Advanced
Establishing Effective Screening Methodology for Novel Herbicide Substances from Metagenome
Establishing Effective Screening Methodology for Novel Herbicide Substances from Metagenome
Weed & Turfgrass Science. 2015. Jun, 4(2): 118-123
JDHHCQ_2015_v4n2_© 2015 The Korean Society of Weed Science and The Turfgrass Society of Korea
This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted noncommercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
  • Received : June 05, 2015
  • Accepted : June 15, 2015
  • Published : June 30, 2015
Download
PDF
e-PUB
PubReader
PPT
Export by style
Share
Article
Author
Metrics
Cited by
About the Authors
Boyoung Lee
Ji Eun Choi
Young Sook Kim
Jae Kwang Song
Young Kwan Ko
Jung Sup Choi
jschoi@krict.re.kr

Abstract
메타게놈(metagenome)은 연구실에서 배양이 불가능한 미생물을 포함한 자연계에 존재하는 미생물의 유전자를 직접 연구하는 학문분야이다. 지구상 거의 모든 자연, 인공 환경에서 살고 있는 미생물 DNA를 분리·정제하는 것이 가능하며, 재조합 DNA 기술 등을 이용하여 배양 가능한 숙주미생물에 메타지놈을 클로닝함으로서 메타지놈 라이브러리를 제작할 수 있다. 최근 메타게노믹스를 통하여 자연계에 존재하고 있는 대다수의 미생물들이 실험실에서 배양되지 않았던 이유를 구명할 수 있게 되었고, 그들이 가지고 있는 생태학적인 의미와 역할에 대한 이해와 더불어 점차 그 응용 분야와 범위도 확대되고 있다. 이와 같은 메타게놈의 응용 분야 확대의 한 방안으로 본 연구에서는 새로운 제초활성 물질 및 제초활성 물질 생산에 필요한 유전자를 확보하기 위해 메타게놈 라이브러리를 대상으로 오이 떡잎절편 검정, 미세조류 생장저해 검정, 종자발아 저해검정의 HTS (high throughput screening) 시스템을 구축하였고, 구축된 시스템으로부터 선발된 최종 단일 클론인 9-G1과 9-G12의 바랭이에 대한 in vivo assay를 통해 본 연구에서 개발한 HTS 시스템의 유효성을 확인 하였다. 후속연구로서 활성단일클론이 만들어내는 제초활성물질의 동정 및 제초활성물질을 합성하는 유전자군에 대한 연구를 수행 중에 있다.
Keywords
서 론
유기합성 제초제는 상대적인 높은 효율과 낮은 생산 비용으로 효율적인 농작물 관리를 위해 오랜 기간 사용되어 왔고 지금도 각광 받고 있지만, 연용으로 인한 저항성 잡초 출현 및 인축독성 이나 환경오염 등의 문제가 대두됨에 따라 새로운 제초활성 소재 개발에 대한 관심이 증대되고 있다. 이러한 관점에서 저독성의 생 분해가 가능하고 환경 친화적인 제초제 개발에 대한 연구가 진행되고 있는데 (Hoagland, 1990) , 최근, 미생물 대사체 기반의 제초활성 후보소재들은 높은 살초 효율과 환경 친화적인 특징을 지녀 연구 재료뿐 아니라 산업적 측면에서도 관심이 높아지고 있는 추세이다 (Lydon et al., 1999 ; Duke et al., 1996) .
미생물 유래 제초제는 세균, 곰팡이 또는 방선균으로부터 합성된 생리활성물질로 세균으로부터 분리된 phaseolotoxin, syringomycin, tabtoxin (Bender et al., 1999) , 방선균 유래의 bialaphos (Bayer et al., 2004 ; Duke et al., 1996) , albucidin (Hahn et al., 2009) , glufosinate-ammonium (Hoerlein, 1994) 등이 알려져 있다. 이와 같이 다양한 미생물 유래 제초제가 개발되었지만 bialaphos의 경우 범용 경쟁제품 개발로 경쟁력이 약화 되었고, bialaphos의 유용 성분을 합성한 제초제인 glufosinate-ammonium의 경우 다른 비선택성 제초제에 비해 상대적으로 높은 가격으로 시장경쟁력이 약화되고 있기 때문에 잡초의 효율적 관리를 위한 새로운 제초활성물질에 대한 탐색은 계속 되어야 할 것 이다.
역사적으로 오랜 동안 미생물은 제초활성물질 뿐 아니라 새로운 효소나 촉매, 생리활성물질의 보고로써 연구되어 왔지만, 실제로 실험실에서 배양할 수 있는 미생물은 전체 환경에 존재하는 총 미생물의 1% 미만인 것으로 알려져 있다 (Iqbal et al., 2012 ; Langer et al., 2006 ; Lammle et al., 2007) . 여전히 밝혀지지 않은 유용한 물질을 생산하는 미생물의 존재는 무궁무진 하며, 이러한 난 배양성 미생물(un-cultured microorganism) 또는 이 미생물이 합성하는 물질을 연구하는 것은 고전적인 방법 외에 새로운 방법론이 필요한 시점이다 (Iqbal et al., 2012 ; Daniel, 2004) . 1990년대 후반 순수분리 가능한 미생물을 이용하는 기존 기술의 한계를 극복할 기술로 배양없이 직접 유전체를 연구하는 메타게노믹스(metagenomics)가 부각된 이래, 환경 유전체 라이브러리를 제작하고 이 라이브러리를 대상으로 직접 유전체 서열 분석을 통한 생태계 구조 연구 및 유용물질이나 생촉매 등을 스크리닝하는 다양한 방법들이 개발되어 왔다 (Handelsman et al., 1998 ; Gillespie et al., 2002 ; Simon and Daniel, 2011) . 메타게놈은 배양이 불가능했던 미생물로부터 유용 산물을 확보할 수 있는 매력적인 대상으로 항생제 연구분야 (Gillespie et al., 2002) , drug discovery 분야 (Courtois et al., 2003) 또는 새로운 활성을 갖는 지질분해 효소 (Henne et al., 2000) , 단백질 분해 효소 등을 탐색하기 위해 활발히 이용되고 있다 (Daniel, 2004) .
그러나 지금까지 메타게놈으로부터 제초활성을 갖는 물질을 탐색하는 연구는 보고된 바 없다. 본 연구에서는 새로운 개념의 제초활성 물질을 탐색 하기 위한 대상으로 토양 메타게놈 라이브러리를 선택하여 원하는 활성을 나타내는 클론을 선별하고자 다양한 접근법을 활용 하였는데, 메타게놈은 정보의 단위가 매우 크기 때문에 단순하고 효율적인 스크리닝 방법을 정립하는 것이 무엇보다 중요하다고 할 수 있다 (Iqbal et al., 2012 ; Langer et al., 2006 ; Simon and Daniel, 2011) . 따라서 본 연구는 전식물체( in vivo or in planta ) 적용 이전에 간단히 메타게놈 유래 살초활성물질을 스크리닝 할 수 있는 오이떡잎절편검정법, 미세조류생장저해검정법, 식물종자발아검정법을 구축하였고, 구축한 세 가지 스크리닝 방법은 앞으로 메타게놈 또는 큰 사이즈의 라이브러리를 대상으로 한 살초활성물질 스크리닝 시 high throughput screening (HTS) 시스템으로 유용한 방법이 될 수 있을 것이다.
재료 및 방법
- 메타게놈라이브러리 배양 및 배양액 분획
메타게놈라이브러리를 보유하고 있는 Escherichia coli EP100은 1/2 농도의 LB broth (Duchefa, The Netherlands) + Cm34 (34 μg mL -1 chloramphenicol, SIGMA) 배지를 사용하여 37℃에서 3일간 진탕배양 하였다. 배양액 분획 시 우선 배양액을 가압멸균(121℃ 에서 15분간 autoclave) 한 것을 원심분리 하여 상징액을 확보한 후 butanol 과 1:1 (v/v)로 섞고 분획용 funnel 에서 butanol 분획 만을 획득했다. Butanol 분획은 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA, Japan)를 사용하여 완전히 건조시킨 뒤 원 배양액 부피의 1/100이 되도록 40% acetone에 녹였다.
- 식물 생장 및 in vivo application
메타게놈 배양액의 살초력을 평가하기 위해서는 원예용상토를 충진한 폴리스티렌 폿트(표면적 38 cm 2 )에 바랭이( Digitaria sanguinalis (L) Scop.)를 파종하여 온실(30/20±5℃, Light/Dark = 14/10 h)에서 9일 동안 생육시킨 뒤 사용 하였다. 배양액 또는 배양액의 분획물을 포트당 5 mL으로 분무 처리하고 동일한 온실에서 관리 하며 처리 후 1일부터 5일 까지 외형적인 증상을 달관 조사 하였다.
- 오이떡잎절편검정
9일 동안 온실에서 생육시킨 오이 떡잎을 70% 에탄올 용액에 담가 살균한 뒤 여과지(filter paper)를 사용하여 실온 건조 하였다. 건조한 떡잎에 지름 5 mm 콜크보러(corkborer)를 이용하여 엽 절편을 분리하여 사용하였다. 96 well plate에서 배양한 뒤 가압멸균한 메타게놈 배양액 상징액 50 μl 씩을 96 well plate에 분주하고 살균된 오이 잎 절편을 한 웰(well)당 하나씩 배양액 위에 띄웠다. 상기 96 well plate는 투명한 플레이트 실(plate seal)로 밀봉하고 뚜껑을 덮은 후 다시 랩으로 밀봉하여 25℃ 생장상(Lignt/dark = 16 h/8 h)에서 배양하였다. 처리 5일 또는 7일 동안 배양한 오이 잎 절편의 상태변화를 육안으로 관찰하였고 엽절편의 색이 황화, 백화 또는 괴사하는 과정을 평가하여 활성이 있는 위치의 배양액을 선택하였다.
- 미세조류 배양 및 메타게놈배양액의 미세조류 생장저해활성 평가
두 종류의 미세조류 Scenedesmus accuminatus Chlorella vulgaris 를 사용하였고, 두 종류의 조류는 메타게놈 배양액 처리 이전에 Allen’s media (Allen, 1952) 에서 5일간 진탕 배양 하였다. 메타게놈 배양액 처리를 위해서는 배양한 미세조류를 OD 673 = 1 되도록 희석 하고 메타게놈 배양액과 1:1 비율로 섞은 뒤 25℃, 16 h/8 h (light/dark) 조건에서 배양 하며 673 nm에서 흡광도의 변화를 확인 함으로써 생장 변화를 관찰하였다. 96 well plate를 사용 하는 경우 microplate reader (xMark Microplate Spectrophotometer, BIO-RAD)를 이용하여 동일한 파장에서 관찰하고 처리 당일의 흡광도와 이틀 또는 삼일 후의 흡광도를 비교 하였다.
- 식물종자 발아저해 검정법
메타게놈 배양액의 식물 종자 발아에 미치는 영향을 알아보기 위해 애기장대( Arabidopsis thaliana ) Col-0의 종자를 사용하였다. 애기장대종자는 sodium hypochloride로 살균하고 무균상태로 건조한 뒤 MS agar media를 1 mL씩 분주한 24 well plate에 각 well 당 10~15립씩 파종하였다. 메타게놈 배양액은 멸균 한 뒤 상징액만을 사용하였으며 애기장대종자가 파종된 각 well당 100 μl 씩 분주하여 무균상태로 자연건조 하였다. 배양액을 처리한 종자를 포함한 24 well plate는 밀봉하여 뒤 25℃, 16 h/8 h (light/dark) 조건의 생장 상에서 배양하며 발아 여부 및 발아 후 생장과정을 관찰하였다.
결과 및 고찰
- 오이 떡잎절편 검정법
메타게놈으로부터 합성되는 제초활성물질을 찾기 위하여 그림 1에 나타낸 방법과 같이 오이 떡잎절편을 이용하여 잎의 황화, 백화 또는 괴사 등의 증상을 유발하는 클론을 스크리닝 하였고, 세 번 이상의 반복실험을 통해 백화 현상을 나타내게 하는 A9 위치를 1차 선택 하였다( Fig. 1 ). 본 연구 그룹에서 보유하고 있는 메타게놈라이브러리의 경우 96 well plate 에 보관 중이며 각 well 에는 약 3000 종류의 서로 다른 클론이 포함된 풀(pool) 단위로 구성되어 있다. 따라서 그림 1의 첫 번째 스크리닝에서 선택한 A9풀에 특별히 오이 떡잎절편의 백화현상을 유도하는 클론이 하나 이상 포함되어 있을 것이므로 A9 풀로부터 3000개의 콜로니(colony) 즉, 단일 클론을 분리 하여 96 well plate(1 colony well -1 )에 각각 접종 하고 배양 하였다. 각 웰 당 단일 클론으로 존재할 것으로 판단되는 메타게놈 배양액을 가지고 동일한 실험을 수행하였고, Fig. 2 에 나타낸 바와 같이 7-A5, 7-G9, 8-D8, 8-D9, 9-A5, 9-E11, 9-G1, 9-G12를 포함한 강력한 탈색 효과를 나타나게 하는 클론을 확인하였다( Fig. 2 ). 상기 여덟 종류의 단일 클론은 다른 종류의 검정법을 통해 제초활성을 확인하였다.
PPT Slide
Lager Image
The active metagenome pool (A9) led to whitening of cucumber cotyledon leaf discs. Representative picture of the repetition after 7 days following the culture broth application on leaf discs. The leaf disc inside red circle (A9) whitened by the metagenome culture broth.
PPT Slide
Lager Image
The selected active single clones inhibited microalgal growth. The black bar represents algal growth change of Scenedesmus accuminatus (A) and Chlorella vulgaris (B) for two days after mixed with metagenome culture broth.
오이 떡잎절편 검정법은 제초제를 경엽처리하는 경우를 고려하였으며, 오이뿐 아니라 다양한 식물에서도 병원균이나 제초제를 포함한 다양한 물질에 대한 반응을 연구하는데 자주 이용되는 방법이다 (Olmstead et al., 2000 ; Tworkoski, 2002) . 이 방법은 식물 시스템을 함에도 불구하고 잎 절단면이 연약하고 반응 성이 좋기 때문에 비교적 간편하게, 빠른 시간 안에 결과물을 확인 할 수 있는 장점이 있으나 같은 이유로 false positive의 빈도가 매우 높아 여러 번의 반복실험으로 경향을 파악해야 한다는 단점이 있다.
- 미세조류 생장 저해 검정법
민물에 서식하는 남조류에 속하는 미세조류는 낮은 농도의 다양한 제초제에도 민감한 반응을 보여 환경내 제초제 바이오센서(biosensor)로 개발하고자 한다는 보고가 있다 (Vedrine et al., 2003 ; Podola and Melkonian, 2005 ; Ma et al., 2002) . 미세조류는 단일 세포 형태이며 수생이기 때문에 플라스크에서 또는 매우 간략한 배양 형태인 96 well plate 에서도 배양이 용이 하여 HTS 시스템으로 사용하기 편리하다 (Pavlic et al., 2006) . Fairchild 등이 연구한 여섯 종류의 조류를 사용하여 다양한 제초제에 대한 민감도를 조사한 기존의 결과에 따르면 Chlorella Scenedesmus 가 여러 제초제에 대해 상대적으로 민감하게 영향을 받았다고 한다 (Fairchild et al., 1998) .
본 실험에서는 기존 연구 결과를 참고하여 검정용 미세조류로 Chlorella vulgaris Scenedesmus accuminatus 를 사용하여 상기 오이떡잎절편 검정법을 통해 백화현상을 유도한 8종류의 단일 클론에 의한 조류의 생장저해 활성이 나타나는지 확인하였다. 이때 오이떡잎절편에 활성이 없었던 4-D1과 4-D5 단일 클론을 음성 대조군으로 사용 하였다. 충분히 배양한 두 종류의 조류 배양액을 96 well plate에 분주하고 동일 부피의 메타게놈 배양액을 처리한 뒤 처리 당일과 2일 후 673 nm에서 조류 흡광도의 변화를 살펴본 결과 오이떡잎절편에 백화현상을 야기한 단일클론 모두 흡광도의 변화를 야기하지 않았거나 감소시켜 조류의 생장을 억제하는 활성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다( Fig. 2 .). 반면 음성 대조군으로 사용한 4-D1과 4-D5, 8-D8, 메타게놈 배양용 배지(LB), 메타게놈 호스트 배양액(EP100)의 경우 흡광도가 크게 증가하여 상대적으로 조류 생장억제 활성이 낮거나 없는 것으로 나타났다( Fig. 2 .). 조류 생장저해 검정법의 경우 96 well plate등의 microplate 사용이 용이하고 식물 시험을 하는 경우 보다 검정 시간이 비교적 짧은 편이며 시험 반복수를 최대화 할 수 있으므로 대량의 스크리닝에는 가장 적합한 방법이라고 할 수 있다.
- 식물종자 발아저해 검정법
제초활성이 있는 메타게놈 배양액이 토양내 식물 종자의 발아에 미치는 영향을 예측하기 위한 실험으로 애기장대 종자의 in vitro 발아 시험을 수행 하였다. 애기장대 에코타입 콜럼비아( Arabidopsis thaliana Col-0) 종자를 24 well plate한 웰당 일정한 개수의 종자가 들어가도록 분주하고 종자 위에 제초 활성을 나타내는 메타게놈 클론 배양액을 100 μl씩 첨가하고 정치배양 하면서 일주일 후, 발아율 및 발아 상태를 관찰하였다.
그 결과, Table 1 에 나타낸 바와 같이, 8-D9를 제외한 모든 처리구에서 발아율 자체에 미치는 영향은 없었고 다만 발아 후 자라난 뿌리의 길이에서 다소 차이를 나타냈다. 음성대조군으로 사용한 4-D1과 8-D6의 경우에도 뿌리 생장이 저해 되었고 배지만을 처리한 경우에만 정상적인 뿌리 생장이 이루어졌다. 상대적으로 7-A5, 7-G9, 8-D8의 경우 다른 처리구에 비해 뿌리 생장이 저해 되었다( Table 1 ). 따라서 식물종자 발아저해 검정법은 대장균이 배양된 배양액을 단독으로 사용 할 경우 발아율이나 생장저해를 관찰하기에 명확한 방법으로 사용될 수는 없으며 다른 검정법과 함께 사용하여 특징을 비교해야 할 것으로 생각된다.
Seed germination assay. Active single clones selected from cucumber cotyledon leaf disc assay inhibited root growth of germinatedArabidopsisCol-0 seeds.
Clone Germination Relative Root Length Note

7-A5 6/8 5-10%
7-G9 6/7 10-30%
8-D8 11/12 10-30%
8-D9 1/11 Below 5%
9-A5 4/4 20%
9-E11 9/9 20-70%
9-G1 10/11 20-80%
9-G12 10/10 20-70%
4-D1 9/10 10-50% Weak negative control
8-D6 11/11 70% Negative control
Media 10/10 100% Negative control (media only)
- In vivo activity 확인
상기 실험을 통하여 생장저해 효과를 나타내는 선발된 단일 클론의 실제 식물체에 대한 살초효과를 확인 하기 위해 5종의 선발클론(8-D9, 9-A5, 9-E11, 9-G1 and 9-G12)을 대량배양(1 L) 한 후 배양액의 염분 제거를 위해 butanol 분획만을 농축하여 바랭이( D. sanguinalis )에 경엽처리 하였다. Fig. 3 Table 2 에 나타낸 바와 같이, 메타게놈 배양액을 처리한 바랭이 군에서는 처리 2일 후부터 육안으로 관찰이 가능했으며, 선발된 활성 단일 클론의 배양액을 처리한 군과 음성 대조군(4-D1, 4-D5 and media)을 비교하였을 때, 선발된 단일 클론의 살초 효과를 관찰 할 수 있었다. 8-D9, 9-A5, 9-E11의 경우 음성대조군과 비교 할 때 확실히 증가한 살초효과를 나타내지는 않았으나 9-G1과 9-G12 클론 배양액의 경우 90%의 살초 효과를 나타냈다( Fig. 3 and Table 2 ). 결과적으로 9-G1과 9-G12를 최종 살초효과를 나타내는 단일 클론으로 선택할 수 있었다.
PPT Slide
Lager Image
Butanol fraction of culture broth of active single clones led to desiccation and growth retardation of Digitalis sanguinalis in vivo. Representative pictures of D. sanguinalis at 3 days after spraying butanol fraction of culture broth of the selected single clones. The growth of 9-G1 and 9-G12 treated plants was strongly inhibited and desiccated relative to the negative controls (4-D1, 4-D5, media control, EP100 and mock).
In vivoapplication of culture broth from selected single clones. Butanol fraction of culture broth of active single clones led to desiccation or growth retardation ofDigitalis sanguinalis in vivo.
Clone Herbicidal Activity

8-D9 50%
9-A5 30%
9-E11 40%
9-G1 90%
9-G12 90%
4-D1 40%
4-D5 30%
Media 10%
따라서 오이 떡잎절편검정, 미세조류 생장저해검정, 종자 발아저해검정 등을 통해 광범위한 메타게놈 라이브러리로부터 제초활성이 있는 단일클론의 스크리닝이 가능하며, 선별한 단일 클론을 실제 식물체에 적용했을 때 에도 충분한 활성을 관찰 할 수 있음을 확인하였다. 현재 선별한 메타게놈 단일 클론이 합성하는 제초활성 물질의 동정과 단일 클론의 유전자 서열을 분석하여 제초활성 물질을 합성하는데 필요한 유전자군의 구조 분석을 진행 중에 있다. 제초제 연구 분야에서 메타게놈은 흥미로운 재료이며 메타게놈이 제초활성물질을 개발하는 재료로서 가능성이 있음을 소개한 적은 있으나 아직 제초활성물질이 동정된 바는 없다 (Kao-Kniffin et al., 2013) . 만약 본 연구를 통해 선발된 클론에 의해 만들어진 제초활성물질이 밝혀진다면 메타게놈에서 유래된 최초의 물질이 될 것으로 기대하고 있다.
Acknowledgements
This research was supported by a project No SI1508 (Development of crop protection agents leading the future market) and thse Integrated Technology Development program (project No KK1507-C04; High-throughput screening-based metagenomic discovery of crop protection agents) from the Korea Research Institute of Chemical Technology.
References
Allen M.B. 1952 The cultivation of Myxophyceae. Arch. Microbiol. 17 34 - 53
Bayer E. , Gugel K. , Hägele K. , Hagenmaier H. , Jessipow S. 2004 Stoffwechselprodukte von mikroorganismen. 98. Mitteilung. Phosphinothricin und Phosphinothricyl-Alanyl-Alanin. Helv. Chim. Acta. 55 224 - 239    DOI : 10.1002/hlca.19720550126
Bender C.L. , Alarcon-Chaidez F. , Gross D.C. 1999 Pseudomonas syringae phytotoxins: mode of action, regulation, and biosynthesis by peptide and polyketide synthetases. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63 266 - 92
Courtois S. , Cappellano C.M. , Ball M. , Francou F.X. , Normand P. 2003 Recombinant environmental libraries provide access to microbial diversity for drug discovery from natural products. Appl. Environ. Microbiol. 69 49 - 55    DOI : 10.1128/AEM.69.1.49-55.2003
Daniel R. 2004 The soil metagenome--a rich resource for the discovery of novel natural products. Curr. Opin. Biotechnol. 15 199 - 204    DOI : 10.1016/j.copbio.2004.04.005
Duke S. , Abbas H. , Amagasa T. , Tanaka T. 1996 Phytotoxins of microbial origin with potential for use as herbicides. Critical Reports on Applied Chemistry 35 82 - 112
Fairchild J.F. , Ruessler D.S. , Carlson A.R. 1998 Comparative sensitivity of five species of macrophytes and six species of algae to atrazine, metribuzin, alachlor, and metolachlor. Environ. Toxicol. Chem. 17 1830 - 1834    DOI : 10.1002/etc.5620170924
Gillespie D.E. , Brady S.F. , Bettermann A.D. , Cianciotto N.P. , Liles M.R. 2002 Isolation of antibiotics turbomycin a and B from a metagenomic library of soil microbial DNA. Appl. Environ. Microbiol. 68 4301 - 4306    DOI : 10.1128/AEM.68.9.4301-4306.2002
Hahn D.R. , Graupner P.R. , Chapin E. , Gray J. , Heim D. 2009 Albucidin: a novel bleaching herbicide from streptomyces albus subsp. chlorinus NRRL B-24108. J. Antibiot. 62 191 - 194    DOI : 10.1038/ja.2009.11
Handelsman J. , Rondon M.R. , Brady S.F. , Clardy J. , Goodman R.M. 1998 Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chemistry & biology. 5 R245 - R249    DOI : 10.1016/S1074-5521(98)90108-9
Henne A. , Schmitz R.A. , Bomeke M. , Gottschalk G. , Daniel R. 2000 Screening of environmental DNA libraries for the presence of genes conferring lipolytic activity on escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 66 3113 - 3116    DOI : 10.1128/AEM.66.7.3113-3116.2000
Hoagland R.E. 1990 Microbes and microbial products as herbicides. An overview. ACS Symposium Series1990. 439 2 - 52
Hoerlein G. 1994 Glufosinate (phosphinothricin), a natural amino acid with unexpected herbicidal properties. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 138 73 - 146
Iqbal H.A. , Feng Z. , Brady S.F. 2012 Biocatalysts and small molecule products from metagenomic studies. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 109 - 16    DOI : 10.1016/j.cbpa.2012.02.015
Kao-Kniffin J. , Carver S.M. , DiTommaso A. 2013 Advancing weed management strategies using metagenomic techniques. Weed Sci. 61 171 - 184    DOI : 10.1614/WS-D-12-00114.1
Lämmle K. , Zipper H. , Breuer M. , Hauer B. , Buta C. 2007 Identification of novel enzymes with different hydrolytic activities by metagenome expression cloning. J. biotechnol. 127 575 - 592    DOI : 10.1016/j.jbiotec.2006.07.036
Langer M. , Gabor E.M. , Liebeton K. , Meurer G. , Niehaus F. 2006 Metagenomics: An inexhaustible access to nature's diversity. Biotechnol. J. 1 815 - 821    DOI : 10.1002/biot.200600111
Lydon J. , Duke S.O. , Singh B. 1999 Inhibitors of glutamine biosynthesis Marcel Dekker New York, NY, USA
Ma J. , Xu L. , Wang S. , Zheng R. , Jin S. 2002 Toxicity of 40 herbicides to the green alga chlorella vulgaris. Ecotoxicol. Environ. Saf. 51 128 - 132    DOI : 10.1006/eesa.2001.2113
Olmstead J.W. , Lang G.A. , Grove G.G. 2000 A leaf disk assay for screening sweet cherry genotypes for susceptibility to powdery mildew. HortSci. 35 274 - 277
Pavlic Z. , Stjepanovic B. , Horvatic J. , Persic V. , Puntaric D. 2006 Comparative sensitivity of green algae to herbicides using Erlenmeyer flask and microplate growth-inhibition assays. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 76 883 - 890    DOI : 10.1007/s00128-006-1001-3
Podola B. , Melkonian M. 2005 Selective real-time herbicide monitoring by an array chip biosensor employing diverse microalgae. Journal of Applied Phycol. 17 261 - 271    DOI : 10.1007/s10811-005-4945-5
Simon C. , Daniel R. 2011 Metagenomic analyses: past and future trends. Appl. Environ. Microbiol. 77 1153 - 1161    DOI : 10.1128/AEM.02345-10
Tworkoski T 2002 Herbicide effects of essential oils. Weed Sic. 50 (4) 425 - 431    DOI : 10.1614/0043-1745(2002)050[0425:HEOEO]2.0.CO;2
Védrine C. , Leclerc J.C. , Durrieu C. , Tran-Minh C. 2003 Optical whole-cell biosensor using Chlorella vulgaris designed for monitoring herbicides. Biosens Bioelectron. 18 457 - 463    DOI : 10.1016/S0956-5663(02)00157-4