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Antimicrobial Activity of Hwangryunheadok-tang and Extracts of Scutellariae Radix, Phellodendri Cortex, Coptis Rhizome, and Gardenia Jasminoides against Salmonella Typhimurium
Antimicrobial Activity of Hwangryunheadok-tang and Extracts of Scutellariae Radix, Phellodendri Cortex, Coptis Rhizome, and Gardenia Jasminoides against Salmonella Typhimurium
The Journal of Korean Oriental Internal Medicine. 2015. Jun, 36(2): 165-179
Copyright © 2015, The Korean Society for Oriental Internal Medicine
  • Received : May 13, 2015
  • Accepted : June 22, 2015
  • Published : June 30, 2015
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인수 김
영수 이

Abstract
Objectives:
This experiment investigated the antimicrobial activity of Hwangryunheadok-tang and extracts of Scutellariae radix , Phellodendri cortex , Coptis rhizome , and Gardenia jasminoides against Salmonella typhimurium .
Methods:
After spreading S. typhimurium on a bacterial culture medium plate, antimicrobial activity was tested by dripping diluted Hwangryunheadok-tang or extracts of Scutellariae radix , Phellodendri cortex , Coptis rhizome , or Gardenia jasminoides (80 μl, diluted 100, 50, 10, and 1%) onto the plate, followed by culture for 16 to 72 hours. The minimal inhibitory concentration (MIC) was tested by dripping the minimum dilution that showed antimicrobial activity (80, 60, 40, and 20 μl) and measuring the density. The antimicrobial activity of Hwangryunheadok-tang and four extracts showed continuous antibacterial activity against S. typhimurium throughout the experiment.
Result:
1. S. typhimurium . (Standard Microorganism, ATCC) 1) The Hwangryunheadok-tang and extracts of Scutellariae radix , Phellodendri cortex , and Coptis rhizome showed antibacterial activity in the undiluted solutions and in 50% dilutions. Gardenia jasminoides extract showed potency only in the undiluted solution. The antimicrobial potency of the undiluted solution was increased when the volume of inoculation was increased, but no difference was noted when the culture time was extended. All the extracts showed antimicrobial potency against S. typhimurium . 2. S. typhimurium isolated from diarrhea patients 1) When compared to the standard microorganism experiment on S. typhimurium , the MICs of the five extracts were increased. However, whereas the antimicrobial potency of doxycycline was lost entirely against bacteria isolated from patients with diarrhea, the antimicrobial potency of all the extracts was diminished but did not disappear. 2) The antimicrobial activity of Hwangryunheadok-tang and four extracts was continuous even when the culture time was extended to 16, 24, and 72 hours.
Conclusions:
The Hwangryunheadok-tang and four kinds of extracts have antimicrobial activity against S. typhimurium . Comparison of a standard microorganism with S. typhimurium isolated from diarrhea patients showed that the antimicrobial activity of all the extracts was better than that of antibiotics. Further studies should focus on the value and benefits of Hwangryunheadok-tang , and the four kinds of extracts as clinical treatments.
Keywords
I. 서 론
식중독은 오염된 음식물을 섭취함으로써 발생하는 구토, 설사, 복통 등의 증세를 동반한 임상 증후군이다 1 . 이러한 식중독의 원인균 가운데 가장 많은 비중을 차지하는 것으로 Salmonella 종이며 그 다음으로 Escherichia coli, Staphylococcus aures , Vibrio spp 등이 있는데 2 , 이들 식중독 세균은 주로 육류, 채소, 난류, 우유나 유제품 그리고 조리 가공식품 등의 여러 가지 음식물에 오염되어, 이를 섭취한 사람으로 하여금 심각한 식중독을 유발시킨다 3 .
이와 같은 식중독균들에 대해 항생제가 등장하면서 치료율이 높아졌으나, 무분별한 항생제의 오⋅남용으로 인한 항생제 내성균의 등장으로 의료계는 감염성 질환의 치료에 많은 어려움을 겪게 되었다. 이로 인하여 내성균에 의한 감염성질환을 대처하기 위해 새로운 항생제들의 개발이 현재에도 끊임없이 요구되고 있지만 새로운 항생제의 개발은 많은 시간과 인력 그리고 개발비가 요구되는 실정이다. 더욱이 새로운 항생제가 개발된다 하더라도 세균들이 수개월 내에 내성을 획득함으로 어려움이 가중되고 있는 실정이다 4 . 이에 국내외적으로 천연 항생물질에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다 5,6 .
黃連解毒湯은 諸熱毒을 瀉火解毒하는 효능이 있어 그 동안 천연항균성 물질의 대표 방제로써 “傷寒大熱로 煩燥하고 睡眠을 취하지 못함을 다스리며 차후의 飮酒毒과 一切毒을 푼다”고 하였으며 그 구성 약물로는 黃芩, 黃連, 黃柏, 梔子 7 이다.
현재까지 식중독의 원인균으로서 S . Typhimurium에 대해 단일 한약재들과 8-18 , 복합 한약 처방들 19,20 이 항균효과가 있음을 보여주는 많은 연구가 있었다. 특히 천연항생제로서 황련해독탕의 항균력에 대한 다종의 실험이 있었으나 黃連解毒湯과 그 구성 약재인 黃連, 黃柏, 黃芩, 梔子의 항균력을 함께 수평적으로 비교함으로써, 黃連解毒湯의 어떤 약재가 항균력에 얼마만큼 기여하였는가를 분석해보는 연구는 없었다.
특히 표준균주를 대상으로 한 실험이 아닌 실제 환자에서 분리된 항생제에 내성을 가진 균주를 이용한 항균력 비교연구는 장 21 의 연구가 유일하며 그마저도 복합 한약재 처방을 가지고 수행한 연구는 현재까지 전무한 실정이다.
이에 저자는 식중독 대표 원인균의 하나인 S . Typhimurium를 표준균주와 항생제 내성을 가진 환자분리균주 두 가지로 준비하고, 두 종류의 균주에 대해 黃連解毒湯과 각각의 구성 약물들이 가지고 있는 항균효과를 비교함으로써 천연 항균제로서 이용 가능성에 대한 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
II. 재료 및 방법
- 1. 재 료
- 1) 약 재
본 실험에 사용된 약재들은 현재 동신대광주한방병원에서 사용되고 있는 제품을 구입하여 雜質을 제거하고 형태가 완전한 것을 정선하여 사용하였다.
- 2) 균주 및 사용배지
- (1) 표준균주
본 실험에 사용한 표준균주는 광주광역시 보건환경연구원의 보관균주로 S . Typhimurium(ATCC, 13565)를 Trypic soy agar(TSA)(Oxoid LTD., Basingstoke, Hampshire, England) 배지에서 배양하였다.
- (2) 분리균주
본 실험에 사용한 분리균주는 광주광역시 보건환경연구원에서 광주지역에서 2012년 1월부터 2013년 8월까지 설사환자에게서 분리된 균주로 S . Typhimurium를 미생물 생화학적 동정기(VitekII Compact, bioMerieux, France)를 이용하여 동정한 후, 표준균주와 동일한 방법으로 배양하였다.
- 2. 방 법
- 1) 黃連解毒湯, 黃連, 黃柏, 黃芩, 梔子 추출물 제조방법
- (1) 약재 선별
동신대한방병원에서 사용하는 약재를 준비하여 각질을 제거하고 黃連, 黃柏, 黃芩, 梔子를 각 50 g을 취해 합하여 200 g의 黃連解毒湯을 준비하고 따로 黃連, 黃柏, 黃芩, 梔子 각각 약재 100 g을 취하여 준비하였다( Table 1 ).
Prescription of Herb-med
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Prescription of Herb-med
- (2) 약재 불림
약재를 비이커에 黃連解毒湯, 黃連, 黃柏, 黃芩, 梔子의 각각 취한 양 100 g당 증류수 1,000 ml를 넣고 실온에서 8시간 동안 약재를 불렸다.
- (3) 약재 전탕
비커에서 불린 약제를 전탕기(TOPS, IL Gwang Engineering Co.)에 옮기고 4시간 동안 전탕하였다,
- (4) 상층액 분리 및 농축
전탕이 끝난 농축액을 원심분리기(Allegra X-12R, Beckman coulter, USA)로 3,000 rpm에서 20분 원심분리한 후 찌꺼기는 버리고 상층액을 모아 진공감압농축기(Rotary Evaporator NE-1001, Eyela, Japan)를 이용하여 80 ℃에서 90 rpm으로 감압 농축하여 최종 용적을 100 ml로 하였다.
- 2) 피검균액의 준비
- (1) 표준균주 준비
표준균주 ATCC 13565를 TSA배지에 접종한 후, 36 ℃에서 48시간 배양하고 배양된 균주를 다시 Tripic soy broth(TSB)(Oxoid LTD., Basingstoke, Hampshire, England)에 접종하여 36 ℃에서 48시간 배양하였다. 배양된 균주는 0.85% NaCl에 0.5 McFarland가 되도록 현탁하여 사용하였다.
- (2) 분리균주 준비
분리균주는 광주광역시보건환경연구원에서 2013년 광주지역에서 발생한 설사환자에서 분리된 균주로, 미생물 생화학 자동 동정기를 사용하여 동정한 후, 표준균주와 동일한 방법으로 배양하여 사용하였다.
- 3) 분리균주의 항생제 감수성시험
분리된 균주의 항생제 감수성시험은 미생물 생화학 자동 동정기를 사용하여 실시하였고, 항생제 내성기준은 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)지침에 따라 내성률을 산출하였다.
- 3. 관찰방법
- 1) 항균효과측정
- (1) 각 추출물의 희석률에 따른 항균력
희석률에 따른 최소 성장 억제 농도 측정 측정은 Disc diffusion method에 준하여 실험하였다. 준비된 표준균주 및 분리균주 현탁액을 Mueller-Hinton agar(MHA)(Oxoid LTD., Basingstoke, Hampshire, England)에 도말하였다. 한약 추출액은 원액과 50%, 10%, 1%로 희석한 것을 준비하여 멸균된 8 mm Paper disc(Advantec, Toyo Roshi Kaishm, Ltd., Japan)에 각 추출물을 80 μl씩 흡수시켰다. 식중독균을 도말한 배지 위에 한약 추출액이 흡수된 paper disc를 올려놓고 36 ℃에서 16시간 동안 배양한 후 disk 주위의 clear zone의 직경(mm)를 측정하여 항균력의 유무를 관찰하였다. 항균력 효과를 비교하기 위하여 ciprofloxacin 250 mg(시플록신정 250 mg, 한국콜마)과 doxycycline 일수화물 100 mg(바이브라마이신-엔정 100 mg, 한국화이자제약)을 1정씩 취하여 증류수 250 ml에 녹여 원액으로 사용하였고 한약 원액과 동일하게 희석하여 실험하였다.
- (2) 각 추출물 원액의 접종량에 따른 항균력
각 추출물의 접종량에 따른 항균력 측정은 ‘희석률에 따른 항균력 측정’과 동일한 방법으로 수행하되, 각 추출물 원액(100%)을 가지고 접종량을 달리하여(80 μl, 60 μl, 40 μl, 20 μl) disc에 접종한 후 억제환의 크기를 비교하였다.
- (3) 항균력이 나타난 최소희석농도 검액의 접종량에 따른 항균력과 MIC(Minimal inhibitory concentration)
희석률에 따른 항균력 측정 실험에서 각 추출물 별로 항균력이 나타난 최소희석농도의 검액을 가지고 80∼20 μl까지 접종량을 달리하면서 실험하였다. 실험방법은 희석율에 따른 항균력 측정과 접종량에 따른 항균력 측정 실험을 동일한 방법으로 실험하였다. 각 추출물의 항균력이 나타난 최소희석농도와 최소 희석 농도 검액에서 접종량을 달리하여 실험한 결과 값을 가지고 MIC를 측정하였다.
- (4) 배양 시간에 따른 항균력, 항균효과 지속성
항균효과 지속성 측정은 위의 세 가지 실험과 동일한 방법으로 표준균주와 분리균주에 대해 실험한 후, 36 ℃에서 16시간에서 72시간까지 배양하면서 같은 조건하에서 억제환의 크기비교 및 항균력의 지속성 여부를 비교하였다.
- 2) 미생물의 생육도 측정
본 실험의 미생물 생육도 측정은 다섯 가지 추출물 중 가장 높은 항균력을 보인 황련 추출물만을 가지고 시행되었다. 추출물의 농도를 확인하기 위하여 황련 추출물의 함량이 5 μl/ml, 10 μl/ml, 20 μl/ml, 40 μl/ml, 80 μl/ml, 160 μl/ml, 320 μl/ml가 되도록 TSB 배지에 희석하였다. 또한 실험에 사용된 다섯 종류의 균주는 생리식염수에 0.5 McFaland로 맞추어 각각의 희석된 배지에 200 μl씩 접종하였다. 접종된 배지는 36 ℃에서 24시간 배양(incubator, JEIO TECH, IL-21A, Korea)하여 육안으로 미생물의 증식이 확인되지 않은 농도를 확인하고 이를 기준으로 하였다.
S . Typhimurium의 농도가 5 μl/ml, 10 μl/ml, 20 μl/ml, 40 μl/ml가 되도록 조절한 TSB배지에 희석하고, 0.5 McFaland가 되도록 만든 후 각각의 희석된 배지에 200 μl씩 접종하고, 36 ℃에서 48시간 배양하면서 일정 시간 간격으로 배양액을 취한 후 배양액을 생리식염수로 희석하였다. 희석한 배양액에서 1.0 ml씩 패트리디쉬에 취하고 TSA를 분주하여 36 ℃에서 24시간동안 배양한 후 나타난 균수를 colony forming unit(log CFU/ml)으로 나타내었다.
III. 결 과
- 1. 항균효과측정
- 1) 표준균주
- (1) 각 추출물의 희석율에 따른 항균력(80 μl 접종)
黃連解毒湯 黃連 黃芩 黃柏은 10%까지, 梔子는 100%에서만 항균력을 나타냈으며, 각 추출물들의 억제환의 크기는 농도에 비례하여 나타났다. 억제환의 크기에 따른 항균력은 黃連이 가장 큰 것으로 나타났으며 그 뒤로 黃連解毒湯, 黃芩, 黃柏, 梔子 순이었다. 대조군으로 사용한 doxycycline과 ciprofloxacin은 각각 10%, 1% 농도까지 항균력을 보였다( Fig. 1 ).
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Inhibition zone according to density of extracts and antibiotics on S. Typhimurium. (in standard microorganism, after 16 hours, 80 μl

A : , B : , C : , D : , E : , F : , G :

(2) 각 추출물 원액(100%) 접종량(80 μl, 60 μl, 40 μl, 20 μl)에 따른 항균력
黃連解毒湯 黃連 黃柏 黃芩 모두 20 μl까지, 梔子는 80 μl에서만 항균력을 나타냈다. 각 추출물들의 억제환의 크기는 접종량에 비례하여 나타났다. 억제환의 크기에 따른 항균력은 黃連解毒湯이 가장 큰 것으로 나타났으며 그 뒤로 黃芩, 黃連, 黃柏, 梔子 순이었다( Fig. 2 ).
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Inhibition zone according to inject quantity of five kinds of extracts on S. Typhimurium. (in standard microorganism, after 16 hours)

A : , B : , C : , D : Hwanggeum, E :

- (3) 항균력이 나타난 최소희석농도 검액의 접종량에 따른 항균력과 MIC
MIC는 黃連이 10%, 40 μl, 黃連解毒湯과 黃芩, 黃柏은 10%, 60 μl, 梔子는 100%, 80 μl였다( Fig. 3 ).
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Inhibition zone according to inject quantity at minimum dilution density extracts on S. Typhimurium. (in standard microorganism, after 16 hours)

A : 50%, B : 10%, C : 50%, D : 50%

- (4) 배양 시간에 따른 항균력, 항균효과 지속성
- ① 실험 검액별 희석배율에 따른 항균력 비교실험
각 추출물들의 항균력(억제환의 크기)은 모든 (100%~1%)농도에서 16시간과 24시간, 72시간 모두 동일하게 나타났다( Fig. 4 , Table 2 ).
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The variation of inhibition zone according to cultivating time on S. aureus

A : 100%, B : 100%, C : 100%, D : 100%, E : 100%

The Size of Inhibition Zone according to Density & Cultivating Time of Five Kinds of Extracts onS. Typhimurium (in Standard Microorganism, 80 μl)
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The Size of Inhibition Zone according to Density & Cultivating Time of Five Kinds of Extracts on S. Typhimurium (in Standard Microorganism, 80 μl)
- ② 실험 검액별 원액에서의 접종량에 따른 항균력 비교실험
각 추출물들의 항균력(억제환의 크기)은 모든 (80~20 μl) 접종 용량에서 16시간과 24시간, 72시간 모두 동일하게 나타났다( Table 3 ).
The Size of Inhibition Zone according to Inject Quantity & Cultivating Time of Five Kinds of Extracts onS. Typhimurium
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The Size of Inhibition Zone according to Inject Quantity & Cultivating Time of Five Kinds of Extracts on S. Typhimurium
- ③ 항균력이 나타난 최소희석농도 검액의 접종량에 따른 항균력 비교실험
항균력이 나타난 최소희석 농도 검액들의 항균력(억제환의 크기)은 희석율과 접종량에 관계없이 16시간과 24시간, 72시간 모두 동일하게 나타났다 ( Table 4 ).
The Size of Inhibition Zone according to Inject Quantity & Cultivating Time at Minimum Dilution Density Extracts onS. Typhimurium
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The Size of Inhibition Zone according to Inject Quantity & Cultivating Time at Minimum Dilution Density Extracts on S. Typhimurium
- 2) 환자분리균주
- (1) 분리균주의 항생제 감수성시험
실험결과는 Table 5 와 같다( Table 5 ).
Antibiotic Susceptibility ofS. Typhimurium (S : Stability, I : Intermediate, R : Resistance)
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Antibiotic Susceptibility of S. Typhimurium (S : Stability, I : Intermediate, R : Resistance)
- (2) 각 추출물의 희석율에 따른 항균력
黃連解毒湯 黃連 黃芩은 50%까지, 黃柏은 100%에서만 억제환이 나타났고 梔子는 모든 농도에서 억제환이 나타나지 않았다. 표준균주에 비해 다섯가지 추출물 모두의 항균력이 감소하였다. 대조군으로 사용한 doxoycycline은 어떤 농도에서도 항균력을 보이지 않았고, ciprofloxacin은 표준균주에서와 같은 크기의 항균력을 보였다. 항균력의 크기는 黃連解毒湯, 黃芩, 黃連, 黃柏 순이었다( Fig. 5 ).
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Inhibition Zone according to Density of Extracts and Antibiotics on S. Typhimurium (Isolated from Diarrheal Patients, after 16 Hours, 80 μl)

A : , B : , C : , D : , E : , F : , G :

- (3) 각 추출물 원액(100%)의 접종량(80 μl, 60 μl, 40 μl, 20 μl)에 따른 항균력
黃連解毒湯 黃芩은 20 μl까지, 黃連과 黃柏은 60 μl까지 항균력을 보였고, 梔子의 항균력은 나타나지 않았다. 표준균주 실험과 비교했을 때, 다섯 가지 추출물 모두에서 전반적으로 항균력이 감소하였다. 각 추출물들의 억제환의 크기는 접종량에 비례하여 나타났다.
- (4) 항균력이 나타난 최소희석농도 검액의 접종량에 따른 항균력과 MIC
MIC는 黃連解毒湯, 黃連, 黃芩은 50%, 60 μl, 黃柏은 100%, 60 μl였다.
표준균주 실험과 비교해 다섯 가지 추출물 모두에서 항균력이 감소하여 나타났다. 각 추출물들은 동일한 농도에서 접종량에 비례하여 억제환의 크기가 나타났다.
- (5) 배양 시간에 따른 항균력, 항균효과 지속성
표준 균주 실험과 마찬가지로 환자 분리 S. aureus 에 대해 항균력은 희석율과 접종량에 관계없이 16시간과 24시간, 72시간 모두에서 동일하게 나타났다 ( Table 6 , 7 , 8 ).
The Size of Inhibition Zone according to Density & Cultivating Time of Five Kinds of Extracts onS. Typhimurium (Isolated from Diarrheal Patients, 80 μl
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The Size of Inhibition Zone according to Density & Cultivating Time of Five Kinds of Extracts on S. Typhimurium (Isolated from Diarrheal Patients, 80 μl
The Size of Inhibition Zone according to Inject Quantity & Cultivating Time of Five Kinds of Extracts onS. Typhimurium
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The Size of Inhibition Zone according to Inject Quantity & Cultivating Time of Five Kinds of Extracts on S. Typhimurium
The Size of Inhibition Zone according to Inject Quantity & Cultivating Time at Minimum Dilution Density Extracts onS. Typhimurium
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The Size of Inhibition Zone according to Inject Quantity & Cultivating Time at Minimum Dilution Density Extracts on S. Typhimurium
- 2. 미생물의 생육도 측정
미생물 생육도 측정 실험은 다섯 가지 식중독 균주들에 대해 가장 높은 항균력을 보인 黃連으로 시행하였다. S . Typhimurium에 대해서 黃連 추출물이 균주들의 생육에 미치는 영향을 측정한 결과는 Fig. 6 과 같다.
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Growth inhibition of Coptis Rhizoma extract against S. Typhimurium.
추출물의 농도 20 μl/ml에서 6시간까지는 대조군과 비교하여 3.12 log cycle의 생육저해를 나타내었으나 6시간 이후는 생육저해 효과가 감소하여 균의 증식이 이루어졌다. 그러나 40 μl/ml에서는 6시간 이후에도 지속적으로 생육저해가 나타남을 확인하였고, 12시간대에서 대조군과 비교하였을 때 7.38 log cycle의 차이를 나타내어 높은 성장억제 효과를 확인할 수 있었다. 80 μl/ml에서는 6시간 이후부터 균의 증식이 완전히 억제되었다( Fig. 6 ).
IV. 고 찰
식생활의 다양화와 국제교류의 증가 등 식중독의 발생원인은 더욱 다양해지고 증가 추세에 있으며 그 원인으로는 식품의 종류 및 보관상태, 조리기구 및 조리종사자의 위생의식, 올바른 손 씻기 등이 다양하게 보고되고 있다 22 . 식중독 발생 시 식중독의 원인균을 규명하는 것은 환자의 치료와 식중독의 확산방지 및 사후 대책수립에 있어서 매우 중요하다. 더욱이 단체 급식과 외식의 확대보급으로 인한 식생활 형태의 변화와 국제무역 및 여행의 중가 등의 사회⋅환경의 변화로 인해 집단 식중독의 발생이 지속적으로 보고되고 있다 23 . 우리나라는 90년대 이후 식중독이 꾸준한 증가추세에 있으며 3 , 식품의약품안전청의 보고 24 에 의하면 호흡기 감염에 이어 두 번째로 많이 발생하는 질환으로써 인구 1000명당 1명은 1년에 1회 식중독으로 입원할 만큼 급성식중독은 세계적으로도 질병부담이 크다.
식중독의 원인균 가운데 가장 많은 비중을 차지하는 것이 Salmonella 종인데 사람과 동물에 공통으로 질병을 일으키며, 오염된 물이나 동물에서 유래된 음식물(고기, 가금류, 계란, 우유 등)을 날로 먹거나, 가열이 덜 된 상태로 섭취하였을 때 주로 환자가 발생된다 25 . 살모넬라균은 O항원과 H항원을 가지고 있으며 O항원에서 A, B, C, D 및 E군의 5군으로 나뉘고, 그 중에서 B군 균주인 S . Typhimurium과 D군 균주인 S . Enteritidis는 위장관염을 일으키는 대표적인 균주이다 26 . 국립보건원의 보고 27 에 의하면 비장티푸스성 살모넬라균의 분리 빈도가 증가하고 있는 추세이며 90년대 후반부터 최근까지 S . Typhimurium이 가장 높은 분리율을 보이고 있다.
식중독균을 포함한 세균에 의한 대부분의 감염질환과 질병치료는 항생제로 치료하고 있으나 다양한 경로를 통해 항생제와 접하게 되는 기회가 많아지게 되면서 세균들은 항생제 내성을 획득하게 되는 기회를 얻고 있다. 특히 우리나라 국민들의 항생제 사용량은 세계적으로 매우 높은 것으로 알려져 있는데, 최근에 항생제 사용량이 해마다 줄어들고 있는 추세이긴 하지만 여전히 항생제 사용량이 특히 많은 나라에 속한다 28 . 이에 세계보건기구는 천연 항생물질에 대한 연구를 지속해오고 있으며 국내에서도 역시 이에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있는데 5,6 , 그 중에서도 S . Typhimurium에 대한 黃連, 黃芩, 黃柏, 梔子, 牧丹皮, 紫草, 金銀花, 蛇床子, 蒲公英, 連翹, 五味子, 豆腐, 無花果, 마늘 등 8-18 의 항균효과 연구가 있으며, 복합제재로는 黃芩湯 19 , 黃連解毒湯 20 등의 연구가 있다.
黃連解毒湯은 <肘後備急方>에서 언급된 이래 瀉火解毒의 대표적인 처방으로 黃芩, 黃連, 黃柏, 梔子로 구성되어 있다 7 . 黃芩은 苦, 寒, 無毒하고 淸熱燥濕, 瀉火解毒, 止血安胎 등의 효능 29 이 있으며, 解熱 血壓降下 殺菌 粥大動脈硬化의 방지 등의 약리작용 30 을 한다. 黃連은 苦, 寒, 無毒하고 淸熱燥濕, 淸心除煩, 瀉火解毒 등의 효능 29 이 있으며, 殺菌, 殺蟲, 鎭痙, 血糖調節 등의 약리작용 30 을 한다. 梔子는 苦, 寒, 無毒하고 瀉火除煩, 淸熱利濕, 凉血止血 등의 효능 29 이 있으며 血壓降下 消炎解熱 鎭痛 등의 약리 작용 30 을 한다. 黃柏은 苦, 寒, 無毒하고 淸熱燥濕, 瀉火解毒, 淸退虛熱 등의 효능 29 이 있으며, 血糖降下 中樞神經抑制 抗炎症 등의 약리작용 30 을 한다. 이러한 구성으로 된 黃連解毒湯은 抗菌, 消炎, 鎭痛, 解熱, 鎭靜, 止血, 抗潰瘍, 止瀉作用과 항바이러스 작용이 있어 인플루엔자, 뇌염, 패혈증, 뇌막염 등의 급성 감염증과 피부의 화농증, 급성 출혈증, 급성 위장염, 세균성下痢 등에 사용되어 오고 있다 31 .
그러나 현재까지 다종의 식중독균들에 대해 黃連解毒湯과 그 구성 약재인 黃連, 黃柏, 黃芩, 梔子의 항균력을 함께 수평적으로 비교함으로써, 黃連解毒湯의 어떤 약재가 항균력에 얼마만큼 기여하였는가를 분석해보는 연구는 없었으며 특히 표준 균주가 아닌 항생제에 내성을 가진 환자분리균주를 이용한 연구로는 장 21 의 연구를 제외하고 현재까지는 전무한 실정이기에 黃連解毒湯과 그 구성 약물들을 이용한 본 연구를 통해 천연 항균제로서의 가능성을 검증해 기초 자료로 활용하고자 연구를 실시하였다.
먼저 표준균주를 대상으로 한 추출물들의 희석률에 따른 항균력 비교실험에서 黃連解毒湯, 黃連, 黃芩, 黃柏이 10% 농도까지 항균력을 보였으며 梔子는 100% 원액에서만 작은 억제환을 만들어 항균력을 보였다. 전체적으로 黃連의 억제환 크기가 확연히 크게 나타나 항균효과가 다른 추출물에 비해 뛰어남을 알 수 있었다. 그 뒤로는 黃連解毒湯, 黃芩, 黃柏, 梔子 순으로 항균효과를 보였다. 원액의 접종량에 따른 항균력 비교 실험과 항균력을 보인 최소 희석 농도 검액을 접종량을 달리하여 비교한 실험으로 추출물들의 MIC( Table 9 )를 알 수 있었는데. 최소성장억제농도로 비교한 항균력의 크기도 黃連이 가장 크고 그 다음이 黃連解毒湯, 黃芩, 黃柏, 梔子 순이었다.
MIC of Extracts against Standard Microorganism &S. Typhimurium Isolated from Patient
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MIC of Extracts against Standard Microorganism & S. Typhimurium Isolated from Patient
배양시간에 따른 항균효과 실험에서 S . Typhimurium에 대해 다섯 가지 추출물 모두가 16시간, 24시간, 72시간 배양 후에도 동일한 억제환의 크기를 유지하고 있었다. 이것으로 볼 때, 각 추출물이 16시간 후에 이미 최대 항균력을 보이는 것으로 사료할 수 있으며 72시간 이후까지 항균효과가 지속적으로 유지되는 것을 알 수 있었다.
실험에서 사용된 환자분리균주에 대한 항생제 내성 테스트에서 다음과 같은 결과( Table 5 )를 얻을 수 있었다. 실험에 대조군으로 사용된 항생제인 tetracycline에는 내성을 보였고 ciprofloxacin에서는 감수성이 뛰어난 것으로 나타났다.
환자분리균주에 대한 추출물들의 희석률에 따른 항균력 비교 실험에서 S . Typhimurium에 대해 黃柏추출물의 항균력은 100%에서만 보였으며, 黃連, 黃連解毒湯, 黃芩은 100%, 50%까지 보여 표준균주 실험에 비해 항균효과가 감소하였다. 그러나 대조군으로 사용한 doxycycline에서는 억제환이 전혀 나타나지 않아 삼환계 항생제에 대한 내성을 보였고 반면 ciprofloxacin은 동일한 항균력을 유지하였다. 결론적으로 梔子를 제외한 네 가지 추출물들은 삼환계 항생제 내성을 갖는 S . Typhimurium에 대해 증식 억제 효과가 있음을 볼 수 있었다. 배양시간에 따른 항균효과 실험에서도 표준균주 실험에서와 같이 다섯 가지 추출물 모두가 16시간, 24시간, 72시간 배양 후에도 동일한 억제환의 크기를 유지했다.
미생물의 생육도 측정은 다섯 추출물 중에서 가장 높은 항균력을 보인 黃連으로 수행되었다. 측정결과 S . Typhimurium는 40 μl/ml 이상 농도에서 생육하지 못하였으며 그 이하 농도에서는 생육을 보이기는 했으나 대조군과 비교해 유의한 억제효과를 나타냈다. 결국 48시간까지 배양하는 동안 최소저해농도 이상에서는 균이 생육하지 못하였음을 알 수 있다.
이상의 결과를 종합해 볼 때, 黃連解毒湯, 黃連, 黃芩, 黃柏, 梔子는 S . Typhimurium에 대해 항균력을 가지는 것을 알 수 있다. 그러나 梔子의 항균력은 항생제로의 효과를 기대하기에 미미하였고 그 외 黃連解毒湯, 黃芩, 黃連, 黃柏은 유의한 항균력을 보였다. 이미 선행연구들에서 黃連, 黃柏의 berberine, 黃芩의 baicalein, wogonin 등의 성분들이 식중독 유발 세균들에 대해 항균효과가 있음이 밝혀졌는데 32 , 본 연구결과에서도 이들 한약재들과 복합처방인 黃連解毒湯이 표준균주 뿐만 아니라 삼환계 항생제 내성 균주까지도 여전히 항균력이 있는 것으로 나타나 앞으로 이들 물질들의 천연항생제로서의 역할을 기대해 볼 수 있었다.
그러나 본 연구는 희석액에서도 높은 항균력을 나타낼 수 있는 사용량에 대한 연구, 추출방식에 따라 수득률과 항균효과가 다른 것으로 알려져 있기 33 때문에 수득률과 효과가 가장 효율적인 추출 방식을 찾는 것에 대한 연구, 또한 한약재들의 항균력이 단순히 재료의 양에 의존적이지 않으므로 34 최대의 항균력을 보이는 약재 용량에 대한 연구, 그리고 생체에 투여되었을 때 나타나는 효과에 대한 실험적인 연구 등 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
V. 결 론
黃連解毒湯, 黃連추출물, 黃芩추출물, 黃柏추출물, 梔子추출물이 S . Typhimurium에 미치는 항균효과를 알아보기 위하여 표준균주, 환자분리균주 각각에 대해 추출물의 희석율⋅접종량에 따른 억제환(Inhibition zone) 비교 실험, 최소 성장억제 농도실험(MIC), 배양시간에 따른 항균효과 지속성실험을 실시하고 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 표준균주
  • 黃連解毒湯, 黃連, 黃柏, 黃芩은 50%까지 항균력을 보였다. 단지 梔子추출물은 100%에서만 항균력을 보였다.
  • 원액(100%)에서의 항균력은 접종량이 많아짐에 따라 더 우수한 항균력이 나타나는 것을 볼 수 있었다.
  • 黃連解毒湯의 MIC는 10%, 20 μl였다. 黃芩과 黃柏은 10%, 60 μl였고, 黃連은 10%, 20 μl였다. 梔子은 100%, 80 μl였다.
  • 시간에 따른 항균력은 16시간, 24시간, 72시간에서 유의한 차이가 없었다. 모든 추출물이S. Typhimurium에 대해 지속적인 항균력을 보였다.
- 환자분리균주
  • 삼환계 항생제에 내성을 가진S. Typhimurium 균주에 대해 梔子를 제외한 네 가지 추출물들은 표준균주 실험에 비해 감소하였지만 유의한 항균력을 보였다.
  • 표준균주 실험과 마찬가지로S. Typhimurium 분리균주에 대해서도 黃連解毒湯, 黃連, 黃芩, 黃柏, 梔子 모두 16시간, 24시간, 72시간 후에도 지속적인 항균효과를 보였다.
이상의 결과를 종합해보면 黃連解毒湯과 黃連, 黃柏, 黃芩, 梔子 추출물은 S . Typhimurium에 대해 모두 항균력을 보였다. 유의성 있는 항균력을 가진 추출물은 黃連解毒湯과 黃連, 黃芩이었다. 표준균주 실험과 환자 분리균주 실험을 비교하였을 때 梔子를 제외한 네 가지 추출물들은 삼환계 항생제에 내성을 가진 세균에 대해서도 항균력을 보였다.
Acknowledgements
· 이 논문은 2014년도 동신대학 대학원 한의학 박사학위 논문임
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