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Spectrofluorimetric Determination of Promethazine with Neutral Red Enhanced by β-Cyclodextrin
Spectrofluorimetric Determination of Promethazine with Neutral Red Enhanced by β-Cyclodextrin
Journal of the Korean Chemical Society. 2014. Apr, 58(2): 227-229
Copyright © 2014, Korea Chemical Society
  • Received : November 09, 2013
  • Accepted : January 30, 2014
  • Published : April 20, 2014
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서연 최
희선 최

Abstract
Keywords
서 론
Promethazine은 항히스타민, 진정, 항정신, 진토 그리고 항콜린 효과를 가지고 있어 치료제로서 널리 사용되고 있지만, 사람에게 내분비 질환 그리고 심장병과 같은 부작용을 일으키기도 한다. 1 2 그러므로 promethazine을 정량하는 것에 대해 많은 관심을 갖게 되고, 이에 따라 promethazine의 함량을 측정하는 다양한 방법이 개발되었다. 이중에는 전위차법, 3 펄스차이 벗김법, 4 흡수 분광광도법, 5 화학발광법, 6 모세관 띠 전기이동, 7 HPLC-MS, 8 네모파 전압전류법 9 등이 있다.
형광시약인 neutral red(NR)는 요즈음에는 DNA 구조를 조사하는 데에도 사용하고 있으며, 용액 상태에서 2년 동안이나 보관하여도 매우 안정하다는 특성을 가지고 있다. 10
β-cyclodextrin(β-CD)( . 1(a) )의 구멍 내부는 외부에 비해 비극성 11 이다. 염기성에서 비교적 비극성인 형태를 갖는 형광시약 neutral red(NR)( . 1(b) )는 β-CD 구멍 내부에 들어가 내포되어 착물을 만들면서 형광의 세기가 증가한다. 이처럼 형광 세기가 증가하는 것은 NR이 β-CD와 내포 착물을 만들면서 NR 분자내의 회전 및 진동 운동이 자유롭지 못해 내부전환으로 인한 비복사 에너지 손실이 없기 때문인 것으로 보인다. 여기에 분석물인 promethazine( . 1(c) )이 첨가되면 β-CD와 센 상호작용을 하여 β-CD에 내포되어 있는 NR을 치환하면서 형광의 세기를 감소시킨다. 즉 promethazine의 농도가 증가함에 따라 NR-β-CD의 형광 세기가 비례적으로 감소하는데 이 현상을 이용하여 promethazine을 정량하는 방법에 대해 연구하였다.
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Structures of (a) β-cyclodextrin, (b) neutral red, and (c) promethazine hydrochloride.
실 험
- 기기 및 실험조건
일본 Hitachi 모델 F-2000 Fluorescence Spectrophotometer를 사용하였다. 형광 시약인 neutral red의 들뜸 파장과 형광 파장은 각각 285 nm와 581 nm이었으며 스펙트럼 띠나비는 둘 모두 10 nm로 하였다. 시료 용기는 사면이 모두 투명한 1 cm 셀을 사용하였다. 시료 용액에 질소 기체를 불어 넣어 산소 기체의 존재 유무에 따른 형광 세기를 관찰하여 보니 차이가 없었으므로 시료용액과 표준용액에 질소 기체를 불어넣지 않고 형광 세기를 직접 측정하였다. 실험 중 pH를 조절하거나 완충용액을 만들 때는 Istak 모델 750P pH미터(Jisico, Korea)를 사용하였다.
- 시약과 용액
본 실험에서 사용한 모든 시약들은 분석급 시약을 정제하지 않고 사용하였다. β-cyclodextrin(Wako, Japan)는 1.0×10 −2 M 저장용액, neutral red(Aldrich, U.S.A)는 1.0×10 −3 M 저장용액, promethazine hydrochloride(Aldrich, U.S.A) 1.0×10 −2 M 저장용액을 각각 만들어 어두운 장소에 보관하고 사용할 때마다 적절한 농도로 묽혀서 사용하였다. 0.1M borax 용액과 0.1 M NaOH를 적당량 혼합하여 만든 borax 완충용액(pH = 10.5)을 사용하여 시료 용액과 표준용액의 pH를 조절하였다. 탈이온수는 한국 영린 기기의 Ultra 370 series 초순수 장치를 이용하여 만들어 사용하였다.
- Promethazine을 정량하기 위한 검정곡선
20.0 mL 부피 플라스크 7개에 promethazine을 각각 이들의 농도가 3.0 × 10 −6 M ~ 9.0 × 10 −5 M 되도록 취하였다. 각각에 NR 농도가 2.5 × 10 −5 M, β-CD 농도가 1.0 × 10 −3 M 되게 하고, borax 완충용액(pH = 10.5)을 2.0 mL 가하고, 증류수로 표선까지 묽힌 후 형광 세기를 측정하였다. 실제 시료 분석에 이용하는 검정곡선은 promethazine을 가하지 않았을 때의 NR-β-CD 내포 착물의 형광 세기(F1)와 promethazine을 첨가한 후의 NR-β-CD 내포 착물의 형광 세기(F2)의 차이(ΔF = F1−F2)를 promethazine의 몰농도(M)에 대해 도시하여 얻었다. 바탕용액은 promethazine과 NR을 제외하고 나머지 시약들은 똑같은 양을 가하여 만들었으며 이의 형광 세기를 측정하여 바탕보정에 사용하였다.
- Promethazine 합성시료 및 실험시료 만들기
Promethazine 100 mg, 250 mg 및 500 mg에 각각 부형제인 mannitol 또는 lactose를 4.90 g, 4.75 g 및 4.50 g씩을 혼합하여 promethazine이 포함된 6종류의 5.0 g의 합성시료를 만들었다.
이들 각각을 500 mg씩 취하여 각각의 100 mL 부피 플라스크에 넣고 증류수로 용해시켜 표선까지 묽혔다. 이들 중 promethazine 10 mg이 포함된 용액에서는 20.0 mL 부피 플라스크에 2.0 mL를, 25 mg과 50 mg이 포함된 용액은 1.0 mL를 취하였다. 각각 모두에 NR 농도가 2.5×10 −5 M, β-CD 농도가 1.0×10 −3 M 되도록 하고, borax 완충용액 2.0 mL를 가하고 증류수로 표선까지 묽힌 후 형광 세기를 측정하였다.
결과 및 고찰
- Neutral red의 형광 스펙트럼
Neutral red(a), neutral red-β-cyclodextrin 내포 착물(b), 그리고 neutral red-β-cyclodextrin 내포 착물에 promethazine을 첨가하였을 때(c)의 형광 스펙트럼을 . 2 에서 보여주고 있다. 같은 농도의 NR에 대해서 β-CD 농도가 1.0×10 −3 M로 들어있을 때 NR과 β-CD간의 내포 착물이 형성되어 형광 세기가 증가한다. 그리고 NR-β-CD 내포 착물에 promethazine이 첨가되면 NR-β-CD 내포 착물에서 NR이 promethazine으로 치환되므로 인해 형광의 세기가 감소되는 것을 볼 수 있다.
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Fluorescence emission spectra of (a) neutral red (2.5 × 10−5 M) (b) neutral red-β-cyclodextrin inclusion complex and (c) neutral red-β-cyclodextrin inclusion complex in promethazine solution.
- 최적 실험 조건
β-CD의 내부는 외부보다 비극성이므로 NR이 비교적 비극성에 가까운 구조를 가질수록 β-CD와 더 잘 상호작용을 하여 NR-β-CD 내포 착물을 효율적으로 만들게 되는데 이는 pH에 의해 영향을 받을 수 있다. NR의 구조 ( . 1(b) )를 보면 산성일 때는 두 아민기와 헤테로 고리에 있는 두 개의 질소에 H + 가 붙어 큰 양전하를 띨 수 있지만, 염기성일 때는 이런 현상이 일어나지 않아 전하를 띠지 않게 되므로 내포 착물을 더 잘 만들 것이다. 따라서 어느 pH에서 NR-β-CD 내포 착물을 잘 형성하여 형광 세기를 크게 증가시키고, promethazine에 의해 β-CD에 내포된 NR이 가장 잘 치환되는지를 조사해 보았다. pH 10.0~11.0에서 가장 큰 형광 세기가 나타남을 알 수 있었다. 따라서 pH는 borax 완충용액을 이용하여 10.5로 조절하였다.
NR-β-CD 내포 착물을 많이 만들어 형광 세기를 극대화 시켜야 다양한 농도의 promethazine을 검출할 수 있으므로 최대의 형광세기를 얻을 수 있는 NR과 β-CD의 농도를 결정해 보았다.
β-CD와 결합하는 NR의 농도가 증가할수록 NR-β-CD 착물을 더 많이 만들어 형광 세기가 증가하므로 일정량의 β-CD에 NR의 농도를 변화시키면서 최대 형광 세기를 나타내는 NR의 농도를 알아보았다. pH 10.5에서 β-CD의 농도가 1.0×10 −3 M 일 때 형광의 세기가 가장 큰 NR의 농도를 조사해 보니 2.5×10 −5 M이었다. 그리고 NR의 농도가 이보다 크게 되면 측정 기기의 형광 세기 측정 범위를 넘어섰기 때문에 사용할 수 없었다.
β-CD의 농도가 높을수록 NR과 내포 착물을 많이 만들게 되므로 β-CD를 NR의 양 보다 과량을 넣어주어야 하는데 NR의 농도가 2.5×10 −5 M 일 때 β-CD의 농도를 1.0×10 −3 M일 때 가장 형광 세기가 컸었고 그 이상의 β-CD 농도에서는 형광의 세기 변화는 거의 없었다. 그리고 β-CD의 농도가 너무 진하면 산란 현상이 일어남을 알 수 있었다.
NR-β-CD 내포 착물에 있는 NR이 promethazine으로 치환되는 반응이 평형을 이루는 시간이 필요할 것으로 예상되었다. 최적 조건에서 NR-β-CD 내포 착물에 promethazine을 가한 직후인 0분부터 120분까지 반응 시간에 따른 형광 세기를 측정하였다. promethazine을 넣어주자 마자 형광의 세기가 감소한 후 그 이후에는 변함없이 거의 일정하였다. 따라서 시료 측정용액을 만든 후 1시간 이내에 측정 하였다.
- 검정곡선과 검출한계
실험 부분에서 설명한 방법으로 promethazine의 검정곡선을 얻었으며 1 에 이의 성능계수를 적어 놓았다. 감도가 비교적 좋고, 직선성(R 2 )도 매우 좋음을 알 수 있다. 25개 바탕용액의 형광 세기를 측정하여 이 형광 세기들의 표준편차의 3배에 해당하는 값과 검정곡선의 기울기를 이용하여 검출한계를 구하였다.
Figures of merits for calibration curve of promethazine
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Figures of merits for calibration curve of promethazine
- 시료에서의 응용
실제 시료 속에 들어있는 promethazine의 함량을 측정하기 위해 시중에서 promethazine이 함유된 약을 구입하려고 했으나 여러 가지 부작용으로 인해 시판되고 있지 않았다. 따라서 실험실에서 약을 만들 때 사용되는 부형제인 mannitol 또는 lactose에 promethazine hydrochloride를 일정량씩 혼합하여 합성 시료를 만들어 측정하였다. 이에 대한 결과를 2 에 나타내었다. 합성 시료에 들어있는 promethazine은 비교적 적은 상대오차 범위(±5.0% 이내)에서 정량할 수 있음을 알 수 있었다.
Determination of promethazine in synthetic samples
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aThe mean values were obtained from seven replicate samples.
결 론
Neutral red-β-cyclodextrin 내포 착물을 이용하여 합성 시료 중에 들어있는 promethazine을 분광형광법으로 비교적 간단하게 정량할 수 있었다. 측정 농도 범위는 3.0×10 −6 ~9.0×10 −5 M이고, 검출한계는 9.0×10 −7 M (0.29 μg/mL)이고, 측정값의 % 상대오차는 모두 5% 미만이었다.
Acknowledgements
Publication cost of this paper was supported by the Korean Chemical Society.
References
Daniel D. , Gutz I. G. R. 2003 Anal. Chim. Acta 494 215 -
Alizadeh T. , Akhoundian M. 2010 Electrochim. Acta 55 3477 -
Alizadeh T. , Akhoundian M. 2010 Electrochim. Acta 55 3477 -
Ni Y. , Wang L. , Kokot S. 2001 Anal. Chim. Acta 439 159 -
Saif M. J. , Anwar J. 2005 Talanta 67 869 -
Sultan S. M. , Hassen Y. A. M. , Abulkibash A. M. 2003 Talanta 59 1073 -
Lara F. J. , Garcia-Campaña A. M. , Alés-Barrero F. , Bosque- Sendra J. M. 2005 Anal. Chim. Acta 535 101 -
Huang M. , Gao J. , Zhai Z. , Liang Q. , Wang Y. , Bai Y. , Luo G. 2012 J. Pharm. Biomed. Anal. 62 119 -
Marco J. P. , Borges K. B. , Tarley C. R. T. , Ribeiro E. S. , Pereira A. C. 2013 Sens. Actuators, B 177 251 -
Ni Y. , Du S. , Kokok S. 2007 Anal. Chim. Acta 584 19 -
Zhu X. , Sun J. , Wu J. 2007 Talanta 72 232 -