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Ethyl Acetate Fraction of Cnidium monnieri(L). Cussion Suppresses PAM plus A23187-induced Inflammation Reaction through Blockade of NF-κB and MAPK activation
Ethyl Acetate Fraction of Cnidium monnieri(L). Cussion Suppresses PAM plus A23187-induced Inflammation Reaction through Blockade of NF-κB and MAPK activation
Korean Journal of Pharmacognosy. 2015. Sep, 46(3): 195-202
Copyright © 2015, The Korean Society of Pharmacognosy
  • Received : August 13, 2015
  • Accepted : September 21, 2015
  • Published : September 30, 2015
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옥화 강
상영 김
동렬 권
sssimi@wku.ac.kr

Abstract
Cnidium monnieri (L). Cussion is used as a tonic agent in traditional oriental medicine. However, the molecular mechanism of mast cell-mediated anti-inflammatory modulation has not been fully understood. The aim of the present study was to demonstrate the effects of Cnidium monnieri (L). Cussion eathyl acetate fraction on the expression of pro-inflammatory cytokines, as well as to elucidate its mechanism of action in the human mast cell line (HMC-1). Cells were stimulated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) plus A23187 in the presence or absence of Cnidium monnieri (L). Cussion eathyl acetate fraction. Cnidium monnieri (L). Cussion eathyl acetate fraction significantly inhibited the PMA plus A23187-induction of inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-6 and IL-8. Moreover, EtOAc fraction attenuated cyclooxygenase (COX)-2 expression. In activated HMC-1 cells, phosphorylation of extra-signal response kinase (ERK) 1/2 decreased after treatment with EtOAc fraction. Moreover EtOAc fraction inhibited PMA plus A23187-induced nuclear factor (NF)-κB activation, IκB degradation. EtOAc fraction suppressed the expression of TNF-α, IL-6, IL-8 through a decrease in the ERK 1/2, as well as activation of NF-κB. These results indicated that Cnidium monnieri (L). Cussion EtOAc fraction exerted a regulatory effect on inflammatory reactions mediated by mast cells.
Keywords
재료 및 방법
약재 − 본 실험에 사용된 벌사상자는 (주)백제허브(대전, 한국)에서 구입하고, 원광대 한약학과(권동렬 교수)에서 감정한 것을 사용하였으며, 표준품은 원광대학교 한약학과 본초학실험실의 표본실에 보관하였다.
시약 및 기기 − 세포배양에서 필요한 Iscove’s Modified Dulbecco’s Media(IMDM) 배지는 Welgene(Daegu, Korea) 제품을, Fetal bovine serum(FBS)는 Hyclone(New zealand) 제품을 구입해 사용하였다. Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA), Calcium Ionophore A23187, Penicillin-Streptomycin, Bovine Serum Albumin(BSA)는 Sigma(St. Louis, Mo, USA)에서, CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)는 Promega(Madison, Wisconsin, USA)에서, Human IL-6, IL-8 ELISA Set는 BD Biosciences(San Diego, USA)에서, Western blot 실험에서 필요한 Protein Extraction Solution은 iNtRON Biotechnology(Gyeonggi-do, Korea)에서, Ponceau S solution은 Sigma(St. Louis, Mo, USA), EzReprobe은 ATTO(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 항체인 ERK 1/2, JNK 1/2, p38, COX-2, β-actin, NF-κB, IκBα, p-IκBα, antirabbit은 Santa Cruz Biotechnology(Santacruz, CA, US)에서, anti-mouse IgG은 Life-Technonlogies와 anti-goat IgG은 kirkegaard &Perry Laboratories Inc.에서, Easy Blue total RNA Extraction kit는 iNtRON Biotechnology(Gyeonggi-do, Korea), Reverse Transcription kit 는 Giagen (Valencia, CA, USA), Sensi 2 × PCR premix은 Lugen, Gel red, 6 × loading buffer는 Dynebio(Gyeonggi-do, Korea), Primer는 Bioneer(Daejeon, Korea)에서, Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents는 Thermo Scientifeic(MA, USA)에서 구입해 사용하였다.
세포배양 − 실험에 사용한 사람 비만세포주 HMC-1는 항생제(100 U/ml Penicillin, 100 U/ml Streptomycin)와 10% FBS가 첨가된 IMDM 배지에서 37℃, 5% CO 2 incubator에 적응시켜 배양하였다. 계대 배양은 이틀에 한번씩 하였다.
추출물의 제조 − 벌사상자 50 g과 70% EtOH 500 ml를 넣어 2시간씩 3회 추출한 다음 감압 농축하여 동결 건조한 후, 벌사상자 70% EtOH 추출물(4.3 g)을 얻었다. 추출물을 물에 현탁시킨 후, 극성이 낮은 용매부터 극성이 높은 용매 순으로 용매분획을 각각 3회씩 반복 수행하여 감압농축, 동결 건조 한 후, n-hexane(1.6 g), Dichloromethane(0.9 g), EtOAc(1.2 g), n-BuOH(0.43 g) 분획물을 얻었다. 시료는 실험에 사용하기 전 밀봉하여 냉동보관(-20℃) 하였다( Scheme 1 ).
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Fractionation of Cnidium monnieri (L). Cussion.
MTS assay − 세포독성은 MTS assay를 이용하여 확인하였다. HMC-1을 96 well plate에 5×10 4 cells/well 로 분주한 후, 30분 뒤 시료를 농도별로 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, MTS solution을 20 μl씩 첨가한 후, 37℃, 5% CO 2 incubator에서 2시간 배양하였다. Microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
ELISA assay- HMC-1을 48 well plate에 5×10 5 cells/well 로 분주하였고, 30분 뒤 시료를 각 각 처리한 후, 1시간 뒤 PMA(50 nM)와 A23187(1 μM)를 처리 하고 8시간 뒤, 세포를 가라앉게 한 후, 배양 상층액을 수거하였다. 4℃에 하룻밤 동안 있던 1차 항체 coating plate를 다음날, 30분 실온 상태로 둔 뒤, 3번 wash buffer로 세척 후, Assay buffer를 200 μl 분주하였다. 1시간 뒤 3번 세척하였다. sample과 standard를 100 μl 분주 후, 2시간 실온 상태로 두었다. 5번 세척하고, working Detector(2차 항체 + SA-HRP) 100 μl 분주 후, 1시간 실온 상태로 두었다. 7번 세척 후, Substrate Solution을 100 μl 분주하고, 암실에서 최대 30분 기다렸다. 마지막으로, Stop Solution(1MH3PO4)을 50 μl 분주한 후, Microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
RNA 분리 및 RT-PCR − HMC-1을 6 well plate에 3×10 6 cells/well 로 분주하였고, 30분 뒤 시료를 각 각 50, 100 250 μg/ml 처리한 후, 1시간 뒤 PMA(50 nM), A23187(1 μM)로 자극하고 6시간 뒤, 세포를 수집하였다. PBS로 세척하여 Easy Blue 1 ml을 넣고 용해시킨 뒤, Chloroform을 400 μl 첨가하고 vortexing 후, 원심 분리(13,000 rpm, 10분)하였다. 상층액 400 μL을 새로운 tube에 옮기고, isopropanol을 동량 넣어주었다. tube을 2회 inverting 하고 실온에 10분간 두었다. 원심분리(13,000 rpm, 5분)하였다. 상층액을 버리고, 70% EtOH 1 ml을 넣고 2회 세척한 후, 건조시켜 DEPC가 처리된 증류수에 용해시킨 후, Nano Drop 기계로 A260/A280 nm의 비율이 1.6~2.0 범위 내의 값을 갖는 RNA 시료를 실험에 사용하였다.
cDNA 합성은 Reverse Transcription kit를 사용하였다. cDNA에 IL-6, IL-8, GAPDH, COX-2 Primer를 넣고 유전자 증폭기를 이용하여 증폭시켰다. 2% Agarose Gel에 Gel red를 1:10,000 희석시켜 전기영동 한 후, UV 검출기로 발현 정도를 확인하였다. RT-PCR을 위해 여러 개의 primer를 사용하였다. Primer의 구성은 다음과 같다( Table 1 ).
Primer sequences for RT-PCR
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Primer sequences for RT-PCR
핵과 세포질 추출 및 Western blot analysis- 핵과 세포질 추출은 Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents 를 사용하였다. cell volume이 20 μl 일 때, CER 을 200 μl 넣고 pellet을 15초 동안 최고로 세게 vortexing 하였다. 그리고 얼음에 10분 두고, CER 를 11 μl 넣고 5초 동안 최고로 vortexing 하였다. 얼음에 1분간 둔 뒤, 5초 동안 최고로 vortexing 한 후, 원심분리(13,000 rpm, 5분) 하였다. 즉시, 상층액(세포질 추출)을 새로운 tube에 옮겨담았다. 남아있는 pellet에 NER을 100 μl 넣고, 15초 동안 최고로 vortexing 하였다. 얼음에 sample을 40분간에 두는데, 10분마다 15초 동안 vortexing 하였다. 40분 뒤, 원심분리(13,000 rpm, 10분)하였다. 즉시 상층액(핵 추출)을 새로운 tube에 옮겨 담았다.
HMC-1를 6 well plate에 5×10 6 cells/well로 분주하고, 30분 뒤 시료를 50, 100, 250 μg/mL 처리한 후, 1시간 뒤 PMA(50 nM), A23187(1 μM)로 자극하고 1시간 뒤, 세포를 수집하였다. PBS로 세척 한 뒤, lysis buffer를 200 μl 넣고, 20분 동안 lysis 한 후, 원심 분리(13,000 rpm, 5분) 하였다. 단백질 정량은 BSA와 Bio-Radprotein Assay Kit를 사용하였고, microplate reader를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하고 정량하였다. 만들어진 단백질을 12% SDS-PAGE로 변성 분리하여, 이를 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane에 15 V에서 1시간 동안 Transfer하였다. 그리고 Ponceau S solution으로 염색 한 후, Transfer가 잘 되었는지 확인하였다. 염색을 TBS-T(TBS + 0.05% Tween 20)용액으로 세척한 후, membrane을 5% skim milk가 첨가된 TBS-T 용액에 상온에서 1시간 동안 blocking 하였다. 1차 항체 반응은 1차 항체를 5% skim milk에 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 수행하였다. TBST로 3회 15분씩 세척하였다. 2차 항체 반응은 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG, anti-rabbit IgG를 1:2,000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 뒤, TBS-T로 3회 15분씩 세척하여 ECL Substrate에 반응 후, ImageQuant TM LAS 4000 mini을 이용하여 단백질 발현량을 분석하였다.
통계분석 − 모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치±표준편차(SEM)를 구하여 그 유의성은 Student’s t-test(SPSS. ver.19) 분석법을 이용하여 신뢰수준 95%( p <0.05)에서 통계적 유의차를 평가하였다.
결과 및 고찰
벌사상자가 세포 생존에 미치는 영향을 측정하기 위해, MTS assay를 통해 확인하였다. 실험 결과, 추출물(10, 50, 100 μg/ml), n-hexane 분획물(10 μg/ml), Dichloromethane 분획물(10, 50 μg/ml), EtOAc 분획물(10, 50, 100, 250 μg/ml), n-BuOH 분획물(10, 50, 100, 250, 500 μg/ml)에서 85~100%의 생존율을 보여 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다( Fig. 1 ). 인간 비만세포주인 HMC-1 세포를 PMA(phorbol12-myristate 13-acetate)와 A23187(calcium ionophore)로 자극 하였을 때 in vitro 실험모델에서, 염증반응 매개인자를 연구하는데 잘 알려져 있다. 18) PMA와 A23187는 세포질 내의 Ca 2 농도 상승에 의해 각종 Ca 2 감수성 조절인자에 작용하여 일련의 비만세포 활성화 반응에 관여한다. 염증반응에서 관여하는 세포들 간의 복합적 상호작용은 cytokines 이라고 불리는 단백군에 의해 매개된다. 특히, IL-6은 비만세포에서 생성되어, 조혈작용과 염증을 조절하는데 관여하는 다양한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 5) IL-8은 호산구 화학주성인자이며, 염증 반응에 있어서 중요한 역할을 하는 chemokines이다. 6) 본 연구에서, PMA와 A23187로 활성화된 HMC-1에서 벌사상자 추출물과 분획물을 처리하여 전염증성 사이토카인의 생성양을 측정해본 결과, EA 분획물에서 IL-6, IL-8과 TNF-α의 생성을 모두 억제하였다( Fig. 2 ). 특히, EA 분획물 250 μg/ml에서 현저하게 억제되었음을 확인하였다. 따라서 전염증성 사이토카인의 생성억제 효과를 보인 벌사상자 EA 분획물을 이용하여 IL-6, IL-8, TNF-α의 mRNA 발현정도를 본 결과, IL-6, IL-8, TNF-α mRNA 발현이 농도 의존적으로 억제되었으며, 250 μg/ml에서 현저한 억제양상을 확인하였다( Fig. 3 ). 한편, COX-2는 염증과정 및 종양 발생에서 중요한 역할을 하며, COX-2의 발현은 염증반응에서 중요한 지표로 알려져 있다. 본 연구에서는, PMA와 A23187로 활성화된 HMC-1에서 벌사상자 EA 분획물을 처리하였을 때, COX-2 mRNA 발현이 농도 의존적으로 억제되었음을 확인하였다( Fig. 4 ). 그리고 염증반응은 주로 MAPKs 분자들의 활성화로 인한 NF-κB 같은 전사조절인자들의 가동으로 시작된다. MAPKs의 subfamily에는 대표적으로 ERK, JNK, p38가 있으며, 이들의 신호전달과정은 염증물질의 합성을 유도하는 점에서 염증반응과정에서 중요한 역할을 한다. 19 , 20) 실험 결과, PMA와 A23187을 처리한 HMC-1 세포에서 ERK경로를 경유하며, 벌사상자 EA 분획물을 함께 처리한 HMC-1에서는 ERK 인산화를 억제시켰음을 확인하였다( Fig. 5 ).
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Cell viability of HMC-1 cells. Cell viability was measured by MTS assay. HMC-1 cells were treated with various concentrations of Extration and Fraction for 24 hours. Date represent the mean±SD values of triplicate determinations from three separate experiment.
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Effects of Extration and Fraction on IL-6, IL8 and TNF-α Production in PMA (50 nM)+A23187 (1 μM)-stimulated HMC-1 cells. TNF-α Production was measured by ELISA assay. HMC-1 cells were treated with IMDM or various concentrations in the presence of PMA+A23187 for 8 hours. Date are mean±SD values of triplicate determinations from three separate experiment. *P<0.05
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Effect of EtOAc Fraction on Cytokines mRNA in PMA (50 nM)+A23187 (1 μM)-stimulated HMC-1 cells. Expression of mRNA were analyzed by RT-RCR. HMC-1 cells were treated with IMDM or various concentrations (50, 100 and 250 μg/ml) of EtOAc Fra. in the presence of PMA+A23187 for 6 hours. The experiment was repeated three times, and similar results were ascertained. (A) cytokines gene expression (B) Gene expression ratio.
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Effect of EtOAc Fraction on Cytokines mRNA in PMA (50 nM)+A23187 (1 μM)-stimulated HMC-1 cells. Expression of mRNA were analyzed by RT-RCR. HMC-1 cells were treated with IMDM or various concentrations (50, 100 and 250 μg/ml) of EtOAc Fra. in the presence of PMA+A23187 for 6 hours. The experiment was repeated three times, and similar results were ascertained. (A) COX-2 gene expression (B) Gene expression ratio.
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Effect of EtOAc Fraction on the Phosphorylation of MAPKs in PMA (50 nM)+A23187 (1 μM)-stimulated HMC-1 cells. Phosphorylation of MAPKs were analyzed by western blot analysis. HMC-1 cells were treated with IMDM or various concentrations (50, 100 and 250 μg/ml) of EtOAc Fra. in the presence of PMA+A23187 for 1 hour. The experiment was repeated three times, and similar results were ascertained. (A) protein expression (B) protein expression ratio.
또한, NF-κB는 염증성 cytokines 이나 면역세포 이동에 중요한 접합 분자들, chemokines 등의 유전자를 발현시키기 때문에 초기 염증반응 조절에 중요한 전사인자이다. NF-κB 전사인자들 중에, IκBα는 phosphorylation이 되면 ubiquitin-proteasome 체계에 의해 분해되어 IκB 농도가 감소하게 된다. 그 결과, IκBα의 phosphorylation으로 NF-κB가 활성화가 되어, 염증매개 인자들의 합성과 생성에 영향을 미치게 된다고 보고되어 있다. 21 , 22) 실험 결과, 벌사상자 EA 분획물은 PMA와 A23187로 활성화된 HMC-1의 세포질 내의 IκBα의 phosphorylation과 IκBα의 degradation이 억제하였다. 따라서 벌사상자 EA 분획물이 핵 내의 NF-κB의 신호전달 경로를 차단함을 확인하였다( Fig. 6 ).
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Effect of EtOAc Fra. on the activation of NF-κB in PMA (50 nM)+A23187 (1 μM)-stimulated HMC-1 cells. Activation of NF-κB were analyzed by western blot analysis. HMC-1 cells were treated with IMDM or various concentrations (50, 100 and 250 μg/ml) of EtOAc Fra. in the presence of PMA+A23187 for 1 hour (cytoplasm) or 2 hours (nuclear). The experiment was repeated three times, and similar results were ascertained. (A) protein expression (B) protein expression ratio.
본 연구결과를 종합하면, 벌사상자 EA 분획물은 PMA와 A23187로 활성화된 인간비만세포에서 신호전달경로인 MAPKs에서의 ERK의 phosphorylation과 NF-κB 경로를 저해함으로써, IL-6, IL-8, TNF-α, COX-2 발현에 영향을 미치는 것으로 관찰되었다.
결 론
인간 비만세포주인 HMC-1 세포를 PMA와 A23187로 자극 하였을 때 벌사상자 EA 분획물의 항염증 효과를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
  • 1. HMC-1 세포를 PMA와 A23187로 자극하여 벌사상자 추출물과 분획물을 처리하였을 때, EA 분획물에서 IL-6, IL-8, TNF-α은 250 μg/ml에서 현저하게 억제되었다.
  • 2. PMA와 A23187로 활성화된 HMC-1에서 벌사상자 EA 분획물을 처리하였을 때, COX-2 mRNA 발현이 농도의존적으로 억제되었다.
  • 3. PMA와 A23187을 처리한 HMC-1 세포에서 벌사상자 EA 분획물을 처리하였을 때 ERK 인산화를 억제시켰음을 확인하였다.
  • 4. 벌사상자 EA 분획물은 PMA와 A23187로 활성화된 HMC-1의 세포질 내의 IκBα의 phosphorylation과 IκBα의 degradation이 억제 하였으며, 핵 내의 NF-κB의 신호전달경로를 차단하였다.
이와 같은 결과로 보아 벌사상자 EA 분획물은 인간비만세포에 작용하여 신호전달경로인 ERK의 phosphorylation과 NF-κB 경로를 저해함으로써, IL-6, IL-8, TNF-α, COX-2 발현에 영향을 미치는 것으로 관찰되었으며, 이는 비만세포를 매개로한 염증 질환 치료제로서의 가능성이 있음을 알 수 있다.
Acknowledgements
This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (NRF-2013R1A1A2064673), by the Korea government (MSIP) (2008-0062484).
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