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Effects of Allium hookeri on Lipid Metabolism in Type II Diabetic Mice
Effects of Allium hookeri on Lipid Metabolism in Type II Diabetic Mice
Korean Journal of Pharmacognosy. 2015. Jun, 46(2): 148-153
Copyright © 2015, The Korean Society of Pharmacognosy
  • Received : June 14, 2015
  • Accepted : June 24, 2015
  • Published : June 30, 2015
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선혜 이
남석 김
봉겸 최
환희 장
정봉 김
영민 이
대근 김
창현 이
유석 김
재헌 양
영수 김
현주 김
성현 이
lshin@korea.kr

Abstract
Allium hookeri is a plant species native to India, Sri Lanka, Myanmar, and China. The plant is widely cultivated in Korea lately as a medicinal food item. This study was conducted to evaluate the effects of Allium hookeri ( A. hookeri ) on lipid metabolism in Type II diabetic mice (n=8/group, 5 groups). High fat diets with dextrin as a positive control (Dex), leaf (AL), root (AR), and fermented root (FAR) at 3% of diet were fed to all experimental mouse, respectively for 8 weeks. Body weight gain, liver and epididymal fat weights, and excreted fecal lipid levels were measured. Serum and hepatic lipid profiles were analyzed, and fat accumulation in liver was evaluated. In this study, body weight gain and epididymal fat weight were lower in the FAR group, while serum HDL-cholesterol level and excreted fecal total lipid and triglyceride levels were higher in AL or FAR groups. These results suggest that A. hookeri , specially fermented root can be a useful food item to control lipid metabolism in diabetic mice.
Keywords
재료 및 방법
실험 재료 − 본 실험에 사용한 삼채( Allium hookeri )는 전라북도 순창군 농업기술센터의 형태학적 평가를 통해 동정 된 것을 구입하였고, 증거표본(RDAAH15)은 농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부에 보관하였다. 삼채는 세척 후 잎과 뿌리로 나눠 동결건조(PVTFD 10R, Ilsin Lab, Yangju, Korea)하였고, 발효삼채(특허출원번호 10-2014-0154145)는 전북대학교 헬스케어기술사업단에서 제공받아 사용하였다. 삼채 잎, 뿌리 및 발효삼채는 각각 균일하게 40 mesh 분쇄기(FM909T, Hanil, Wonju, Korea)를 이용하여 분쇄한 후, -75℃에서 보관하며 본 실험에 사용하였다.
실험 동물 및 식이 − 본 실험에 사용된 제 2형 당뇨모델인 C57BLKS/J mouse(5주령, 수컷)는 ㈜중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 구입하여 1주일간 일반사료로 사육하였고, 체중에 따른 난괴법(randomized block design)으로 8마리씩 5군으로 분류하여 8주간 사육하였다. 비만을 유발하기 위한 실험식이로는 Research diets사의 고지방 식이(45% of energy as fat, D12451)를 이용하였고, 음성대조군(Cont)을 제외한 삼채 잎군(AL), 삼채 뿌리군(AR) 및 발효삼채 뿌리군(FAR) 은 고지방 식이에 삼채의 잎, 뿌리 및 발효 뿌리를 각각 실험식이의 3% 수준에서 첨가하여 공급하였다. 양성대조군은 항 당뇨 관련 건강기능식품의 기능성 원료인 난소화성 말토덱스트린((주)허브큐어, Korea)을 실험 식이의 3% 수준에서 배합하여 공급하였다. 동물 사육실 온도는 20±2℃, 습도는 50±5%, lighting cycle은 12시간 주기로 일정하게 유지시켰으며, 물과 식이는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험 식이는 사육기간 동안 냉장 보관하였고, 식이섭취량은 매일 일정한 시간에 측정하였으며, 급여량에서 잔량을 빼서 계산하였다. 본 실험은 농촌진흥청 국립농업과학원 동물실험윤리위원회의 승인(NAAS201413)절차에 따라 수행하였다.
실험동물의 시료 채취 − 마우스는 실험종료 12시간 전에 절식 시킨 후, 체중을 측정하고 CO 2 마취 후에 심장 채혈법으로 채혈하였다. 채취된 혈액은 원심분리용 시험관에 담아 분리(3,000 rpm, 4℃, 20분)하였고, 획득된 혈청은 생화학적 분석을 위한 시료로 이용하였다. 실험동물의 장기조직은 채혈 후 즉시 적출하여 생리식염수로 세척 후에 표면의 수분을 제거하여 무게를 측정하였고, 액체질소로 급속 냉동시켜 -75℃에 보관하였다.
혈청 지질 분석 − 혈청 지질 함량은 중성지방 정량용 kit(Triglyceride assay kit, abcam, USA), 총 콜레스테롤 정량용 kit(AM 202-k, Asan Co., Seoul, Korea) 및 HDL/LDL-콜레스테롤 정량용 kit(ab65390, abcam, USA)를 사용하여 분석하였으며, microplate reader(Molecular device, Silicon Valley, CA, USA)를 이용하여 각각 550, 500 및 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
간 및 변의 지질성분 분석 − 지질 분석을 위하여 간 0.5 g 에 1.5mL의 0.9% 생리식염수를 가하고 plastic homogenizer probes(Hard Tissue Omni Tip TM , OMNI International, Marietta, GA)를 이용하여 마쇄하였으며, 변은 오븐에서 건조하여 분쇄한 후 0.5 g을 취하여 사용하였다. 총지질 성분은 간 및 변 시료에 chloroform과 methanol 혼합액(2:1, v/v) 을 가하고 혼합한 후 추출하였고, sodium sulfate를 이용한 여과, 50℃의 항온수조에서 건조를 통해 얻어졌다. 총지질은 0.5%의 triton X-100가 함유된 ethanol 혼합액으로 녹이고, 중성지방과 총 콜레스테롤 측정을 위한 시료로 사용하였다. 간 및 변 중의 중성지방과 총 콜레스테롤의 측정방법은 앞의 혈청 지질 분석과 같은 방법으로 수행하였다.
간의 조직학적 변화 관찰 − 간 조직의 형태학적 관찰을 위해, 간 중엽 일부를 10%(w/v)의 중성 formalin 용액에 24시간 동안 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거친 다음에 파라핀으로 포매하였다. 그 후 rotary microtome(Jung Histocut 820, Leica, German)으로 7 μm 두께로 절편을 만들어 일반적인 조직학적 구조를 관찰하기 위한 hematoxylin & eosin(H&E) 염색을 시행하고, 광학현미경(Axioskop 50, Carl Zeiss, Jena, Germany)으로 조직의 변화를 관찰하였다.
간 조직 내의 지방세포 변화를 관찰하기 위하여, 간 중엽 일부를 Bouin’s solution과 20%(w/v) sucrose용액에 24시간 고정하였고, 고정된 조직은 냉동절편기(CM 3050 cryostat, Leica Inc., Bannockburn, IL, USA)를 이용하여 20 μm의 두께로 절단하였다. 준비된 절편은 자유부유법(free-floating method)을 이용하여 Oil-red O로 염색하였으며, 간조직내 지질의 조직학적 변화를 광학현미경을 이용해 관찰하였다.
통계처리 − 모든 실험 결과는 SPSS package program (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용한 일원 배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 후, 평균과 표준오차로 제시하였고, 실험 군 사이의 통계적 유의성( p <0.05)은 Duncan’s multiple range test 로 검증하였다.
결과 및 고찰
체중 증가량 및 장기의 무게 − 고지방 식이에 삼채 잎, 뿌리 및 발효뿌리 분말을 첨가하여 당뇨마우스에게 8주간 급여하였을 때의 체중증가량 및 장기의 무게는 Table I 과 같다. 실험 초기의 체중은 28.2~29.0 g으로 모든 실험군 사이에 차이가 없었으나(제시하지 않음), 실험식이 급여 후의 체중 증가량은 발효삼채 뿌리 섭취군에서 대조군에 비하여 낮게 나타났다. 이것은 김 등의 연구에서 삼채의 잎 및 뿌리가 체중에는 영향을 주지 않았던 것 9) 과는 비교되는 결과로, 삼채 뿌리를 발효처리 할 경우 체중 감소 효과가 있는 것으로 생각된다. 간 무게는 모든 실험군 사이에 차이를 보이지 않았으나, 발효 삼채 뿌리 섭취군에서 부고환주변 지방의 무게가 유의적으로 감소하였고, 이것이 체중 증가량의 감소와 관련된 것으로 보인다.
Comparison of body weight gain and organ weights of diabetic mice fed experimental diets for 8 weeks
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All values are mean±S.E. 1)AL: Allium hookeri, leaf 2)AR: Allium hookeri, root 3)FAR: Allium hookeri, fermented root a,b; Values with different superscripts in the same column are significantly different (p<0.05) among groups by Duncan's multiple range test.
실험동물에서 체중증가량이 낮은 것은 실험식이의 효율이 낮아 체중 증가 억제 효과가 있는 것으로, 윤 등의 연구에서도 섬더덕 추출물의 급여가 최종 체중을 감소시켰다. 15) 강 등의 연구에서는 열량의 40% 고지방식이에 글루칸 첨가식이(5%, w/w)를 실험동물에게 6주 동안 공급하였을 때, 유의하지는 않았지만 부고환 조직의 무게가 대조군보다 낮았음을 보고하였다. 16) 그러나 조 등의 연구에 따르면, 콜레스테롤이 첨가된 고지방 식이를 4주 동안 실험동물에게 급여하였을 때, 과량의 지방과 콜레스테롤이 간 조직 내에 축적되어 간조직의 중량이 증가되었다. 17) 따라서 고지방 조성외에도 콜레스테롤의 첨가가 실험동물의 체중 증가나 간 등의 장기무게를 증가시키는데 효과가 있어, 비만 및 지방간을 갖는 동물모델 개발에 유용할 것으로 생각된다.
혈청 지질 수준 − 혈청 중성지방, 총콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤의 농도를 Table II 에 나타내었다. 표에서 보여주는 것과 같이, 모든 삼채 섭취군에서 대조군에 비하여 혈청 총콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤 농도가 낮은 경향을 보였고( p >0.05), HDL-콜레스테롤의 농도는 유의적으로 높게 나타났다. 특히 발효 삼채 뿌리는 혈청 총 콜레스테롤 농도를 대조군에 비하여 13% 낮추면서, HDL-콜레스테롤의 농도를 높이는 효과가 있었다. 본 연구에서 삼채 잎 및 뿌리의 혈중 지질 수준 저하 효과는 약하였으나, 삼채의 실험식이 중의 급여 수준 및 급여 기간에 따라 유의한 영향을 미칠 수 있은 가능성이 제시되었다.
Comparison of triglyceride, total cholesterol, LDL-, and HDL-cholesterol levels in serum of diabetic mice fed experimental diets for 8 weeks
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All values are mean±S.E. 1)AL: Allium hookeri, leaf 2)AR: Allium hookeri, root 3)FAR: Allium hookeri, fermented root a,b; Values with different superscripts in the same column are significantly different (p<0.05) among groups by Duncan's multiple range test. NS; Not significant
간의 지질 수준 − 삼채 잎, 뿌리 분말과 발효뿌리 분말을 첨가한 고지방식이를 섭취한 마우스의 간지질 농도를 측정 한 결과는 Table III 과 같다. 간의 총지질, 중성지방 및 총콜레스테롤 함량은 삼채 뿌리를 섭취한 실험군에서 낮아지는 경향을 보였으나( p >0.05), 모든 실험군 사이에 유의한 차이를 보이지는 않았다. 삼채와 같은 Allium 속의 식물인 마늘을 실험식이에 첨가(3%, w/w)하여 실험동물에 급여하였을 때에도 간의 중성지방과 총 콜레스테롤의 함량에는 차이가 없었다고 보고되었다. 18) 따라서 삼채의 공급은 본 실험에 이용된 당뇨 마우스의 간 지질수준에 유의적인 영향을 주지는 않았으나, 고콜레스테롤 실험식이 17) 나 8주 이상의 장기간 실험식이 급여에서는 다른 결과가 나올 수도 있었을 것으로 생각된다.
Comparison of total lipid, triglyceride, and total cholesterol levels in liver of diabetic mice fed experimental diets for 8 weeks
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All values are mean±S.E. 1)AL: Allium hookeri, leaf 2)AR: Allium hookeri, root 3)FAR: Allium hookeri, fermented root NS; Not significant
간 조직의 형태학적 변화 − 삼채 잎, 뿌리 및 발효뿌리 분말이 첨가된 고지방 식이를 섭취한 마우스 간 조직의 형태학적인 변화를 Fig. 1 에 나타내었다. 간 조직의 병리학적 검사결과, Cont군에서 균일하게 세포크기가 증가된 간세포를 확인 할 수 있었으며, Dex군은 Cont군보다 간세포의 크기가 감소되었다. 특히, FAR군의 경우 Cont군과 Dex군에 비해 간세포의 크기가 감소되고 세포질과 핵이 많이 관찰되는 것으로 보아 염증 및 간세포의 괴사가 적은 것으로 나타났다. 그리고 AL군 및 AR군에서는 간세포의 크기 증가 보다는 부분적으로 공포화가 관찰되었다.
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Comparison of histological change and fat accumulation in liver of diabetic mice fed experimental diets for 8 weeks. A, Hematoxylin & eosin staining (×200); B, Oil-red O staining (×200); Cont, Control; Dex, Dextrose; AL, A. hookeri, leaf; AR, A. hookeri, root; FAR, A. hookeri, fermented root
간 조직 절편의 Oil-red O 염색에 의한 검사결과, Cont군에서는 큰 지방입자들이 중심정맥을 따라 균일하게 분포되어 있었고, Dex군은 Cont군에 비해 지방입자의 수가 감소 되었으나, 지방입자의 크기에는 Cont군과 차이가 없었다. 또한 AL군, AR군과 FAR군에서의 지방입자의 크기와 수는 Dex군과 Cont군보다 감소한 것으로 나타났다. H-E염색 처리된 AL군과 AR군에서 공포가 발견되었으나, Oil-red O 염색을 이용한 지방 염색에서 큰 지방입자가 발견되지 않았으므로 지질을 제외한 다른 원인에 의해 공포가 진행된 것으로 생각된다.
변 중 지질 배설 − 삼채 잎과 뿌리 및 발효뿌리 분말이 첨가된 고지방식이를 섭취한 마우스의 변 중 지질 배설량에 대한 결과는 Table IV 과 같다. 변으로 배설된 총지질 및 중성지방 함량은 AL군과 FAR군에서 유의적으로 증가하였으나 총 콜레스테롤 함량에는 실험군 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다. 국산 삼채 뿌리는 건조중량 100 g당 711 mg의 황 및 4556 mg의 조사포닌을 함유하고 있어 도라지(57mg/100 g), 흑도라지(107.9 mg/100 g) 및 팽화도라지(1880-2170 mg/100 g)의 조사포닌 함량보다 높고, 백삼 및 홍삼의 조사포닌 함량(3362-4423 mg/100 g)과 유사하여 높은 생리활성을 기대할 수 있을 것으로 보고되었다. 19) 김 등의 연구에서도 대두박 사포닌의 급여수준이 높아질수록 변중의 중성지질 함량이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다. 20) 따라서 고지방식이와 함께 급여된 AL 및 FAR이 분변으로의 총 지질 및 중성지방 배설량을 증가시키며, 식이지방의 흡수를 효과적으로 저해한 것으로 보인다.
Comparison of total lipid, triglyceride, and total cholesterol levels in the feces of diabetic mice fed experimental diets for 8 weeks
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All values are mean±S.E. 1)AL: Allium hookeri, leaf 2)AR: Allium hookeri, root 3)FAR: Allium hookeri, fermented root a,b; Values with different superscripts in the same column are significantly different (p<0.05) among groups by Duncan's multiple range test. NS; Not significant
따라서 발효 삼채 뿌리는 변으로의 지질 배설을 증가시킴으로써, 혈중 지질, 지방조직의 무게 및 체중 증가량을 효과적으로 조절하는 기능이 있는 것으로 보인다. 또한 발효삼채는 발효 과정에서 일반 삼채보다 구수한 맛이 증가하고, 자극적인 향이 적은 것으로 알려져 있어(특허출원번호 10-2014-0154145), 비만 예방 및 체내 지질 감소를 목적으로 하는 다양한 제품 개발이 기대된다.
결 론
본 연구에서 국산 삼채는 제 2형 당뇨마우스에서 체중증가량을 감소시키고, 체지방 및 혈중 지질 수준을 조절하는 효과가 있었으며, 이것은 변중 지질 배설량을 증가시키는 기전에 의한 것으로 나타났다. 따라서 삼채는 그동안 보고 된 혈당 저하, 항염 및 항산화 등의 효과 외에, 체내 지질함량 및 지질 프로파일을 조절하는 효과가 있고, 특히 발효삼채가 우수하여, 앞으로 비만 및 당뇨 환자들을 위한 건강기능식품의 소재로 이용될 수 있을 것이다. 그러나 우리 환경에 맞는 삼채의 품종 개발 및 등록이 필요하고, 다양한 동물 모델에서 분자 수준의 기전 설명을 위한 연구가 수행되어야 할 것으로 생각되며, 국산 삼채의 부가가치 향상 및 우리 농산물의 국가 경쟁력 향상을 위한 농업인, 연구소 및 업체 등의 협력이 요구된다.
Acknowledgements
본 연구는 농촌진흥청의 공동연구사업 ‘삼채의 생리활성 및 작용기전 구명(Project No. PJ01049004)’의 연구비 지원으로 이루어졌다.
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