
Namhae Region 4 NHR4 NHR4A 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) -- --
NHR4B 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) -- -- --
NHR4C 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) -- --
NHR4D 1(H) 2(H) 3(H) 4(B) 5(B) 6(B) 7(T) 8(T) 9(T) 10(T) 11(T) --
wHumic acid-vitamin agar. xBennett’s agar medium. yPhenol pre-treatment. zDirect isolate from the TAS medium.
- 항균활성 능력 검정
1차로 선발된 15개 균주의 라지패취 병원균에 대한 항균활성은 투명환의 크기를 측정하여 조사한 결과 항균활성이 가장 높은 것은 S2와 S8 균주로 투명환의 크기가 0.9 cm 로 나타났다. 다음으로 S6, S15, S12, S5, S7, S10, S4, S14, S13, S1, S9, S3, S11 순으로 조사되었다( Fig. 2 ).
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Antagonism assay of selected Streptomyces spp. against Rhizoctonia solani AG2-2 IV on PDA medium at 28℃ for 3 days. A: JSR1A2 (S1); B: JSR1C2 (S2); C: JSR1C4 (S3); D: JSR2A7 (S4); E: JSR2D9 (S5); F: JSR3B2 (S6); G: JSR3C12 (S7); H: JSR3D11 (S8); I: JSR4B3 (S9); J: JSR4D8 (S10); K: JJR1B5 (S11); L: JJR1C8 (S12); M: NHR1D8 (S13); N: NHR3C7 (S14); O: NHR4C8 (S15). Bars with the different letters show statistically significant differences between treatments according to the Tukey test (p<0.05). Error bars represent the standard deviation of five replicates.
- 셀룰로스(Cellulose) 분해 능력 검정
항균활성 능력 검정을 통하여 1차로 선발된 균주를 대상으로 셀룰로스 분해 능력 검정한 결과 S11 균주와 S4 균주의 투명환의 크기는 약 1.2mm로 셀룰로스 분해 능력이 가장 좋은 것으로 나타났다. 다음으로 S7, S2, S10 균주와 S12가 모두 동일하게 1.13으로 나타났으며 S5, S6, S14, S15, S3, S13 균주와 S9 균주의 투명환의 크기는 각각 0.9, 0.8, 0.8, 0.7, 0.7, 0.5, 0.5mm로 나타났다. S1 균주와 S8 균주의 경우 투명환이 나타나지 않아 셀룰로스 분해 능력이 없는 것으로 나타났다( Fig. 3 ).
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Cellulase enzyme assay of selected Streptomyces spp. on cellulose agar medium at 28℃ for 3 days. A: JSR1A2 (S1); B: JSR1C2 (S2); C: JSR1C4 (S3); D: JSR2A7 (S4); E: JSR2D9 (S5); F: JSR3B2 (S6); G: JSR3C12 (S7); H: JSR3D11 (S8); I: JSR4B3 (S9); J: JSR4D8 (S10); K: JJR1B5 (S11); L: JJR1C8 (S12); M: NHR1D8 (S13); N: NHR3C7 (S14); O: NHR4C8 (S15). Bars with the different letters show statistically significant differences between treatments according to the Tukey test (p<0.05). Error bars represent the standard deviation of five replicates.
Streptomyces 속의 균주는 다양한 효소를 생산하여 균체 외부로 분비하는데 그 종류는 lignin peroxidases, cellulases, xylanases와 esterases 등이 있다 (Adhi et al., 1989 ; Crawford, 1978) . 이러한 효소는 대취층을 분해할 수 있는 능력을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이 결과는 본 연구에서 선발된 균주를 잔디 재배지나 골프장에 적용하면 대취층 축적을 감소시키는 영향을 줄 수 있을 것으로 판단된다.
- 키틴(Chitin) 분해 능력 검정
Chitin agar 배지를 이용하여 선발된 15개 균주의 키틴분해 능력을 검정한 결과 S12 균주의 투명환의 크기가 2.1mm로 가장 키틴분해 능력이 우수한 것으로 나타났으며 다음으로 S5 균주가 2.0으로 높게 나타났다. 다음으로는 S9, S14, S1, S2, S3, S6, S7 균주와 S13 균주의 순으로 키틴분해 능력 나타났으며 투명환의 크기는 각각 1.5, 1.4, 0.9, 0.9, 0.9, 0.4, 0.1과 0.1mm로 나타났다. 나머지 균주인 S4, S8, S10, S11 균주와 S15 균주의 경우 키틴분해 능력이 없는 것으로 나타났다( Fig. 4 ).
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Chitinase produce assay of selected Streptomyces spp. on chitin agar medium at 28℃ for 3 days. A: JSR1A2 (S1); B: JSR1C2 (S2); C: JSR1C4 (S3); D: JSR2A7 (S4); E: JSR2D9 (S5); F: JSR3B2 (S6); G: JSR3C12 (S7); H: JSR3D11 (S8); I: JSR4B3 (S9); J: JSR4D8 (S10); K: JJR1B5 (S11); L: JJR1C8 (S12); M: NHR1D8 (S13); N: NHR3C7 (S14); O: NHR4C8 (S15). Bars with the different letters show statistically significant differences between treatments according to the Tukey test (p<0.05). Error bars represent the standard deviation of five replicates.
본 실험에서 선발된 균주의 chitinase 활성을 검정으로 S12, S5, S9, S14, S1 균주와 S2 균주는 chitin 분해능력이 우수한 것으로 인정되었다.
- 단백질(Protein) 분해 능력 검정
Skim milk agar 배지를 이용하여 15개 균주의 단백질 분해 능력을 검정한 결과 S2 균주가 접종된 배지의 투명환의 크기가 7.5 mm 단백질 분해 능력 가장 우수한 것으로 나타났으며 다음으로 S5 균주가 5.6mm으로 S13 균주가 5.1mm로 나타났다. S7, S14 균주와 S12 균주는 4.1~5mm의 단백질 분해 능력을 나타내었으며 S4, S6 균주와 S10 균주의 투명환 크기는 3.3, 3.3과 3 mm으로 나타났다. S8, S1, S3, S11, S9 균주와 S15 균주의 투명환 크기는 모두 3 mm이하로 나타났다( Fig. 5 ).
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Protein enzyme assay of selected Streptomyces spp. on skim milk agar medium at 28℃ for 3 days. A: JSR1A2 (S1); B: JSR1C2 (S2); C: JSR1C4 (S3); D: JSR2A7 (S4); E: JSR2D9 (S5); F: JSR3B2 (S6); G: JSR3C12 (S7); H: JSR3D11 (S8); I: JSR4B3 (S9); J: JSR4D8 (S10); K: JJR1B5 (S11); L: JJR1C8 (S12); M: NHR1D8 (S13); N: NHR3C7 (S14); O: NHR4C8 (S15). Bars with the different letters show statistically significant differences between treatments according to the Tukey test (p<0.05). Error bars represent the standard deviation of five replicates.
세균이 생산하는 단백질 분해효소는 동물이나 식물 또는 진균이 생산하는 것보다 다양하고 산업적으로 적용하는 범위가 넓은 것으로 알려져 있다 (Jayasree et al., 2010) . Streptomyces spp. 종류 중 S. clavuligerus, S. griseus, S. rimouses, S. thermoviolaceus S. thermovulgaris 는 항균작용을 하는 단백질을 세포외부로 분비하는 것으로 알려져 있다 (Gupta et al., 1995 ; James et al., 1991) . 선발된 균주가 분비하는 단백질 분해효소의 종류에 관하여 추가적인 연구가 필요하다. 또한 Streptomyces 는 여러 종류의 단백질 분해효소를 식물의 근권부(rhizosphere)에서 분비하여 병원균의 세포벽을 분해하여 병을 억제하는 역할을 한다고 알려져 있다 (Errakhi et al., 2007) .
본 실험에서 단백질 분해 능력을 검정으로 단백질 분해 효소를 생산하는 능력이 우수한 것으로 나타난 S2, S5, S13, S7, S14 균주와 S12 균주는 추가적인 실험을 통하여 잔디 병해 방제에 활용할 수 있는지에 대한 검토가 필요한 것으로 판단된다.
- Sidrophore 생성 능력 검정
Chrome azurol S (CAS) agar 배지를 이용하여 병원균에 대한 중요한 항균 기작으로 알려져 있는 siderophore 생성 정도를 조사한 결과 S1 균주의 투명환의 크기가 0.6mm으로 가장 높게 나타났으며 S5 균주의 경우 0.5mm로 나타났다. S2 균주와 S14 균주는 0.3 mm으로 S6, S7, S10, S11 균주와 S12 균주는 모두 0.25mm로 나타났다. 다음으로 S4 균주와 S13 균주는 0.2로 S3, S15, S8 균주와 S9 균주는 투명환의 크기가 0.2mm 이하로 나타났다( Fig. 6 ).
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Siderophore produce assay of selected Streptomyces spp. on chrome azurol S agar medium at 28℃ for 3 days. A: JSR1A2 (S1); B: JSR1C2 (S2); C: JSR1C4 (S3); D: JSR2A7 (S4); E: JSR2D9 (S5); F: JSR3B2 (S6); G: JSR3C12 (S7); H: JSR3D11 (S8); I: JSR4B3 (S9); J: JSR4D8 (S10); K: JJR1B5 (S11); L: JJR1C8 (S12); M: NHR1D8 (S13); N: NHR3C7 (S14); O: NHR4C8 (S15). Bars with the different letters show statistically significant differences between treatments according to the Tukey test (p<0.05). Error bars represent the standard deviation of five replicates.
본 실험에서 siderophore를 생산능력이 우수한 것으로 나타난 S11, S4, S7, S2, S10, S12 균주와 S5 균주는 충분히 잔디병해방제에 활용가치가 있을 것으로 판단된다.
- 선발된 균주가 분비하는 휘발성 물질의 항균활성 능력 검정
선발된 4개 균주가 분비하는 휘발성 물질의 달라스팟 병원균에 대한 항균활성 능력 검정한 결과 4균주 모두 억제 능력은 다르지만 휘발성 물질의 항균활성 능력이 있는 것으로 나타났다. 달라스팟의 경우 휘발성 물질을 처리하고 4일 후 무처리구와 비교하여 균사억제 효과가 가장 좋은 것으로 나타난 균주는 S8로 대조구에 비하여 약 94.8% 억제하는 것으로 나타났다. 다음으로 S2 균주가 76.9%로 S5 균주가 46.1%로 S12 균주가 43.5% 억제하는 것으로 조사 되었다( Fig. 7 ). 선발된 균주가 생성하는 휘발성 물질 Rhizoctonia solani AG2-2균사생장에 미치는 영향은 S8 균주가 72.9%로 가장 높게 억제하는 것으로 나타났으며 다음으로 S2 균주가 62.1%로 S5 균주가 37.8%로 S12 균주가 27% 억제하는 것으로 조사되었다( Fig. 8 ).
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Antifungal activity of volatiles produced by selected Streptomyces spp. against S. homoeocarpa. S. homoeocarpa were inoculated 4 days on the media then the Streptomyces spp. isolates were applied. Bars with the different letters show statistically significant differences between treatments according to the Tukey test (p<0.05). Error bars represent the standard deviation of ten replicates.
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Streptomyces spp. volatiles showed antifungal activity against R. solani AG2-2(IV). The target pathogen was incubated 5 days on the plate then exposed to the volatiles. Bars with the different letters show statistically significant differences between treatments according to the Tukey test (p<0.05). Error bars represent the standard deviation of ten replicates.
세균이 생성하는 이차대사산물 중에서 휘발성 물질은 근래에 조사되기 시작하였다 (Fernando et al., 2005) . 휘발성 물질의 분자량은 대부분 300 이하의 저분자 물질이며 이러한 이유로 기체크로마토그래피(gas chromatography)와 질량 분석기(mass spectrometer)를 이용하여 연구되었다 (Pichersky et al., 2006) . 현재까지 연구된 Streptomyces 속 세균이 생성하는 휘발성 물질은 Alkane, Alkene, Alken, Alcohol, Ketone, Aldehyde, Acid와 Ester 종류들로 알려져 있다 (Schöller et al., 2002) . 또한 Streptomyces 속 세균이 생성하는 휘발성 물질은 다른 진균류의 포자 발아와 균사체의 성장을 억제한다고 보고되어있다 (Anitha and Rabeet, 2010) .
문헌에 의하면 Streptomyces griseus 가 생성하는 휘발성 물질은 R. solani, Sclerotinia sclerotiorum B. cinerea 의 생장을 감소시킨다고 보고되어 있으며 (Wan et al., 2008) Streptomyces globisporus의 휘발성 물질은 저장병 원인이 되는 Penicillium italicum 의 포자발아와 균사 생장을 억제 하는 것으로 나타나 있다 (Li et al., 2010) . 이러한 휘발성 물질이 항균활성 능력을 가지게 하는 성분으로는 Cyclohexanol, decanol, 2-ethyl-1-hexanol, nonanol, benzothiazole과 dimethyl trisulfide가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다 (Danaei, 2014) . 4 균주가 분비하는 휘발성 물질의 대한 추가적인 연구는 현재 진행 중이다.
Acknowledgements
This research was performed with the support of the “Export strategy & technology development (114095-3)” from IPET, Korea.
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