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Effects of M1 RNA Internal Deletions on Stability of Upstream rnpB Transcripts
Effects of M1 RNA Internal Deletions on Stability of Upstream rnpB Transcripts
Journal of the Korean Chemical Society. 2008. Oct, 52(5): 580-582
Copyright © 2008, The Korean Chemical Society
  • Received : September 05, 2008
  • Published : October 20, 2008
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순강 홍

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실 험
균주 및 플라스미드. 사용된 대장균 RNase E ts 균주 MCE- ( rne -3071 K12r-m + )이었다. 10 플라스미드 pLMdd5-9, pLMdd5-50, pLMd23은 pLM1의 유도체이다. 5 , 8 pLM1은 rnpB 유전자 지도의 -270 에서 +1286 까지의 KpnI-EcoRI DNA 절편을 포함하고 있는 pGEM3의 유도체이다 11 . pLMdd5-9, pLMdd5-50, pLMd23은 각각 rnpB 구조 유전자의 +139 ~ +330, +139 ~ +363, +36 ~ +57의 염기서열이 결실되어 있다. 5 , 8
생체 내 RNA의 추출. 30 ℃에서 앰피실린(ampicillin) 50 μg/ml을 포함하는 LB에서 밤 새 키운 대장균을 같은 배지에 1:100으로 묽힌 후 A 600 가 0.6까지까지 진탕 배양하였다. 배양액을 둘로 나누고 하나는 30 ℃에서 다른 하나는 44 ℃로 계속 1 시간 동안 배양하였다. 배양액 0.7 ml 에 70 μl 의 10배 농도의 RNA 추출완충용액(RNA 추출완충용액: 0.02 M NaOAc, pH 5.2, 0.5% SDS, 1 mM EDTA)을 가한 다음 RNA 추출완충용액으로 포화된 페놀 700 μl을 가하고 65 ℃에서 20분간 페놀추출을 하였다. 수용액층에 다시 700 μl의 같은 페놀을 넣고 추출한 후 같은 부피의 이소프로필알코올을 가하여 -20 ℃에서 RNA를 침전시켰다. 12
노던식 빨아들이기(Northern blot). RNA를 7 M 우레아를 포함하는 5% 폴리아클릴아미드 겔에서 분리한 후 나일론 막(Hybond-N; Amersham Pharmacia Biotech)로 전기이동(electrotransfer)하였다. 탐침 (probe)으로 사용된 반의미 M1 RNA(antisense RNA)는 pLMd23 DNA를 Hin dIII로 절단한 후 T7 RNA 중합 효소를 이용한 시험관내 전사반응을 통하여 얻었다. 5 이때 [ 32 P]CTP를 이용하여 RNA 내부를 32 P로 표지화하였다.
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