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Effect of Ohmae-hwan and Mume Fructus on DSS-Induced Inflammatory Bowel Dise v vvgase in a Mice Model System
Effect of Ohmae-hwan and Mume Fructus on DSS-Induced Inflammatory Bowel Dise v vvgase in a Mice Model System
The Journal of Korean Oriental Internal Medicine. 2015. Sep, 36(3): 284-296
Copyright © 2015, The Korean Society for Oriental Internal Medicine
  • Received : August 03, 2015
  • Accepted : September 30, 2015
  • Published : September 30, 2015
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의수 김
민구 신
태련 김
만호 신
영수 이

Abstract
Objectives:
The purpose of this study was to examine the effects of Ohmae-hwan (OMH) and Mume Fructus (MF) on inflammatory bowel disease (IBD).
Methods:
Mice were divided into 4 groups: a normal group, control group, MF group, and OMH group. Three groups, excluding the normal group, were fed a 5% solution of dextran sulfate sodium (DSS) in water for 10 days to induce inflammatory bowel disease. From the fourth day of DSS treatment, the control group was given distilled water only, the MF group was given MF powder in distilled water, and the OMH group was given dried OMH extract powder in distilled water for 7 days.
Results:
For each animal, changes in body weight, colon length, and component levels in blood and colon tissues after each treatment were noted. The weight in the control group and MF group decreased slightly compared with that in the OMH group, and the colon length in the MF group and OMH group was more than that in the control group. TNF-α and WBC were decreased in both the MF group and the OMH group. RBC was increased in the OMH group, like in the normal group, compared with the control group and MF group. Hb and PLT of each group were not significantly different. Regarding changes in the colon tissues, both the MF group and OMH groups recovered similar to the normal group.
Conclusions:
Thus, treatment with OMH and MF seems to be effective against inflammatory bowel disease, and OMH is likely to increase body weight and induce RBC recovery better than MF.
Keywords
I. 서 론
염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)은 소장 및 대장부위의 만성적인 염증으로 인한 혈변, 설사, 복통, 구토, 체중감소 등이 주증상인 질환으로 1 , 현재까지 원인불명이나 장내 미생물의 불균형 및 면역반응의 조절이상으로 추정되고 있다 2 .
통계청 자료 3 에 따르면 감염성 기원이라고 추정되는 설사 및 위장염, 기타 장관 감염성 질환, 크론병 및 궤양성 대장염으로 병원치료를 받은 횟수가 2004년 3,129,707회에서 2012년 5,218,879회로 급격히 증가되고 있는 실정이다. 그러나 현재 염증성 장질환에 사용 중인 치료제들은 완치가 어렵고, 장기간 사용 시 부작용이 있으므로 4,5 향후 유효성과 안정성이 높은 새로운 치료제 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
한의학에서는 염증성 장질환을 腸澼, 便血, 腸風, 臟毒, 休息痢, 久瀉 등의 범주로 분류하고 6 , 健脾益氣 疏肝理氣 化濕止瀉 淸熱利濕, 行氣活血시키기 위하여 蔘笭白朮散, 生脈散加味, 四神丸, 白頭翁湯, 膈下逐於湯 등의 처방을 활용하고 있다 7 .
최근 염증성 장질환에 대한 실험 연구로는 導赤地楡湯 8 , 黃連解毒湯 9 , 烏梅丸 12 등의 복합처방과 生薑 10 , 薏苡仁 11 , 매실 13 등 단미제들의 효과가 보고되고 있으며, 특히 Liu 등 12 은 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)로 유발된 烏梅丸의 염증성 장질환에 대한 치료기전을 제시했고, 김 등 13 은 매실 혼합물이 IgA, IgE의 수치를 낮추고, 체중을 늘리며, T-림프구를 증가시켜 염증성 장질환에 효과적이라고 보고하였다.
예로부터 민간에서 복통 및 설사에 흔히 사용되어 오던 매실은 장미과(薔薇科, Rosaceae)에 속한 낙엽소교목인 매실나무( Prunus mume Seib. et Zucc.)의 果核이고 14 , 烏梅는 매실나무의 덜 익은 열매를 연기를 쪼여 훈증시킨 것으로 한국, 중국 및 일본에 주로 분포하고 있으며, 斂肺止咳, 澁腸止瀉, 生津止渴, 安蛔, 固崩止血의 용도로 이용되었다 15 . 烏梅가 포함된 처방들 중 대표적인 烏梅丸은 ≪金匱要略≫ 16 에 吐蛔 및 久痢를 치료한다고 기재되어 있다. 그러나, 현재까지 염증성 장질환에 대한 오매환과 오매의 효능차이에 대한 비교실험 연구가 없었으며, Dextran Sulfate Sodium(DSS)로 궤양성 대장염을 유발한 실험이 없었던바 이에 저자는 烏梅 단독제제와 烏梅丸을 염증성 장질환 유발 동물모델에 경구 투여하여 체중 변화, 대장 길이 변화, cytokine(TNF-α, IL-10) 및 CBC(WBC, RBC, Hb, PLT) 변화, 조직학적 변화 등을 비교 분석하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
III. 실험방법
- 1. 재 료
- 1) 동 물
본 실험에 사용한 실험동물은 7주령의 체중 30±5 g 내외의 웅성 ICR계 생쥐를 실험동물 전문회사인 (주)샘타코에서 구입하여 사용하였다. 구입하기 전 동신대학교 실험동물윤리위원회의 승인(승인번호 : 2014-09-06-02)을 획득하였다. 구입한 생쥐는 1주일간 항온항습 장치가 구비된 사육장(실내온도 24±2 ℃, 습도 55±5%, 12시간 명암주기)에서 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 적응시킨 후 사용하였다.
- 2) 약 재
본 실험에 사용된 烏梅丸(Ohmaehwan, OMH)의 구성약재와 烏梅( Mume Fructus , MF)는 모두 동신대학교 광주한방병원에서 구입한 것을 정선하여 사용하였다. OMH는 ≪金匱要略≫ 16 을 기준으로 선정 및 포제하였다. 구체적인 처방 내용은 Table 1 과 같다.
Prescription ofOhmae-hwan
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Prescription of Ohmae-hwan
- 2. 방 법
- 1) 시료의 제조
OMH을 1,500 ml의 증류수와 전기약탕기(Daewoong, Korea)를 이용하여 2시간 동안 전탕한 후 추출액을 얻었으며, MF는 200 g을 같은 방법을 통해 전탕한 후 추출액을 얻었다.
이렇게 추출한 액을 원심분리기(Eppendrof, Germany)에서 5,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 찌꺼기를 제거한 후 감압 농축기(Eyela, Japan)에서 감압 농축하여 OMH는 39.2 g(수득률 15.43%), MF는 40 g(수득률 20%)의 분말을 얻었다. 이렇게 얻은 동결건조분말을 500 mg/kg/day 비율로 실험군에 투여하였다.
- 2) 실험군 분류 및 약물 투여
실험군은 정상군(normal group, 이하 NG, n=10), 대조군(control group, 이하 CG, n=11), 烏梅 투여군(MF group, 이하 MFG, n=11), 烏梅丸 투여군(OMH group, 이하 OMHG, n=11)으로 총 4개 군으로 구분하였다. CG, MFG, OMH에서 예상치 못한 죽음 등을 대비해 1마리씩 늘려서 실험하였는데, 실험 중 CG에서 1마리가 죽어버려 결과는 1마리 누락시키고 도출하였다. 실험도중 NG는 실험기간 동안 DSS가 포함되지 않은 음료와 정상적인 사료를 섭취케하여 기타 아무런 처치를 하지 않은 군으로 설정하고, CG는 DSS가 포함된 수용액을 섭취케 하고 약물 대신 증류수를 투여한 군으로 설정하였다. MFG는 DSS를 투여한 후 MF 전탕액을 500 mg/kg 농도로 1일 1회 zonde를 이용하여 경구투여 하였으며, OMHG는 DSS를 투여한 후 OMH 전탕액을 500 mg/kg 농도로 1일 1회 zonde를 이용하여 경구투여 하였다. 투여기간은 1주일 순화 후 NG를 제외한 나머지 실험군에 DSS를 3일간 투여하여 대장염 유발 확인 후 4일째부터 7일간 DSS와 함께 CG에는 증류수를, MFG에는 MF 전탕액을, OMHG에는 OMH 전탕액을 경구투여 하였다. DSS투여 후 11일째 생쥐를 희생시켰다.
- 3) 대장염 유발
대장염 병태모델 유발은 Dextran Sulfate Sodium(DSS, Sigma, U.S.A.)을 투여하는 방법을 이용하였다. DSS에 의한 유발방법은 기존 DSS를 유발한 방법 17 을 참고하여 1주간 사육장에서 순화시켰던 ICR계 군들 중 NG를 제외한, CG, MFG 및 OMHG에게 5%(w/v) DSS가 함유된 물에 넣어 음용수로 10일 동안 자유롭게 섭취하게 하여 대장염을 유발하였다. DSS를 투여한 군들은 설사 및 혈변을 관찰할 수 있었고, 식사량 감소등을 확인할 수 있었다. MFG와 OMHG에서는 설사 및 혈변량이 감소하고 식사량이 증가하는 것 또한 확인할 수 있었으나, 정확한 양을 파악하지는 못하였다.
- 4) 체중 측정
DSS 투여 및 시료의 투여에 따른 체중을 변화를 관찰하기 위하여 실험기간 동안 생쥐의 체중을 DSS 투여 후 2일에 한 번씩 오전 10시에 총 4회에 걸쳐 측정하였다.
- 5) 대장의 길이 측정
염증 등의 영향으로 변화된 대장의 길이를 측정하기 위해 모든 실험이 끝난 후 생쥐를 희생시키고 개복한 후 대장을 적출하였으며, 이중 맹장에서 항문까지의 길이를 vernier caliper(Mitutoyo, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 6) Cytokine(TNF-α, IL-10) 측정
모든 실험을 마친 후 생쥐에서 채혈된 혈액을 plastic tube에 담아 실온에 30분 정도 방치하였다가 3,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 얻어진 혈청으로 ELIZA kit를 활용하여 TNF-α(invitrogen KMC3011, U.S.A.), IL-10(invitrogen KMC3011, KMC0101, U.S.A.)를 측정하였다.
TNF-α는 각각의 96 well plate에 혈청 및 standards를 100 μl를 넣었으며, IL-10의 측정은 혈청 50 μl를 standard diluent buffer 50 μl 와 혼합한 solution 100 μl을 96 well plate에 분주한 다음 incubation한 후 washing buffer로 세척한 후 Microplate Reader를 이용하여 450 nm 파장에서 측정하였다.
- 7) CBC 측정
WBC, RBC, Hb, PLT 측정은 모든 실험을 마친 후 심장 천자를 통해 채혈한 혈액을 EDTA bottle minicollect tube 0.5 ml(greiner bio-one, Austria)에 넣은 후 전자동 혈구분석기 Hemavet 950(Drew scientific Inc, U.S.A.)을 사용하여 분석하였다.
- 8) 조직학적 관찰
실험을 마친 대장내부의 조직을 관찰하기 위해 H & E 염색(Hematoxylin & Eosin stain)을 시행하였다. 희생시킨 생쥐의 대장 조직 중 말단부위를 적출한 다음 10% 포르말린에 고정하고 이를 파라핀에 포매한 후 미세절단기(Sakura, Japan)를 이용하여 박절하고 슬라이드에 부착시켰다. 이 후 탈수와 투명 과정을 거쳐 흐르는 물에 침전시키고 파라핀을 제거한 후 조직 절편을 Hematoxylin과 Eosin으로 염색하고 100배율의 광학현미경(Nikon Eclipse 80i, Japan)으로 관찰하였다.
- 3. 통계 처리
수집한 테이터의 통계 처리는 통계프로그램 IBM SPSS Statistics(Ver. 21)을 사용하였다. 데이터는 one-way ANOVA 방법을 사용하여 통계적 유의성을 검증하였고 통계적으로 유의한 경우 사후검정은 Tukey 방법을 시행하였다. 통계적 유의성은 p-value가 0.05 미만인 경우 유의한 것으로 인정하였다.
III. 성 적
- 1. 체중 변화에 미치는 영향
체중변화를 측정한 결과 NG에 비해 실험군들에서 체중증가가 감소된 것을 관찰할 수 있었으나 실험군들 사이에서는 유의한 차이가 보이지 않았다. 그러나 CG와 MFG는 6일째와 8일째를 비교하면 감소하는 경향을 보인 반면 OMHG는 실험 종료시까지 다소 완만하지만 증가하는 경향을 보였다( Table 2 , Fig. 1 ).
The Changes of Body Weight on DSS-induced Inflammatory Bowel Disease
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NG : no treatment group, CG : D/W administration with DSS group, MFG : Mume Fructus administration with DSS group, OMHG : OMH administration with DSS group Values were expressed as mean and SD of 10 (NG, CG) or 11 (MFG, OMHG) experiments.
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The changes of body weight on DSS-induced inflammatory bowel disease.

NG : no treatment group, CG : D/W administration with DSS group, MFG : administration with DSS group, OMHG : OMH administration with DSS group

- 2. 대장 길이에 미치는 영향
대장의 길이는 통계적으로 군 간에 유의한 차이를 보였으며 사후검정 결과 CG에 비해 MFG(P=0.042)와 OMHG(P=0.039) 모두 유의하게 대장의 길이가 증가되었다( Table 3 , Fig. 2 , 3 ).
The Changes of Colon Length on DSS-induced Inflammatory Bowel Disease
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NG : no treatment group, CG : D/W administration with DSS group, MFG : Mume Fructus administration with DSS group, OMHG : OMH administration with DSS group Values were expressed as mean and SD of 10 (NG, CG) or 11 (MFG, OMHG) experiments. * : Statistically significance compared with CG (* ; P<0.05).
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Colon length on DSS-induced inflammatory bowel disease.

Colon length were measured using vernier caliper at the end of the day. (A) : NG, (B) : CG, (C) : MFG, (D) : OMHG

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The changes of colon length on DSS-induced inflammatory bowel disease.

NG : no treatment group, CG : D/W administration with DSS group, MFG : MF administration with DSS group, OMHG : OMH administration with DSS group. Values are represented as mean±SD of 10 (NG, CG) or 11 (MFG, OMHG) experiments.

- 3. Cytokine에 미치는 영향
- 1) TNF-α 농도의 변화
TNF-α의 농도는 통계적으로 군 간에 유의한 차이를 보였으며 사후검정 결과 CG에 비해 MFG(p<0.01)와 OMHG(p<0.05)에서 모두 유의성 있게 감소하였다( Table 4 , Fig. 4 ).
The Change of TNF-α Level on DSS-induced Inflammatory Bowel Disease
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NG : no treatment group, CG : D/W administration with DSS group, MFG : Mume Fructus administration with DSS group, OMHG : OMH administration with DSS group Values were expressed as mean and SD of 10 (NG, CG) or 11 (MFG, OMHG) experiments. ** : Statistically significance compared with CG (* ; P<0.01). * : Statistically significance compared with CG (* ; P<0.05).
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The change of TNF-α level on DSS-induced inflammatory bowel disease.

NG : no treatment group, CG : D/W administration with DSS group, MFG : administration with DSS group, OMHG : OMH administration with DSS group

- 2) IL-10 농도의 변화
IL-10의 농도를 측정한 결과, CG와 비교한 실험군들에서는 유의한 차이가 나타나지는 않았다( Table 5 , Fig. 5 ).
The Change of IL-10 Level on DSS-induced Inflammatory Bowel Diseas
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NG : no treatment group, CG : D/W administration with DSS group, MFG : Mume Fructus administration with DSS group, OMHG : OMH administration with DSS group Values were expressed as mean and SD of 10 (NG, CG) or 11 (MFG, OMHG) experiments.
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The change of IL-10 level on DSS-induced inflammatory bowel disease.

NG : no treatment group, CG : D/W administration with DSS group, MFG : administration with DSS group, OMHG : OMH administration with DSS group

- 4. CBC에 미치는 영향
- 1) WBC의 변화
WBC를 측정한 결과 CG는 NG에 비해 큰 폭으로 상승하였으나 사후검정 결과 MFG와 OMHG는 모두 CG에 비해 유의하게 감소하였다( Table 6 , Fig. 6 ).
The Change of WBC Level on DSS-induced Inflammatory Bowel Disease
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NG : no treatment group, CG : D/W administration with DSS group, MFG : Mume Fructus administration with DSS group, OMHG : OMH administration with DSS group Values were expressed as mean and SD of 10 (NG, CG) or 11 (MFG, OMHG) experiments.
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The change of WBC level on DSS-induced inflammatory bowel disease.

NG : no treatment group, CG : D/W administration with DSS group, MFG : administration with DSS group, OMHG : OMH administration with DSS group

- 2) RBC의 변화
RBC를 측정한 결과 CG와 MFG에 비해 OMHG에서 NG와 유사하게 증가하였다( Table 7 , Fig. 7 ).
The Change of RBC Level on DSS-induced Inflammatory Bowel Disease
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NG : no treatment group, CG : D/W administration with DSS group, MFG : Mume Fructus administration with DSS group, OMHG : OMH administration with DSS group Values were expressed as mean and SD of 10 (NG, CG) or 11 (MFG, OMHG) experiments.
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The change of RBC level on DSS-induced inflammatory bowel disease.

NG : no treatment group, CG : D/W administration with DSS group, MFG : administration with DSS group, OMHG : OMH administration with DSS group

- 5. 조직학적 변화
DSS 투여 및 시료의 투여가 대장 점막에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 희생시킨 생쥐의 대장 조직을 적출한 후 H&E로 염색하고 이를 관찰하였다. 그 결과 CG에서는 대장 점막조직의 훼손이 현저하게 관찰되었고 혈변도 관찰되었으나 MFG와 OMHG는 NG수준으로 점막층이 재생되어 있는 것이 관찰되었다( Fig. 10 ).
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Effects of CP on histopathological changes of colon tissue on DSS-induced inflammatory bowel disease.

Colon tissues were stained with hematoxylin and eosin and observed light microscope (X100).

IV. 고 찰
염증성 장질환이란 장에 원인불명의 염증이 만성적으로 일어나는 질환으로 넓은 의미에서 세균성 장염, 아메바성 이질, 결핵성 장염, 베체트 장염, 허혈성 장염, 방사선 조사 후 장염 등 모두를 의미하지만 일반적으로 궤양성 대장염과 크론병을 의미한다 2 .
궤양성 대장염이란 주로 대장, 특히 직장의 점막과 점막하층을 침범하는 특발성, 비특이성 염증성 질환이다. 발병 원인은 명확하게 밝혀지지 않았고, 면역병리학적 기전과 심리학적 원인이 관여한다고 추정되어진다. 임상증상으로는 특발성 혹은 반복성 혈변, 잠혈의 현병력 또는 기왕력이 있는 것으로, 하혈, 설사 복통, 발열, 체중감소 등이 자주 나타나는 것이 특징이다 18 . 1980년대 이전까지는 매우 드문 질환이었으나, 최근 그 발병률이 급격하게 증가하고 있다. 아직 서양에 비해서는 발병률이 낮은 편이지만, 서구화된 식생활 및 생활패턴 등의 원인으로 향후 증가할 것으로 예측된다 19 .
크론병이란 만성 염증성 장질환으로 위장관의 어느 부위라도 침범할 수 있다. 주로 소장 및 회장 말단부와 결장에 자주 발생하지만 구강에서 항문까지 전체 소화기계에 나타날 수 있다. 진단은 임상증상과 더불어 내시경적 소견, 영상의학적 소견 또는 조직소견에서 비건락 육아종이 보여야 하나, 장결핵 및 다른 염증성 장질환들과 감별은 쉽지않다 20 .
현재 사용중인 치료제는 sulfasalazine, mesalazine 등의 aminosalicylate 제재, steroid 제재가 있으며, steroid 치료에 반응하지 않는 경우, azathioprine, 6-mercaptopurine, cyclosporin 등의 면역억제제도 사용되고 있으나 완치를 기대할 수 있는 약물은 없다 4 . 또한 이러한 약제로 질병이 완화된 경우에도 다시 쉽게 악화가 되기 때문에 sulfasalazine이나 mesalazine 등의 관해 유도 효과가 증명된 약제를 장기간 투여하여 재발을 방지해야 하는 경우도 흔하다. 그러나 이러한 장기간의 투여는 여러 부작용을 야기하는데, 구역, 구토, 소화불량, 식욕부진, 두통 등의 흔한 부작용에서부터 과민 반응에 의한 피부발진, 발열, 췌장염, 간염, 용혈성 빈혈, 골수 억제 등의 심한 부작용까지 발생할 수 있고, 약물에 대한 내성이 발생하는 경우도 있다 5 . steroid치료 역시 장기간 사용은 심한 부작용을 야기하고 있는 실정이다 21 .
이에 따라 최근 다양한 약제들에 대한 염증성 장질환 동물모델에 대한 실험적 연구가 보고되고 있다. 導赤地楡湯 8 , 黃連解毒湯 9 등 복합처방들과 生薑 10 , 薏苡仁 11 등의 한약재 및 천연물들의 효과 또한 보고되었다.
오매는 장미과(薔薇科, Rosaceae)에 속한 낙엽소교목인 매실나무 Prunus mume Seib. et Zucc.의 미성숙한 과실을 매연에 훈증하고 건조한 것이다 8 . ≪東醫寶鑑≫ 6 에는 “性煖, 味酸, 無毒. 去痰, 止吐逆, 止渴, 止痢, 除勞熱骨烝, 消酒毒”이라 기재되어 있다. 껍질과 단단한 씨로 이루어지고 과육이 약 80%, 씨가 20%정도이다. 성분은 수분 85%, 당분 10%, citric acid, nalic acid, oxalic acid 및 picric acid 등의 유기산 5%로 구성된다. picric acid는 살균작용이 알려져 있다 14-15 . 烏梅는 구충효과, 평활근이완효과, 향균효과, 항피로효과, 항방사능효과, 항노화 효과 등의 약리효과가 알려져 있다 15 .
烏梅丸은 ≪金匱要略≫ 16 에서 처음 기재된 처방으로 烏梅三百枚 細辛六兩 乾薑十兩 黃連十六兩當歸四兩 附子六兩(炮去皮) 蜀椒四兩(出汗) 桂枝六兩(去皮) 人參六兩 黃柏六兩으로 구성되어 있으며 厥陰病으로 전변하여 脈은 沈弦하고 急하며 열이 나고 때때로 두려워하며 가슴이 답답하고 구역감이 있으며 회충을 토하는 자는 마땅히 烏梅丸을 써야하고, 또한 오래된 泄瀉에 쓴다고 하였다. ≪東醫寶鑑≫ 6 에는 蟲門의 蛔厥吐蟲에 기재되어 있는데, 약제를 가루내어, 식초에 담갔던 烏梅肉과 함께 반죽하고, 아주 고르게 찧어서 오자대 크기로 환을 만든 것을, 미음으로 10~20알씩 먹는다고 하였다. ≪方藥合編≫ 22 에는 溫腸安蛔하는 효능이 있어 蛔厥로 인한 煩悶嘔吐, 腹痛이 시시로 발생하고 飮食이 들어가면 구토하거나 蛔蟲을 吐하는 경우와, 口渴, 四肢厥冷과 久瀉久痢에 쓴다고 하였다.
민간에서 흔히 배가 아프고 설사할 때 매실을 이용한 음식을 먹는다. 그러나 그 효과와 다른 처방들과의 차이를 나타내는 논문이 없는 실정이다. 또한 최근 염증성 장질환에 대한 다양한 연구가 시도되고 있고, 염증성 장질환에 효과가 있는 烏梅丸과 매실 혼합물에 대한 실험적 연구는 있었지만 12,13 , 기존 연구에 사용된 오매환은 중국의 국가 식품 의약품 안전청에 의해 승인받은 환제로 Tongrentang에서 구입하여 사용하였는데 약제들의 구성이 다소 ≪金匱要略≫ 16 과 다르다. 이에 저자는 ≪金匱要略≫ 16 에 근거한 약제를 선택하여 포제한 후 烏梅丸 탕약을 만들어 오매와 비교하였다. 원방에서는 桂枝를 去皮하여 사용하라 했지만 금궤요략에 쓰인 약제는 육계로 추정되기에 肉桂로 교체 후 去皮하였다. 또한 黃連의 양을 244 g에서 224 g으로 낮추고 黃柏의 양을 64 g에서 84 g으로 높였는데 이는 금궤요략의 약제의 양과 비율을 맞추기 위함이다( Table 8 ).
Compared to Existing Study and This Study
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Compared to Existing Study and This Study
염증성 장질환의 동물실험 모델에는 acetic acid 23 를 관장시키거나, 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS) 24 를 항문으로 주입하거나, dextran sulfate sodium(DSS) 등의 염증을 유발시키는 시약을 이용한 동물모델들이 있다. DSS를 음료로 마시게 하여 대장염을 유도하는 것이 앞선 烏梅丸에 관한 실험 12 에서처럼 TNBS를 항문으로 주입하는 방법으로 대장염을 유발하는 방법보다 실험적인 오차를 유발 할 가능성이 적다고 알려져 있다 9 . 또한 TNBS 유발 장염이 크론병과 임상 양상이나 기전이 비교적 유사하고, DSS유발 장염은 염증세포의 점막침윤, 상피세포의 손상, 궤양을 특징으로 하며 사람의 궤양성 대장염과 비슷하다는 것이 보인다고 보고되어 있다 25 . 이에 저자는 DSS를 이용하여 궤양성 대장염을 고려하여 염증성 장질환을 유도하였다.
기존실험 12 에서는 烏梅丸을 200 mg/kg/day, 400 mg/kg/day, 800 mg/kg/day을 투여하였는데, 400 mg/kg/day와 800 mg/kg/day를 투여한 실험 사이가 가장 효과가 좋을 것으로 추정되며, 또한 다른 염증성 장질환 실험에서 흔히 사용한 용량 26 이기에 500 mg/kg/day 농도를 선택하였다. 또한 환제로 만들어 비교하기에는 각 동물마다 일정한 투여량을 확보하기 어려워 분말로 만들어 식염수에 타서 음료로 만들어 zonde로 경구투여하였다. OMH 및 MF 단독제제을 투여하였을 때의 염증성 장질환에 대한 억제효과를 비교분석하기 위하여 체중, 대장길이, cytokine, CBC, 조직검사 등을 측정하고 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
생쥐의 체중을 DSS 투여 후 2일에 한 번씩 아침 10시에 총 4회에 걸쳐 측정하였다. 그 결과를 보면 DSS를 투여하지 않은 NG에 비해 DSS를 투여한 다른 실험군에서 체중의 증가속도가 완만해지며, CG와 MFG은 6일차를 정점으로 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 반면 OMHG는 다소 완만하지만 6일차 이후에도 꾸준히 증가하는 경향이 보였다. 또한 OMHG군에서 DSS투여 후 4일차에서는 측정한 체중이 가장 적은 것도 확인되었다. 이는 생쥐의 긴장상태나 DSS의 농도에 따라 유발된 염증 정도가 달라 결과에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다 27 . 그러나 CG와 MFG에 비해 OMHG는 꾸준히 체중이 증가하는 것으로 보아 체중 감소 억제 효과가 MFG에서보다 OMHG에서 보다 유효한 효과에 대한 가능성이 있을 수도 있음을 추측 해본다.
DSS 및 시료의 투여를 의한 각 군의 상태 중 대장의 길이를 통해 염증정도를 간접적으로 관찰하기 위하여 대장의 길이를 측정한 결과 NG는 7.72±1.01 cm, CG는 6.56±0.60 cm, MFG는 7.66±1.16 cm, OMHG는 7.67 cm로 나타나 NG가 가장 길었고 CG는 정상길이에 비해 84% 정도의 길이가 측정되었다. MFG(P=0.042)와 OMHG(P=0.039)는 모두 정상길이의 99% 정도의 길이를 보이며 NG와 차이가 적었다. 통계적으로 유의하게 대장의 길이가 증가되어 있음을 알 수 있었다.
모든 실험을 마친 후 생쥐에서 채혈된 혈액에서 염증성 cytokine 중 하나인 TNF-α, IL-10를 측정하였다. TNF-α가 다량 분비될 경우 염증의 전사인자 NF-kB를 활성화시키며 그 결과 prostaglandins, leukotrienes, NO, platelet activating factor 등의 매개물질들의 합성이 증가되고 조직의 손상을 유도하는 각종 염증질환을 일으킨다 28 . TNF-α의 농도를 측정한 결과, NG는 0.0721±0.00692 pg/ml, 0.0882, CG는 0.0882±0.00655 pg/ml, MFG는 0.0788±0.00352 pg/ml, OMHG는 0.0798±0.00483 pg/ml로 나타나 CG에 비해 MFG(p=0.003)와 OMHG(p=0.01)에서 모두 유의성 있게 감소하였다. 이를 통해 염증이 억제되고 있음을 확인할 수 있었다.
IL-10은 T임파구에 의한 IL-2와 γ-interferon의 생산을 억제하여 염증을 조절하는 cytokine으로 활동성 염증성 장질환에서 상대적으로 감소해 있다고 알려져 있다 29,30 . 그러나 본 실험의 경우 NG는 0.0764±0.00683 pg/ml, CG는 0.0782±0.00691 pg/ml, MFG는 0.0751±0.00367 pg/ml, OMHG는 0.0750±0.00420 pg/ml이 측정되었다. CG에서 상대적으로 높은 수치가 나왔으며 MFG와 OMHG에서 CG와 NG보다 상대적으로 낮게 나왔다. 염증성 장질환 환자와 건강 대조군에서 그 대립유전자의 빈도에 유의한 차이가 없었고, 염증성 장질환을 크론병과 궤양성 대장염으로 나누어 비교했을 때에도 유의한 차이가 없다는 보고도 있으므로 31 , 본 실험 결과는 종족의 차이나 임상 양상의 차이, 적은 개체 수 등에 의해서도 나타날 수 있다고 생각된다.
DSS와 시료의 투여가 생쥐의 WBC에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 측정한 결과 CG는 1.54±0.40 K/μl으로 NG(1.09±0.34 K/μl)에 비해 큰 폭으로 상승하였으나 MFG(1.02±0.35 K/μl, p=0.037)와 OMHG(1.04±0.27 K/μl, p=0.035)는 모두 CG에 비해 유의하게 감소하였다. WBC는 전통적으로 감염질환 여부를 알아내는 주요한 수단이였다. 그 외에도 나이, 성, 임신, 흡연 여부에 따라 영향을 받는 것으로 알려져 있다. MFG와 OMHG에서 모두 CG에 비해 유의하게 감소한 것으로 보아 DSS로 유발된 염증성 장질환이 호전되었음을 확인할 수 있었다.
RBC의 수를 비교 한 결과 NG는 8.48±0.38 M/uL, OMHG는 8.46±0.37 M/uL로 CG(8.19±0.34 M/uL)와 MF(8.14±0.49 M/uL)에 비교하여 높은 것을 확인할 수 있었다. 실험군의 수가 크지 않아 단정할 수는 없지만 OMH 구성약제들 중 當歸, 人參, 肉桂 등의 효과로 보이며 체중과 같은 양상을 보이고 있으므로 추가적 연구가 필요할 것으로 사료된다. 그 외의 Hb와, Plt 수에서는 유의한 결과를 얻지 못하였다. 체중증가와 RBC의 수를 비추어 볼 때 OMHG가 MFG에 비해 건강개선에 효과적인지에 대한 추가 연구가 필요하다고 사료된다.
DSS 투여 및 시료의 투여가 대장 점막에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 희생시킨 생쥐의 대장 조직을 적출한 후 H&E로 염색하고 이를 관찰하였다. 그 결과를 보면 DSS 투여 후 식염수를 투여한 CG에서는 대장 점막조직의 훼손이 현저하게 관찰되었고 혈변도 관찰되었으나 MFG와 OMHG는 NG 수준으로 점막층이 재생되어 있음이 관찰되었다. DSS로 유발된 염증성 장질환의 대장조직은 심각한 구조의 파괴와 광범위한 감염세포의 침윤 및 궤양, 근육비대 등을 특징으로 하는 조직학적 소견을 보이는 것으로 알려져 있다 32 . 그러므로 염증상 장질환 유발 후 CG보다 MFG와 OMHG에서 조직병리학적으로 더 빠른 회복의 결과를 관찰할 수 있었다. 그리고 CG에서 융모의 개수 소실과 점막하 조직의 혈관으로부터 수분이 빠져나오는 부종의 소견도 MFG와 OMHG에서 더 감소되어 있음을 볼 수 있으므로 치료효과를 확인할 수 있었다. MFG와 OMHG 사이에서 유의한 차이점은 알 수 없었다.
이러한 연구를 시행한 결과 DSS로 염증성 장질환이 유발된 흰 쥐에서 MF와 OMH 모두 체중감소 완화, 대장길이 회복, TNF-α와 WBC 수의 감소, 조직학적 회복을 시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 연구결과 MF보다 OMH가 체중 및 RBC 수의 회복 등 건강개선에 더욱 효과적임을 알 수 있었다.
염증성 장질환의 치료에 MF와 OMH 모두 효과적임을 알 수 있었으나 두 제재 사이의 염증관련 부분에서는 뚜렷한 차이는 알 수 없었다. 향후 두 제재 투약군의 회복속도 및 치료기전, 기타 다른 cytokine의 차이를 더욱 연구해야 할 것으로 보인다. 또한 기타 다른 단독제재 및 복합제재, 더 나아가 sulfasalazine, mesalazine 등 양성 대조군 약물들과의 추가 비교 연구도 필요하리라 사료된다.
V. 결 론
오매와 오매환이 DSS로 염증성 장질환이 유발된 생쥐의 체중 변화, 대장 길이 변화, 혈청 중 cytokine(TNF-α, IL-10) 및 CBC(WBC, RBC, Hb, PLT) 함량의 변화, 조직학적 변화를 조사한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. 체중은 정상군에 비하여 실험군들의 증가속도는 완만해지고, 대조군와 오매 투여군는 6일차를 기점으로 감소하였으나, 오매환 투여군는 꾸준히 증가하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의하지는 않았다.
2. 대장길이는 정상군에 비해 대조군는 약 16% 로 감소한 반면 오매 투여군와 오매환 투여군은 정상군의 99% 수준으로 회복되었다.
3. TNF-α는 대조군은 정상군에 비해 19% 증가하였고, 오매 투여군과 오매환 투여군은 대조군의 89% 수준으로 감소하였다. IL-10은 유의성이 없었다.
4. WBC는 대조군은 정상군에 비해 41% 증가하였고, 대조군과 비교하여 오매 투여군은 33.8% 감소, 오매환 투여군은 32.5% 감소하였다. RBC는 정상군에 비해 대조군은 3.4% 감소, 오매 투여군은 4.1% 감소하였고, 오매환 투여군은 0.3% 감소하였으나 통계적으로 유의하지 았았다. Hb와 PLT는 유의성이 없었다.
5. 조직학적으로 대조군에서는 혈변 및 대장 점막 조직의 훼손이 현저하게 관찰되었으나 오매 투여군과 오매환 투여군은 대부분 정상 수준으로 회복되었다.
이 논문은 2014년도 동신대학교 일반대학원 한의학 석사학위 논문임.
References
2002 내과진료지침 고려의학 서울 51 - 3
김 정룡 2005 소화기계 질환 일조각 서울 277 - 80
건강보험통계 : 질병분류별 연령별 급여현황(총계, 2004-2012년) http://kosis.kr/statHtml/statHtml.do?orgId=350&tblId=TX_35001_A061&vw_cd=&list_id=&scrId=&seqNo=&lang_mode=ko&obj_var_id=&itm_id=&conn_path=K1&path=
최 창환 , 김 영호 , 김 유선 , 예 병덕 , 이 강문 , 이 보인 2012 궤양성 대장염 치료 가이드라인 대한장연구학회지 10 (1) 1 - 2
Ishiguro K , Ando T , Maeda O , Hasegawa M , Kadomatsu K , Ohmiya N 2006 Paeonol Attenuates TNBS-induced colitis by inhibiting NF-B and STAT1 transactivation Toxicology and Applied Pharmacology 217 (1) 35 - 42    DOI : 10.1016/j.taap.2006.07.002
許 浚 2005 東醫寶鑑 東醫寶鑑出版社 서울 138, 395, 404 - 5, 849, 854-6, 2110-1
2008 비계내과학 군자출판사 서울 374 - 5
김 승욱 , 임 성우 2002 導赤地楡湯이 궤양성 대장염 유발 흰쥐에 미치는 영향 대한한의학회지 23 (3) 200 - 10
안 중환 , 최 은영 , 이 성환 , 박 인식 , 임 성우 2006 黃連解毒湯이 DSS로 유발된 흰쥐의 궤양성 대장염에 미치는 영향 대한한의학회지 27 (2) 182 - 97
김 신정 , 김 소희 , 임 양이 , 김 용규 , 박 건영 2014 생강과 법제생강의 DSS로 유도된 마우스의 대장염 억제 효과 한국식품영양과학회지 43 (4) 477 - 84
허 경 , 장 명웅 , 임 성우 2012 薏苡仁 추출물이 DSS로 유발된 생쥐의 궤양성 대장염에 미치는 영향 대한한방내과학회지 33 (4) 520 - 32
Liu L , Yuan S , Sun Y , Long Y , Yuan S , Sun Y 2009 The possible mechanisms of Fructus Mume pill in the treatment of colitis induced by 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid in rats Ethnopharmacol 126 (3) 557 - 64    DOI : 10.1016/j.jep.2009.08.013
김 해란 , 이 보람 , 임 경직 , 신 흥묵 , 임 병우 , Debnath Trishna 2011 매실 혼합물이 DSS로 유도된 염증성 장질환 동물모델의 면역조절에 미치는 활성 한국약용작물학회지 19 (1) 16 - 23
2005 本草學 永林社 서울 143, 678 - 9
김 호철 2001 한약약리학 집문당 서울 490 - 2
장 중경 , 이 극광 1989 金匱要略 인민위생출판사 북경 556 -
고 장호 2013 DSS로 유발된 흰쥐 궤양성 대장염에 대한 씀바귀의 억제효과 원광대학교 대학원
新谷 太 , 문 영명 2002 Pathophysiology로 이해하는 내과학, 소화기질환 도서출판 정담 서울 96 -
Yang DH , Yang SK 2009 Trends in the incidence of ulcerative colitis in Korea 대한내과학회지 76 (6) 1226 - 329
Meining A , Bayerdörffer E , Bästlein E , Raudis N , Thiede C , Cyrus B 1997 Focal inflammatory infiltrations in gastric biopsy specimens are suggestive of Crohn's disease Scandinavian Journal of Gastroenterology 32 813 - 8    DOI : 10.3109/00365529708996539
김 지민 , 박 성환 2009 스테로이드 처방의 허(虛)와 실(實) 대한내과학회지 77 (3) 1226 - 329
黃 度淵 2002 方藥合編 永林社 서울 228 - 9
Ekstrom GM 1998 Oxazolone induced colitis in rats: effects of budesonide, cyclosporin A, and 5-aminosalicylic acid Scand J Gastreoenterol 33 174 - 9    DOI : 10.1080/00365529850166914
Morris GP , Beck PL , Herridge MS , Depew WT , Szewczuk MR , Wallace JL 1989 Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon Gastroenterology 96 (3) 795 - 803
Cooper HS , Murthy SN , Shah RS , Sedergran DJ 1993 Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis Lab invest 69 (2) 238 - 49
정 호경 , 정 원석 , 안 병관 , 강 병만 , 여 준환 , 차 선우 2014 식방풍 잎의 DSS로 유도한 궤양성 대장염 완화 효과 한국자원식물학회지 27 (5) 421 - 8
Ryu B , Ro W , Park JW , Bu Y , Lee BJ , Lim S 2011 Bojanggunbi-tang, a traditional Korean herbal prescription, ameliorates colonic inflammation induced by dextran sulfate sodium and 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid in mice J Ethnopharmacol 135 582 - 5    DOI : 10.1016/j.jep.2011.03.004
Hanada T , Yoshimura A 2002 Regulation of cytokine signaling and inflammation Cytokine Growth Factor Rev 3 413 - 21
Fedorak RN , Gangl A , Elson CO , Rutgeerts P , Schreiber S , Wild G 2000 Recombinant human interleukin 10 in the treatment of patients with mild to moderately active Crohn's disease Gastroenterology 119 1473 - 82    DOI : 10.1053/gast.2000.20229
Schreber S , Fedorak RN , Nielsen OH , Schreiber S , Fedorak RN , Nielsen OH 2000 Safety and efficacy of recombinant human interleukin-10 in chronic active Crohn's disease Gastroenterology 119 1461 - 72    DOI : 10.1053/gast.2000.20196
김 태호 , 김 병관 , 신 형두 , 김 지원 , 김 찬규 , 김 주성 2003 한국인 염증성 장질환에서 Tumor Necrosis Factor-α와 Interleukin-10 유전자의 다형성에 관한 연구 대한소화기학회지 42 377 - 86
Kitajima S , Takoma S , Morimoto M 2000 Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights Exp Animal 49 9 - 15    DOI : 10.1538/expanim.49.9