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Effect of Gagam-Danguieumja through Regulation of MAPK on LPS-Induced Inflammation in RAW 264.7 Cells
Effect of Gagam-Danguieumja through Regulation of MAPK on LPS-Induced Inflammation in RAW 264.7 Cells
The Journal of Korean Oriental Internal Medicine. 2013. Oct, 34(4): 339-348
Copyright © 2013, The Korean Society for Oriental Internal Medicine
  • Published : October 30, 2013
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Tae-yeon Kim

Abstract
Objectives :
Danguieumja is a traditional medicinal prescription to treat skin disease. It was commonly used for the treatment of itching, chronic urticaria and atopic dermatitis in Korea by the addition or omission of several herbs. This study investigated the anti-inflammatory potential of Gagam-Danguieumja (GDE) water extract.
Methods :
We examined the effects of GDE on the lipopolysaccharide (LPS)-induced production of nitric oxide (NO) in a murine macrophage cell line, RAW 264.7 cells.
Results :
GDE inhibited production of NO in a dose dependent manner and also decreased the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2). As a possible molecular mechanism of anti-inflammatory effect increased phosphorylation of mitogen-activating protein kinases (MAPK) by LPS were blocked by GDE treatment.
Conclusions :
These results suggest that GDE has an anti-inflammatory therapeutic potential through the inhibition of MAPK phosphorylation, thereby decreasing the expression of pro-inflammatory genes.
Keywords
Ⅰ. 서 론
염증은 인체에 침입한 병원체나 내인적으로 유발되는 염증활성인자를 인지하고 제거하기 위해 활성화되는 인체의 적극적인 생체 방어 기전이다. 적절한 염증 반응은 외•내인적 인자로부터 인체를 보호하는 필수 불가결한 반응이나, 과도하고 부적절한 염증 반응은 정상 조직의 파괴와 더불어 암과 대사성 질환 등 다양한 질환의 원인으로 작용할 수 있다 1 .
대식세포를 매개로 한 염증 반응에 있어 nitric oxdie(NO) 생성 효소인 inducible nitric oxide synthase(iNOS), prostaglandin 생합성의 속도조절 단계 효소인 cyclooxygenase-2(COX-2)의 발현 조절과 이들 유전자의 발현에 있어 주요 신호전달 분자인 mitogen-activated protein kinase(MAPK)의 활성 조절은 염증 반응을 조절하기 위한 핵심요소로서 인식되고 있으며, 이들 인자들의 활성을 조절하여 염증 반응을 조절하기 위한 신규 소재 발굴 연구가 활발히 진행되어 왔다 2 .
當歸飮子는 嚴의 濟生方 3 에 처음 수록된 處方으로 “治心血凝滯, 內蘊風熱, 發見皮膚, 遍身瘡疥, 或腫或痒, 或膿水浸淫, 或發赤疹㾦”의 목적으로 立方 되어 血燥와 風熱로 인한 瘡疥, 피부 소양증, 만성두드러기 등의 치료에 응용되고 있다 4 . 加減當歸飮子( Gagam-Danguieumja , GDE) 5 는 當歸飮子에 淸熱解毒, 發散風熱, 補陰益氣, 理氣燥濕, 溫補脾胃하는 數種의 약재를 가하여 陰血損傷, 脾虛氣血不調로 쉽게 慢性으로 傳變되는 아토피성 피부염4에 사용하기 위하여 作方되었다.
當歸飮子에 대한 연구로는 乾癬에 활용되는 加味當歸飮子에 대한 실험 6 및 임상적 고찰 7,8 , 當歸飮子水抽出液이 抗 allergy 反應과 mouse의 免疫細胞機能에 미치는 영향 9 , 加味當歸飮子 10 , 當歸飮子加減方 11 과 外治方병용 12,13 이 아토피 동물 모델에 미치는 영향, anticonvulsant hypersensitivity syndrome 치험례 보고 14 등이 있으나 임상에서 아토피 피부염을 치료하는 처방으로 사용되고 있는 GDE가 MAPK 조절에 미치는 영향에 관한 연구는 아직까지 보고 되지 않았다.
본 저자는 염증성 질환에 대한 GDE의 효과를 확인하기 위하여 GDE를 RAW 264.7 cells에 전처리한 후 lipopolysaccharide(LPS)로 유도된 NO의 생성 및 iNOS와 COX-2 발현에 미치는 영향과 GDE가 염증반응의 주요 신호전달 분자인 MAPK의 인산화를 차단하여 염증매개물질에 대한 염증 억제 효과를 나타내는지에 대하여 연구한 결과 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
Ⅱ. 재료 및 방법
- 1. 재 료
- 1) 약재의 추출
본 실험에 사용된 GDE 2첩(240 g)은 세명대학교 제천한방병원에서 구입하였으며 증류수로 水洗한 뒤 3 L의 증류수를 加하여 3 시간 동안 가열 추출하였다. 추출된 용액을 원심분리를 통하여 상층액을 취한 뒤 Rotary evaporator(NE-1001, EYELA, JAPAN)로 200 ml가 되도록 감압 농축한 후 -80 ℃에서 동결시켰다. 이를 다시 Freeze dryer system(Labconco, USA)을 이용하여 7일 간 동결건조 시킨 후 58.9 g의 분말을 얻었다. GDE의 수득율은 23.75%로 -20 ℃에 보관하였다가 실험 직전 생리 식염수나 배지에 희석하여 microfilter paper(Whattman no. 2, 0.45-0.2 μm)로 syringe filtering 후 실험에 사용하였다.
Composition ofGagam-Danguieumja
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Composition of Gagam-Danguieumja
- 2) 시 약
본 실험에 사용된 LPS(Escherichia coli O55:B5), Sodium deoxycholate, NaCl, Tris-HCl, Sodium pyrophosphate는 Sigma-Aldrich, Inc.(St Louis, MO, USA)으로부터, FBS, penicillin, streptomycin, DMEM 및 trypsin-EDTA solution은 Gibco BRL(NY, USA)로부터, Methylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), Trizol 및 DMSO는 Amresco(Cochran Road Solon, OH, USA)로부터, Nitric Oxide Detection kit는 Intron Biotechnology(Sungnam, Korea)로부터, EZ-Western Detection Kit는 Dogen(Seoul, Korea)으로부터, DC Protein Assay Kit는Bio-Rad Laboratories(Hercules, CA, USA)로부터, RNeasy protect mini kit, QuantiTect Reverse Transcription kit, QuantiTect SYBR Green PCR kit는 Quagen(Hilden, Germany)로부터, protein extraction buffer인 Proprep은 Intron Biotechnology(Seoul, Korea)로부터, Rabbit antiphospho-extracellular-regulated protein kinase(ERK), anti-ERK, anti-phospho-c-Jun NH 2 -protein kinase (JNK), anti-JNK, anti-phospho-p38, anti-p38 및 anti-β-actin primary antibody는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)으로부터, Goat Anti-Rabbit HRP-conjugated secondary antibody는 ABcam(Cambridge, MA, USA)으로부터 구입하여 사용하였다.
- 2. 방 법
- 1) 세포배양
RAW 264.7 cells은 한국 세포주 은행(Korea Cell Line Bank, KCLB, No. 40071) (Seoul, Korea)에서 분양받았으며 세포의 배양을 위하여 10% heatinactivated FBS과 1% penicillin 및 streptomycin을 포함한 DMEM 배양액에서 배양하였다. 세포는 37 ℃ 5% CO 2 조건하에서 배양하였고, 2일마다 배지를 교환하였으며, 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 계대 배양하였다.
- 2) MTT assay
RAW 264.7 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 96 well plate(Corning, USA)에 5×10 4 cells/ml의 세포수가 되도록 100 μl씩 분주하여 37℃, 5%, CO 2 incubator에서 24시간 배양한 후 GDE 를 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 mg/ml의 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 5 mg/ml의 MTT를 각 well에 20 μl 넣고 잘 섞어 준 후 4시간 동안 37 ℃ incubator에서 배양한 후 상층액을 제거하고 DMSO를 200 μl씩 분주하여 well에 생성된 formazan이 잘 녹을 수 있게 충분히 흔들어 모두 녹인 후 Synergy 2 microplate reader(BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 3회의 측정으로 그에 대한 평균값과 표준 편차를 구하였다.
- 3) NO assay
RAW 264.7 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 96 well plate(Corning, USA)에 5×10 4 cells/ml의 세포수가 되도록 100 μl씩 분주하여 37℃, 5%, CO 2 incubator에서 24시간 배양한 후 GDE를 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 mg/ml의 농도로 전처리하여 1시간 동안 배양한 후, LPS를 1 μg/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 상등액을 100 μl씩 취해 새로운 96 well plate에 넣은 후 Nitric Oxide Detection kit의 N1 buffer를 50μl 첨가하고 10분간 incubator에 넣었다가 꺼낸 후, 다시 N2 buffer를 넣고 10분간 상온방치 한 뒤에 Synergy 2 microplate reader(BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 3회 측정 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 편차를 구하였다. 표준품으로 Nitrite standard를 사용하여 표준 용량곡선을 작성하고 질소산화물(nitrite, NO 2 - )의 생성을 산출하였다.
- 4) Real time RT-PCR
RAW 264.7 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 100 mm cell culture dishes(SPL Lifesciences Inc, Korea)에 5×10 5 cells/ml의 세포수가 되도록 10 ml씩 분주하여 37 ℃ 5% CO 2 incubator에서 24시간 배양하였다. 새로운 DMEM 배지로 교환한 뒤 GDE(2 mg/ml)를 세포에 처리하여 1시간 동안 배양하고 자극제 LPS(1 μg/ml)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. RNeasy protect mini kit를 이용하여 spin column에 추출된 총 RNA는 QuantiTect Reverse Transcription Kit로 역전사(reverse transcription) 시킨 후 QuantiTect SYBR Green PCR kit를 이용하여 실시간 유전자 증폭(Real-time PCR)을 시행 하였다. recation mixture는 cDNA template 2 μl, SYBR Green PCR master mix 10 μl, primers 각 5pM에 RNase free water를 넣어 총 20 μl의 양으로 시행하였다. 온도조건은 95 ℃에서 15분간 전변성 반응 후, 94 ℃ 15초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 30초의 3단계를 한 주기로 55주기를 반복하였다.
mRNA 발현 정도는 유전자 정량 증폭 장비인 Rotor Gene Q 및 software(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정량 분석하였으며 iNOS, COX-2의 mRNA 정량분석시 housekeeping 유전자인 Cyclophilin을 internal control로 삼아 표준화 시켰다. primer 각각의 염기서열은 다음과 같다( Table 2 ).
The Primers for RT-PCR Analysis.
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The Primers for RT-PCR Analysis.
- 5) Western blot
RAW 264.7 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 100 mm cell culture dishes에 5×10 5 cells/ml 의 세포수가 되도록 10 ml씩 분주하여 37℃ 5% CO 2 incubator에서 24시간 배양하였다. 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 GDE(2 mg/ml)로 세포에 처리하여 1시간 동안 배양한 후 MAPK 활성을 측정하기 위하여 LPS(1 μg/ml)에 10분 동안 expose하였다. 반응이 종료된 후 배지를 제거하고 Cold PBS로 세척한 후 protein extraction buffer인 Proprep을 사용하여 protein을 추출하였다. Protein content를 DC Protein Assay Kit를 사용하여 정량 하여 20 μg의 단백질을 l0% sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 분리하고, Hypond-PVDF membrane(Amersham, Little Chalfont, UK)으로transfer하였다. Transfer된membrane은 Tris-buffered saline Tween 20(TBST ; 20 mM Tris, pH 7.6, 136 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 용해된 5% skim milk에 1시간 동안 실온에서 blocking 한 후 anti-phospho-ERK와 anti-ERK, anti-phospho-JNK와 anti-JNK, anti-phospho-p38과 anti-p38 MAP kinase와 β-actin primary antibody(1:1000 dilution)로 4 ℃에서 overnight 반응한 후 TBST로 3회 washing 하고, HRP-conjugated secondary antibody(1:1000 dilution)로 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. TBST로 3회 세척한 후 EZ-Western Detection Kit로 면역반응성 단백질 밴드를 발색시킨 후, 웨스턴이미 지분석시스템인 FUSION-SL2-3500.WL 및 FUSIONCAPTsoftware(Vilber Lourmat, Eberhardzell, Germany)를 사용하여 분석하였다.
- 3. 統計분석
각 실험군 간의 통계학적 분석은 SPSS 17.0 K for Windows 통계 프로그램 패키지를 사용하여 oneway-analysis of variance를 실시하였으며 유의수준은 p <0.05로 하였다
Ⅲ. 결 과
- 1. 加減當歸飮子의 세포독성 실험
GDE가 RAW 264.7 cells의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 아무런 처리를 하지 않은 대조군의 흡광도 평균을 100으로 정하고 각 흡광도 값을 환산하여 계산한 결과, 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 mg/ml 농도에서의 상대적 흡광도는 100.0±7.8, 105.3±7.0, 109.6±5.3, 112.2±7.5, 111.1±6.5, 99.9±6.2, 96.7±7.3, 97.1±7.0으로, GDE 처치 전 농도에서 대조군과의 유의한 차이는 관찰되지 않았다( Fig. 1 ).
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Effects of GDE extract on the cell viability of RAW 264.7 cells. Representative sticks show that cell viability in RAW 264.7 cells by GDE extract (25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 500 μg/ml, 1000 μg/ml, 2000 μg/ml) treated for 24h at 37 ℃. Cell viability was measured by MTT assay as described in materials and methods.GDE : Gagam-Danguieumja, MTT : methylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide.
- 2. 加減當歸飮子의 NO 생성 감소 효과
LPS 자극에 의한 RAW 264.7 cells의 NO 생성 증가 기전에 미치는 GDE의 작용을 확인하기 위하여 NO assay를 실시하였다. LPS만 처리한 대조군의 NO 생성량은 7.02±0.24 μm 이었으며, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 mg/ml 농도군에서의 NO 생성량은 각각 6.79±0.25, 7.40±0.21, 6.76±0.23, 6.86±0.26 μm로 대조군과 유의한 차이가 관찰되지 않았으나 0.5, 1, 2 mg/ml농도군에서의 NO 생성량은 5.79±0.21, 4.54±0.17, 3.28±0.15 μm로 대조군에 비하여 유의한 감소 효과(* p <0.05, † p <0.001)를 나타내었다( Fig. 2 ).
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Effects of GDE extract on nitric oxide concentration in RAW 264.7 cells. Representative sticks show that nitric oxide concentration in RAW 264.7 cells by GDE extract (25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 500 μg/ml, 1000 μg/ml, 2000 μg/ml) treated for 24 h. Nitrite oxide was measured by nitirc oxide detection kit‘s method.GDE : Gagam-Danguieumja, NO : nitric oxide * p<0.05, † p<0.001 compared with control.
- 3. 加減當歸飮子의 iNOS mRNA 발현 감소 효과
RAW 264.7 cells 에서 iNOS mRNA의 상대적 발현을 관찰한 결과, 무처치군과 GDE 단독 처리군 경우 각각 0.001±0.0, 0.011±0.001의 값을 나타내었으며, GDE+LPS 처리군(0.051±0.012)의 경우 LPS 단독 처리군(0.153±0.012)의 33.3%로 유의성 있는 감소를 나타내었다( Fig. 3 ).
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Degree of relative iNOS mRNA expression by GDE in the LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Analysis of relative iNOS mRNA expression in RAW 264.7 cells was done by quantitative Real-time RT-PCR. RAW 264.7 cells were treated with GDE (2 mg/ml) or without for 24 h in the absence or presence of LPS (1 μg/ml). Cyclophilin was used as internal control genes.GDE : Gagam-Danguieumja, LPS : Lipopolysaccharide, iNOS : inducible nitric oxide synthase† p<0.001 compared to the only LPS treated group.
- 4. 加減當歸飮子의 COX-2 mRNA 발현 감소 효과
RAW 264.7 cells 에서 COX-2 mRNA의 상대적 발현을 관찰한 결과, 무처치군과 GDE 단독 처리군 경우 각각 0.006±0.001, 0.103±0.014의 값을 나타내었으며, GDE+LPS 처리군(5.128±0.814)의 경우 LPS 단독 처리군(7.718±0.788)의 66.4%로 유의성 있는 감소를 나타내었다( Fig. 4 ).
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Degree of relative COX-2 mRNA expression by GDE in the LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Analysis of relative COX-2 mRNA expression in RAW 264.7 cells was done by quantitative Real-time RT-PCR. RAW 264.7 cells were treated with GDE (2 mg/ml) or without for 24 h in the absence or presence of LPS (1 μg/ml). Cyclophilin was used as internal control genes.GDE : Gagam-Danguieumja, LPS : lipopolysaccharide, COX-2 : cyclooxygenase-2* p<0.01 compared to the only LPS treated group.
- 5. 加減當歸飮子의 MAPKs 경로의 인산화 억제 효과
RAW 264.7 cells 에서 MAPKs 경로의 인산화 정도를 western blot을 통해 관찰한 결과, GDE+LPS 처리군의 P-p38, P-ERK(P-p44․P-p42), P-JNK(P-p54․P-p46) 발현은 각각 69.7%, 61.1%․68.2%, 80.0%․91.3%로 LPS 단독 처리군(100%)에 비하여 감소되었음을 확인할 수 있었다 (Fig. 5 , 6 , 7 , 8 ).
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Effect of GDE on LPS-induced phospholyration (P-) of MAPKs in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were treated with GDE (2 mg/ml) or without for 1 h before being incubated with LPS (1 μg/ml) for 10 min. Whole-cell lysates were analyzed by western blot analysis.GDE : Gagam-Danguieumja, LPS : lipopolysaccharide
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Effect of GDE on LPS-induced phosphorylation of p38 in RAW 264.7 cells.
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Effect of GDE on LPS-induced phosphorylation of ERK in RAW 264.7 cells.
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Effect of GDE on LPS-induced phosphorylation of JNK in RAW 264.7 cells.
Ⅳ. 고 찰
當歸飮子는 嚴의 濟生方 3 에 처음 수록된 處方으로 四物湯을 기본방으로 하여 補肝腎하는 何首烏, 風熱을 거하여 皮膚搔痒과 瘡을 치료하는 白蒺藜, 風熱을 發散시키는 荊芥防風, 托瘡生肌하는 黃芪, 諸藥을 調和시키고 解毒作用을 하는 甘草 15-17 를 가하여 “治心血凝滯, 內蘊風熱, 發見皮膚, 遍身瘡疥, 或腫或痒, 或膿水浸淫, 或發赤疹㾦”의 목적으로 立方되었으며 血燥와 風熱로 인한 瘡疥, 피부 소양증, 만성 두드러기 등의 치료에 응용되고 있다 4 . 當歸飮子에 대한 연구로는 乾癬에 활용되는 加味當歸飮子에 대한 실험 6 및 임상적 고찰 7 , 8 , 當歸飮子水抽出液이 抗allergy 反應과 mouse의 免疫細胞機能에 미치는 영향 9 , 加味當歸飮子 10 , 當歸飮子加減方 11 단독 사용 또는 外治方병용 12,13 이 아토피 동물 모델에 미치는 영향, 열 피부발진 소양감 림프절종대 등을 특징으로 하는 anticonvulsant hypersensitivity syndrome 치험례 14 등이 있다.
GDE 5 는 宋代曹世榮의 活幼心書에서 아토피 피부염의 한의학적 범주 중 하나인 胎熱의 원인으로 ‘此因在胎 母受時氣邪毒 或外感風熱或食五辛薑麵 過多 治令熱蘊於內 熏蒸胎中’ 18 이라 한 것에 근거하여 當歸飮子에 淸熱解毒, 發散風熱, 補陰益氣, 行氣 燥濕, 溫補脾胃하는 數種의 약재를 가하여 陰血損傷, 脾虛氣血不調로 쉽게 慢性으로 傳變되는 아토피성 피부염 4 에 사용하기 위하여 作方되었다.
염증 신호는 세포 내에서 다양한 신호전달 분자들을 활성화시키는데, 이 중 MAPK는 인산화를 통하여 nuclear factor-κB(NF-κB), activator protein-1(AP-1), activating transcription factor-2, cAMPresponsive element binding protein을 포함한 다양한 전사인자들을 활성화시키는 핵심 신호전달 분자로 보고되고 있다 19,20 . 따라서 대식세포를 매개한 염증 반응에 있어 NO 생성 효소인 iNOS, prostaglandin 생합성의 속도조절 단계 효소인 COX-2의 발현 조절과 이들 유전자의 발현에 있어 주요 신호전달 분자인 MAPK의 활성 조절은 염증 반응을 조절하기 위한 핵심요소로서 인식되고 있다 2 .
대식세포(macrophage)는 LPS를 비롯한 다양한 병원체 유래 인자에 의해 활성화되며, 외래 인자 탐식을 위하여 NO, prostanoid 등의 지방대사체, tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin(IL)-1β, IL-6 등의 전염증성 cytokine, chemokine 등 염증 매개인자를 유리함으로써 외래 인자를 제거하기 위한 내재면역계의 효능세포로서 중요한 역할을 담당한다 1 . 본 연구에 사용된 RAW 264.7 cell은 항염증 약물의 효능을 검증하고, 전구 염증 매개 인자들의 유도를 주도하는 신호전달경로의 억제효능을 가진 약물을 평가하기 위한 실험모델로 가장 일반적으로 사용하고 있다 21 . 본 연구에서 RAW264.7 cell 의 생존률과 증식을 저해하지 않는 GDE의 농도를 조사한 결과 2 mg/ml 이하의 농도에서 GDE가 정상세포와 유의한 차이를 보이지 않았다.
LPS는 생체 내에서 염증을 일으키는 inflammagen 으로 널리 사용되어 왔다. LPS는 염증반응 병원체의 중심적 역할을 하며, nitric oxide(NO), prostaglandin E 2 (PGE 2 ) 및 leukotriene과 같은 염증매개체의 생성을 자극하며, 이 염증매개체의 신호경로를 자극 한다 22,23 . 본 연구에서는 GDE의 염증성 질환에 대한 효과를 확인하기 위하여 RAW 264.7 cells에 LPS를 처리함으로써 NO 생성, iNOS와 COX-2 발현, MAPK의 인산화를 유도하였다.
NO는 nitric oxide syntheses(NOS) 효소군에 의하여 L-arginine으로부터 합성된다. NOS는 인체내 생리학적 합성조절에서 중요한 역할을 하는데 이들은 neuronal NOS(nNOS), inducible NOS(iNOS), endothelial NOS(eNOS)와 같은 3가지의 형태로 존재한다. 그 중, iNOS는 염증조절을 일으키는 중요한 효소 중 하나이다 23 . iNOS는 Ca 2+ 비의존성 경로를 통해서 장시간에 걸쳐 증가하여 다량의 NO를 형성한다 24-26 . iNOS 발현은 murine macrophage, 내피세포, 평활근세포 및 심근 세포 등 많은 세포에서 관찰되고 있다. 인간의 iNOS는 염증성질환이 있는 환자의 macrophage에서 다량의 NO를 생성하여 세균 침입을 억제하거나 혹은 T-세포증식을 억제하여 국소 염증반응을 하향시키는 방어에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 보고되고 있다 27 . 그러나 과도한 iNOS의 발현은 NO의 생성량을 증가시켜 그 자체의 독성 효과에 의해 주위 세포의 손상을 야기한다 28 . 본 연구에서 NO 생성을 감소시키는 GDE의 농도를 조사한 결과 500 μg/ml 이상의 농도에서 유의성 있는 감소 효과를 확인할 수 있었으며 GDE 처리군의 iNOS mRNA 발현 또한 미처리군에 비해 억제됨을 확인할 수 있었다.
iNOS와 더불어 대표적인 전구염증매개 효소인 COX는 arachidonic acid를 염증매개 인자인 prostaglandins (PGs)로 전환시키며 COX-1과 COX-2로 존재한다. 그 중 COX-2는 정상적인 생리조건에서는 거의 발현되지 않으나 사이토카인, 박테리아 독소, LPS와 같은 염증 신호에 의해 발현되어 많은 양의 PGs를 생성하여 염증을 유도한다. 따라서 COX-2의 억제는 염증과 통증을 감소시킬 수 있다 29-32 . 본 연구에서 GDE 처리군의 COX-2 mRNA 발현 또한 미처리군에 비해 억제됨을 확인할 수 있었다.
다양한 외부자극에 의한 전사인자의 활성화로 전구염증매개 효소인 COX-2나 iNOS 발현이 유도되는 과정은 현재까지 비교적 잘 특성화된 주요 MAPK superfamily에 속하는 세 가지 효소인 ERK, JNK 및 serine/threonine-protein kinase 중 하나인 p38을 통해 설명되고 있다 33 .
이들 MAPKs는 모두 다양한 세포외 자극에 반응해 upstream MAPK kinase(MEK)에 의해 tyrosine과 threonine에서 인산화가 일어남으로써 활성화된다. 상기 MAPKs의 활성형은 그 후에 다른 kinase나 전사 인자를 인산화 활성화 시키고, 결국 표적 유전자의 발현을 변화시킨다 33 . 본 실험에서 RAW264.7 cells에서 LPS로 유도된 JNK1 2, ERK1 2와 p38 MAPK 활성화에 어떠한 영향을 미치는지 westernblot을 통하여 확인한 결과 GDE는 MAPKs 신호전달 체계에 억제효과가 있었다.
결과적으로 본 실험에서 GDE는 LPS로 자극된 RAW 264.7 cells에서 NO생성을 억제하였다. 이와 같은 항염증반응효과는 iNOS와 COX-2의 mRNA발현을 효과적으로 감소시킴으로써 일어나며, MAPK경로의 억제를 통해 NO생성을 경감시키는 것으로 사료된다. 이러한 결과들을 통해 GDE은 항염증 효과를 지니고 있으며 향후 GDE가 단백질 수준에서 염증 발현에 관여하는 iNOS와 COX-2의 억제효과 확인, NF-kB signaling 관련 여부, COX-2에 의해 생성되는 염증매개인자인 PGs 확인 등의 추가적인 연구를 통해 피부 질환을 비롯한 각종 염증 질환의 효과적인 치료처방으로 제시될 수 있을 것으로 사료된다.
Ⅴ. 결 론
GDE가 염증에 관여하는 여러 인자들에 미치는 영향을 알아보고자, LPS로 활성화시킨 RAW 264.7cells에서 염증과 관련된 NO의 양, iNOS 및 COX-2 의 발현에 미치는 효과와, MAPK 경로에 미치는 효과에 대하여 실험한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
  • 1. GDE는 NO 생성을 억제하였다
  • 2. GDE는 iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 감소시 켰다
  • 3. GDE는 mitogen-activated protein kinase(MAPK) 경로인 p38, ERK, JNK의 인산화를 억제하였다.
이러한 결과를 바탕으로 GDE는 항염증효과가 있을 것으로 사료된다.
Acknowledgements
본 연구는 지식경제부의 지역혁신센터사업으로 수행되었음(RIC-07-06-01).
References
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