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Study on the Novel Synthesis of P-32 Labeled Agents for Tracing Metabolism
Study on the Novel Synthesis of P-32 Labeled Agents for Tracing Metabolism
Journal of the Korean Chemical Society. 2005. Aug, 49(4): 381-388
Copyright © 2005, The Korean Chemical Society
  • Received : March 24, 2005
  • Published : August 20, 2005
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강혁 최
병재 안
울재 박
현수 한
국현 유

Abstract
[ 32 P] γ-ATP와 [ 32 P] α-dCTP는 대표적 P-32 표지화합물이며, 인산화 시약 또는 여러 RNA나 DNA의 P-32 표지 기질로 사용된다. 이 화합물들은 주로 생화학적 합성법에 의해 합성이 된다. 본 연구실에서는 P-32 표지화합물의 대량생산에 맞는 화학적 합성방법으로, 짝지움 시약인 O-8-(5-chloroquinolyl)-S-phenyl phosphorothiate을 이용하였다. O-8-(5-chloroquinolyl)-S-phenyl phosphorothiate의 총 합성 수율은 42%이었다. 이를 이용한 [ 32 P] γ-ATP와 [ 32 P] α-dCTP의 합성표지수율은 각각 95%, 40%였다.
Keywords
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결과 및 고찰
- 짝지움 시약의 합성
1 과 같이 2 단계 과정으로 짝지움 시약( 3 )을 합성하였다. 화합물 ( 2 )의 합성은 0, 질소 조건에서 실험을 하였다. 반응 진행시 Cl 과 피리딘이 반응한 피리딘염(현탁 침전물)이 생성된다. 이 피리딘염을 분리하지 않고 재결정 할 경우 용매와 생성물사이의 계면활성작용으로 화합물 ( 2 )을 얻지 못하였다. 합성된 화합물 ( 2 )는 연한노란색의 분말형태이며 메탄올에 약간 용해되고 HMPA와 DMSO에 쉽게 용해되었다. 화합물 ( 3 )은 Tsujiaki Hata의 연구 19 를 참고하였으며 10 당량에 해당하는 페닐다이설파이드(phenyldisulfide)를 이용한 결과 화합물 ( 3 )의 수율이 10% 미만으로 불순물도 많았다. 피리딘과 아세토나이트릴(acetonitrile) 혼합용매 조건하에 2.5 당량의 페닐다이설파이드로 화합물 ( 3 )을 합성하였으며 TLC 결과 정량적 반응진행을 확인하였다. 사용 용매의 양을 최소 조건으로 하여 페닐다이설파이드를 첨가하였으며, 반응물(화합물 ( 2 ))이 용매에 완전히 용해되는 것을 확인하고 트리부틸포스핀(tributylphosphine)을 첨가하여야 60% 이상의 높은 수율의 화합물 ( 3 )을 얻을 수 있었다.
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Reaction step in the preparation of O-8-(5-chloroquinolyl)-S-phenyl phosphorothiate.
- 비교물질 ATP의 합성
[ 32 P] γ-ATP( 5 )의 합성은 2 와 같으며 P-32 표지화합물의 합성조건을 알아보기 위해 안정한 원소( 31 P)로 ATP를 합성하였다. ATP의 합성은 2단계 반응을 한 용기반응(One-spot Reaction)으로 진행하였다. 화합물 ( 4 )의 확인은 Ag + 이 페닐설파이드기와 반응하여 생성되는 AgSPh의 침전물로 간접 확인이 가능하며 TLC로 반응을 확인하였다. 침전물은 카트리지 필터(Nylon, pore size 0.45 μl)를 이용해서 제거하였다. 화합물 ( 4 )의 퀴놀릴기를 제거하기 위해 Cu 2+ 를 사용했으며 크기가 비슷한 Zn 2+ 을 사용하여도 같은 결과를 얻었다. 합성한 ATP는 시판하는 ATP와 TLC 비교를 하여 확인하였다. 최적 분리 확인 조건은 n -buOH : EtOH : H 2 O :NH 3 (1 : 1 : 1 : 1)의 전개 용매를 사용 했을 경우이며, ATP는 0.53, AMP는 0.70, 화합물 ( 3 )은 0.85의 전개율을 나타내었다. 2 와 같은 방법의 합성을 통해 P-32 표지화합물을 합성할 수 있음을 확인하였다.
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Reaction step in the preparation of [32P] γ-ATP using chemical processing.
- 비교물질 dCTP 합성
[ 32 P] α-dCTP ( 8 )의 합성은 3 과 같으며 표지 화합물을 합성하기 전에 안정한 원소를 이용하여 dCTP의 합성여부를 확인하였다. dCMP ( 6 )의 합성에 있어서 H 3 PO 4 는 세위치의 작용기가 있어 CCl 3 CN과 반응시 여러 부반응 11 이 일어날 수 있다. 이와 같은 부반응으로 수득율 저하가 일어나므로 부분적 보호기 도입 과정이 필요하였다. 이를 해결하기위해 트리에틸아민(triethylamine)을 이용한 부분적 보호기를 도입하였다. H 3 PO 4 의 pKa 1 , pKa 2 , pKa 3 는 각각 2.12, 7.21, 12.67로서 트리에틸아민(pKa = 11.1)을 첨가하면 H 3 PO 4 의 두 작용기를 염 상태로 보호를 할 수 있다. 보호된 H 3 PO 4 . 2 의 상태이며, 무수 반응조건에서 선택적 인산화 반응이 가능하였다. 한편, 피리딘의 pKa는 5.25로서 H 3 PO 4 의 pKa 1 과 pKa 2 의 중간값을 가지며, 선택적으로 한 작용기를 보호 할 수 있었다. 합성된 dCMP는 여러 용매조건에서 확인하였으며 최적 분리 확인 조건은 C 3 H 7 OH : H 2 O : NH 4 OH(11 : 4 : 5)를 사용할 경우이며 dCMP는 0.55의 전개율을 나타내었다.
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Reaction step in the preparation of [32P] α-dCTP using chemical processing.
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Partially protected phosphoric acid with Triethylamine.
dCTP의 합성은 ATP의 합성과정과 유사한 방법으로 짝지움 시약을 이용하였다. TLC를 확인한 결과 C 3 H 7 OH : H 2 O : NH 4 OH(55 : 20 : 25) 용매 조건에서 전개율은 0.35이었으며, n -buOH : H 2 O : MeOH : NH 4 OH(1 : 1 : 1 : 1)의 용매 조건에서 전개율은 0.50이었다. 이 두 전개 용매 조건에서 dCMP와 dCTP의 합성여부를 명확히 알 수 있었다.
- [32P] H3PO4용액 분석
원자력 연구소에서 생산된 [ 32 P] H 3 PO 4 의 생산과정에서 존재할 수 있는 다른 이온들은 주로 생산에 이용되는 표적물질, 표적 용기 및 첨가된 화학물질에 의해 나타날 수 있으며, 표지화합물을 제작하는 과정에서 방해 요인으로 작용할 수 있다. 따라서 표지화합물의 합성 시 [ 32 P] H 3 PO 4 의 화학적 순도를 확인하였다. 완전히 감퇴된 [ 32 P] H 3 PO 4 를 사용했으며 습식분석에 의한 음이온 분석과 ICP-AES를 이용한 양이온 분석하였다. 음이온 분석결과 Cl , CN , ClO 4 2− 가 존재하였으며 가장 많이 포함하는 이온은 Cl 이온임이 확인되었다. 양이온의 확인은 방사성 붕괴가 검출되지 않은 [ 32 P] H 3 PO 4 용액 1 ml을 20 배로 묽혀서 분석을 하였다. 그 결과 Na이 약 10 ppm, Ca이 4 ppm, Al이 4 ppm 그리고 Si 4 ppm으로 나타났다. 분석 결과 나타난 용액 속에 주로 존재하는 이온은 Cl 이온 및 Na + 이온이며 Cl 이온은 친핵치환 반응을 방해하지 않는 이탈기로 작용하므로 표지화합물 합성시 문제가 되지 않는다. 원자력연구소에서 생산되는 [ 32 P] H 3 PO 4 는 정제 없이 사용이 가능하다는 것이 확인되었다.
Analytical data of 10-fold diluted [32P] γ-ATP solution. Element-analysis is carried out with ICP-AES and anions are analyzed with spot test
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Analytical data of 10-fold diluted [32P] γ-ATP solution. Element-analysis is carried out with ICP-AES and anions are analyzed with spot test
- 표지화합물 [32P] γ-ATP(5)의 합성
사용한 [ 32 P] H 3 PO 4 는 2 mCi/1 ml로 HCl 수용액 상태였으며, 2 와 같은 과정으로 실험 조건에 따르는 합성수율의 변화는 다음 2 에 나타내었다. 3 차 증류수를 이용하여 5 배로 묽힌 후 실험을 한 결과로 수득율이 약 40%이었으며 [ 32 P] H 3 PO 4 을 묽히지 않고 반응 진행시 약 [ 32 P] γ-ATP의 수율은 60%이었다. 감압 증류하여 수분과 HCl을 제거하여 합성한 결과 수득율은 95% 이상이었다. 위 결과를 종합하면 [ 32 P] H 3 PO 4 순도 및 시약의 사용량에 따라 합성 수율의 변화가 나타났으며 수분의 함유량에 따른 수율의 변화는 가장 중요한 요소라고 할 수 있다. 최적조건의 합성방법은 건조시킨 [ 32 P] H 3 PO 4 를 이용하고 같은 당량의 전구체와 ATP, 2 당량의 질산은, 5 당량의 이염화구리를 사용한 실험 4 조건이었다. 합성된 [ 32 P] γ-ATP의 라디오 크로마토그램은 . 3 와 같으며 표지수율은 97%로 재연성이 있는 결과를 얻었다.
Preparative conditions of [32P] γ-ATP and its yield. [32P] γ-ATP is identified by Radio TLC scanning
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Preparative conditions of [32P] γ-ATP and its yield. [32P] γ-ATP is identified by Radio TLC scanning
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Radio TLC Scanning chromatogram of [32P] γ-ATP with n-buOH : EtOH : H2O : NH3 (1:1:1:1) as eluents Free Phosphoric acid([32P] H3PO4) and [32P] γ-ATP are identified in Rf = 0.1 and 0.54.
- 표지화합물 [32P] α-dCTP(8)의 합성
3 과 같은 과정의 [ 32 P] α-dCTP의 합성은 [ 32 P] dCMP의 합성과 짝지움 시약을 이용한 인산화로 진행된다. 사용한 [ 32 P] H 3 PO 4 는 3 mCi/1 ml의 HCl 수용액 상태였으며 합성에 필요한 반응용기는 14/20 joint가 붙은 시험관을 제작하여 사용하였다. [ 32 P] dCMP의 합성은 수분에 큰 영향을 받는다. [ 32 P] H 3 PO 4 의 수용액의 수분을 1회 제거 시 10~30%, 3회 제거 시 40~55%의 [ 32 P] dCMP의 수득율이 나타났다( 3 . . 4 ). 특히, 과량의 트리에틸아민을 사용할 경우 수득율이 낮은 것을 확인하였다. 최적 합성조건은 3회 건조시킨 [ 32 P] H 3 PO 4 를 사용하고 반응에 참여 하지 않은 트리에틸아민을 제거할 경우이다. 합성한 [ 32 P] dCMP는 sep-pak 카트리지를 이용하여 분리하였으며 짝지움 시약을 이용한 [ 32 P] α-dCTP의 합성은 ATP 합성조건과 동일하게 진행하였다. 라디오 크로마토그램으로 확인한 결과 [ 32 P] α-dCTP( 8 )의 표지 수율이 65%이었으며( . 5 ), 전 합성과정에 따르는 표지 수율은 약 40% 이었다. [ 32 P] α-dCTP( 8 )의 합성은 [ 32 P] dCMP 합성과정이 가장 큰 영향을 주고 있음을 확인하였다.
Preparative conditions of [32P] α-dCMP and its yield. [32P] α-dCMP is identified by Radio TLC scanning
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Preparative conditions of [32P] α-dCMP and its yield. [32P] α-dCMP is identified by Radio TLC scanning
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TLC Scanning chromatogram of prepared [32P] dCMP. (Distance from solvent front : 80 mm, Eluents; C3H7OH : H2O : NH4OH=55 : 20 : 25, Radio chemical yield: 55%) : Free Phosphoric acid([32P] H3PO4) and [32P] dCMP are identified in Rf = 0.1 and 0.55.
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TLC Scanning chromatogram of prepared [32P] α-dCTP. (Distance from solvent front : 90 mm, Eluents; n-buOH : H2O : MeOH : NH4OH=1:1:1:1, Radio chemical yield: 65%) : [32P] α-dCTP was prepared using sep-pak filtered [32P] dCMP. Free Phosphoric acid([32P] H3PO4) and [32P] α-dCTP are identified in Rf = 0.1 and 0.50.
실 험
- 시약 및 기기
방사성 동위원소 P-32는 한국원자력 연구소에서 생산된 [ 32 P] H 3 PO 4 를 이용하였으며, 1-chloro-8-hydroxyquinoline, phenyl disulfide와 adenosine 5'-monophosphate은 Acrose사의 제품을, 질산은, 이염화구리(CuCl 2 ), H 3 PO 4 는 Aldrich사의 제품을, 그 밖의 반응 용매들은 Aldrich 및 Merck사의 특급시약을 이용하였다. 방사성 동위원소를 이용한 실험을 위해 반응 초자 기구는 Aldrich사의 KONTES MICROSCALE GLASSWARE KIT를 이용하여 간이 반자동합성장치를 제작하여 사용하였다. 합성 확인에 사용한 TLC는 Merck사의 Silica gel 60 F 254 를 이용하였으며 발색 기구 및 시약으로는 UV-램프 및 I 2 를 이용하였다. IR은 Bomen 100 FT-IR Spectrophotometer를, NMR은 Varian사의 Gemini 200을 이용하였으며 질량분석은 고려대학교 기초과학지원센타의 고성능액체 크로마토그래피/질량분석기(FAB)를 이용하였다. 라디오크로마토그램은 Bioscan사의 System 200 imaging scanner와 AC-3000을 이용하였다. 양이온 분석을 위해 GBC Scientific Equipment Pty Ltd사(GBC Integra XMZ-Australia)의 ICP-AES를 사용했다.
- 5-Chloro-8-quinolyl phosphate (2)의 합성
질소 조건에서 피리딘과 1,4-다이옥산 동량의 혼합 용매(30 ml)에 POCl 3 3.11 ml를 녹인 후 1,4-다이옥산 10 ml에 용해시킨 5-chloro-8-hydroxy quinoline을 0 ℃에서 소량씩 첨가한다. 5시간 동안 교반시킨 후 필터한 후 용액을 감압 증류하고 피리딘과 물(1 : 1) 혼합용액 10 ml를 0 ℃에서 천천히 첨가한다. 용매를 감압 증류한 후 아세토나이트릴과 물(1 : 1) 혼합용액을 이용하여 1차 침전물을 얻었으며 아세토나이트릴을 이용하여 2차 재결정하여 수득율이 63%(1.8 g)인 화합물 ( 2 )(5-chloro-8-quinolyl phosphate)를 얻었다.
TLC ( n -buOH : MeOH : H 2 O : NH 4 OH=1 : 1 : 1 : 0.5): R f = 0.25. mp=127. 1 H NMR (DMSO): δ=9.02(dd; 1 H, Ar-H), 8.55(dd; 1 H, Ar-H), 7.73(m; 3 H, 3Ar-H), 5.32 (broad; 2 H, 2 P-OH) MS(FAB, M + +1): C 9 H 7 ClNO 4 P cald. for 259.98 found 260.07.
- O-8-(5-chloroquinolyl) S-phenyl phosphorothiate (3)의 합성
질소 분위기에서 1 g(3.86 mmol)의 화합물 ( 2 )를 3 ml의 피리딘과 15 ml의 아세토나이트릴 용매에 첨가한다. 실온에서 2.1 g(9.65 mmol)의 페닐다이설파이드(phenyldisulfide)를 넣고 4.8 ml(19.30 mmol)의 삼부틸포스핀(tributylphosphine)을 천천히 가한다. 1시간 반응 뒤 용매를 제거한 후 클로로포름용액을 이용하여 유기물을 추출한다. 생성 혼합물을 다이클로로메탄에 녹인 후 아세토나이트릴과 0.88 ml (7.72 mmol)의 사이클로헥실아민을 첨가하여 -20 ℃에서 재결정시켜 연한 노란빛을 띠는 백색결정의 생성물을 합성하였으며, 수득율은 68%(1.18 g)이었다.
TLC(MC :MeOH, 7 : 3): R f =0.65. 1 H NMR(CD 3 OD): δ=8.86(dd; 1 H, quinoline-H), 8.67(dd; 1 H, quinoline-H), 7.89(dd; 1 H, quinoline-H), 7.69(q; 1 H, quinoline-H), 7.65(d; 1 H, quinoline-H), 7.40(m; 2 H, 2Ar-H), 7.20(m; 1 H, Ar-H), 7.13(m; 1 2H, 2Ar-H), 5.32(broad; 2 H, 2 P-OH). MS(FAB, M + +1): C 21 H 24 ClN 2 O 3 PS cald. for 451.09 found 451.20.
- 비교물질 ATP(5)의 합성
동량의 1-메틸피롤리돈(MPD)과 헥사메틸포스포아마이드(HMPA) 혼합 용매 6 ml에 100 mg(0.22 mmol)의 화합물 ( 3 )과 77 mg(0.22 mmol)의 AMP(Adenosine monophosphate)를 첨가하여 10분 간 교반한 후 45 mg(0.26 mmol)의 질산은을 넣어 30분 간 반응을 진행한다. 합성된 화합물( 4 )는 분리하지 않고 연속하여 38 μl(0.66 mmol)의 인산과 150 mg(1.1 mmol)의 이염화구리(CuCl 2 )를 첨가 후 12시간 동안 반응을 진행시켰다. 합성된 ATP는 TLC를 이용하여 확인하였다.
TLC ( n -buOH : MeOH : H 2 O : NH 4 OH= 1 : 1 : 1 : 1): R f =0.54.
- 비교물질 dCMP 및 dCTP의 합성
질소 분위기하에서 30(0.5 mmol)의 인산에 아세토나이트릴을 첨가하고 감압 증류를 2회 진행한다. 1 ml (7 mmol)의 트리에틸아민을 첨가하여 감압 증류한 뒤 200 μl의 아세토나이트릴을 첨가한다. 다른 반응용기에 20 mg(0.08 mmol)의 데옥시시티딘(deoxycytidine monohydrate)을 넣은 후 아세토나이트릴을 이용하여 수분을 제거한다. 200 μl의 DMSO와 100 μl(1 mmol)의 삼염화아세토나이트릴(CCl 3 CN)를 첨가하고 교반 후 인산이 들어있는 반응용기에 옮겨 40 ℃에서 30분 간 방치한다. 합성된 화합물 ( 6 )은 시판하는 dCMP와 TLC로 비교하였다. 생성 혼합물 ( 6 )을 감압 증류하여 한 뒤 1-메틸피롤리돈과 헥사메틸포스포아마이드의 1 : 1 혼합 용매 4 ml 를 첨가한 후 45 mg(0.26 mmol)의 질산은과 100 mg(0.22 mmol)의 화합물 ( 3 )을 첨가하고 30분간 교반시킨다. 계속하여 30 μl(0.5 mmol)의 인산과 100 mg(0.73 mmol)의 이염화구리를 첨가한 후 상온에서 12시간 반응을 진행한다. 합성된 dCTP는 시제품과 TLC비교를 하여 확인하였다.
TLC (C 3 H 7 OH:H 2 O:NH 4 OH=11:4:5): dCMP (R f =0.55), dCTP (R f =0.35)
TLC ( n -buOH : MeOH : H 2 O : NH 4 OH=1 : 1 : 1 :1): dCTP (R f =0.50)
- 표지화합물 [32P] γ-ATP(5)의 합성
β선 차폐제로서 10 mm 아크릴 판을 이용하였으며 제작된 Microscale vial를 이용하여 합성을 진행하였다. 0.9 ml의 1-MPD와 0.3 ml의 HMPA 의 용매에 13 mg(0.029 mmol)의 화합물 ( 3 )과 10 mg(0.029 mmol)의 AMP 을 첨가하고 10분 간 교반시킨 후 10 mg(0.058 mmol)의 질산은을 첨가하여 30분간 교반시킨다. 아세토나이트릴을 이용한 불변혼합 증류를 통해 2회 건조시킨 0.2 mCi의 [ 32 P] H 3 PO 4 에 위 혼합용액을 섞은 후 19 mg(0.14 mmol)의 이염화구리를 첨가하고 3 시간 교반하여 [ 32 P] γ-ATP( 5 )를 합성하였다. 합성확인 및 표지 수율은 라디오크로마토그램을 이용하였다.
TLC ( n -buOH : MeOH : H 2 O :NH 4 OH=1 : 1 : 1 : 1): R f =0.54. Radiochemical yield: 95%.
- 표지화합물 [32P] dCMP(6)의 합성
10 mm 아크릴 판으로 β선 차폐한 조건에서 14/20 연결고리가 달린 시험관에 0.3 mCi (100 μl) [ 32 P] H 3 PO 4 를 취한다. 100 μl의 트리에틸아민을 첨가 하고 1 ml 의 아세토나이트릴을 이용하여 30 ℃ 조건에서 3회 감압 증류하고 고무마개로 밀봉시킨다. 다른 반응용기에 20 mg(0.08 mmol)의 데옥시시티딘(deoxycytidine monohydrate)을 넣은 후 100 μl의 DMSO와 3 μl의 삼염화아세토나이트릴(CCl 3 CN)를 첨가하고 교반 후 밀봉된 인산용기에 옮겨 40 μl 조건에 30분간 방치한다. 합성확인 및 표지 수율은 라디오크로마토그램을 이용하였다.
TLC (C 3 H 7 OH : H 2 O : NH 4 OH=11 : 4 : 5): R f = 0.55. Radiochemical yield: 55%.
- 표지화합물 [32P] α-dCTP(8)의 합성
화합물 ( 6 )를 sep-pak 분리 후 동량의 1-메틸피롤리돈과 헥사메틸포스포아마이드 4 ml를 첨가한다. 13 mg의 화합물 ( 3 )을 첨가한 후 10 mg의 질산은을 첨가 후 30분간 교반시킨다. 계속하여 30 μl(0.5 mmol)의 인산과 100 mg(0.73 mmol)의 이염화구리를 첨가한 후 3시간 동안 반응하여 [ 32 P] α-dCTP를 합성하였다.
TLC ( n -buOH : MeOH : H 2 O :NH 4 OH=1 : 1 : 1 : 1): dCTP (R f = 0.50). Radiochemical yield: 65%.
결 론
O-8-(5-chloroquinolyl) S-phenyl phosphorothiate의 총 합성수율은 42%이었으며 합성 확인은 NMR, IR, TLC를 이용하였다. 화합물 (3)을 이용한 [ 32 P] γ-ATP의 합성은 최적 조건하에서 95% 이상의 높은 표지 수율을 얻었으며 총 합성 시간은 4시간이 소요되었다. [ 32 P] α-dCTP의 합성은 총 합성 수율은 약 35-40% 정도였다. 합성 시간은 총 6시간이 소요되었다. 화학적 합성을 통한 P-32 표지화합물의 제작은 [ 32 P] γ-ATP(위치 표지)의 경우 높은 수득율을 얻었으며, [ 32 P] α-dCTP (α위치 표지)의 합성은 [ 32 P] dCMP 합성에 크게 의존하며 Sep-pak 분리 시 손실이 있었다. 이와 같은 합성법은 기존 효소반응과 비교하여 반응시간이 짧게 소요된다. 특히, [ 32 P] γ-ATP의 경우 경제성과 효율성이 좋다고 판단되며 대량생산체계가 가능하다고 사료된다.
본 연구는 원자력연구개발과제 중 하나로 이용 연구지원사업의 지원에 의해 수행되었으며, 연구 수행에 도움을 준 원자력의학원 싸이크로트론응용연구실에 감사의 글을 드립니다.
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