Two coumarinolignans, cleomiscosins C (
1
) and D (
2
) were isolated from the heartwood of
Acer mono
, together with four compounds, 5-
O
-methyl-(
E
)-resveratrol-3-
O
-β-D-glucopyranoside (
3
), 5-
O
-methyl-(
E
)-resveratrol-3-
O
-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (
4
), scopoletin (
5
), and (
E
)-resveratrol-3-
O
-β-D-glucopyranoside (
6
). Of them, cleomiscosins C (
1
) and D (
2
) were applied to preparing inclusion complex molecules with β-cyclodextrin (β-CD) to improve the very poor solubility in cell media. The CD complexes of
1
and
2
exhibited an enhancement of water solubility which is feasible to measure their cytotoxicity using a spectrophotometer in a cell-based assay. Anti-proliferative activity of these complex molecules was successfully estimated on HCT116 human colon cancer cells, and cleomiscosin D (
2
) showed anti-proliferative effects at the concentration of 1.95~31.2 μg/mL in a dose-dependent manner.
재료 및 방법
실험재료
− 본 실험에 이용된 고로쇠나무(
Acer mono
Maximowicz)는 2009년 4월에 전남 광양에서 채취되었으며, 목포대학교 약학대학 김현정교수가 감정한 후 줄기껍질과 심재를 분리하여 음건하였다. 표본(No. P2009AMH)은 목포대학교 약학대학 표본실에 보관되어 있다.
기기 및 시약
− 1D 및 2D를 포함한 NMR 스펙트럼은 Varian사의 INOVA 500MHz NMR(
1
H: 499.998 MHz)과 VNMRS 600 MHz NMR spectrometer(
1
H: 600.006 MHz) 를 이용하여 측정하였다. MS는 Varian 320-MS TQ mass spectrometer를 이용하여 negative electrospray ion(ESI) mode에서 측정하였으며, CD(circular dichroism) 스펙트럼은 JASCO J-810 spectrometer를 이용하였다. HPLC는 DAD (diode array detector)가 장착된 Agilent사의 HP1100 series 를 이용하였으며, column으로 Waters사의 SunFire
TM
C18 (4.6×150 mm, 5 μm) 및 SunFire
TM
Prep C18 OBD(5 μm, 19×150 mm)를 이용하였다. Column chromatography는 Merck사의 silica gel 60(70-230 mesh)을 적용하였다.
추출 및 분리
− 고로쇠나무 심재 4.30 kg을 잘게 분쇄하고 25 L의 MeOH로 상온에서 3회 추출한 후 감압농축하여 134.0 g의 추출물을 획득하였다. 이 추출물을 증류수에 현탁한 후
n
-hexane, EtOAc,
n
-BuOH를 이용, 순차적으로 분획하여 각각
n
-hexane(8.02 g), EtOAc(17.06 g),
n
-BuOH (27.58 g) 분획물을 얻었다. 심재 EtOAc 분획물 일부를 silica gel 60 chromatography에 적용하고 CHCl
3
-MeOH(0.5% formic acid 함유) 조건으로 극성을 증대(24:1→20:1→15:1→10:1→6:1→3:1→1:1, 100% MeOH)시키면서 용출하여 총 12종의 분획(F01-12)을 획득하였다. 화합물 분리정제를 위해 최종적으로 각 분획에 대하여 semi-preparative HPLC를 적용하였고, 그 결과, MeCN-0.1% formic acid 함유 H
2
O을 이용, 13:87→50: 50 조건에서 50분 동안 용출하여 분획 F03에서 화합물
1
과
5
를, 분획 F04에서 화합물
2
를, F09에서 화합물
3
을 획득하였으며, 분획 F10 (MeCN-0.1% formic acid 함유 H
2
O 조건, 13:87→40:60, 50분)에서 화합물
6
을, F11 분획(MeCN-0.1% formic acid 함유 H
2
O 조건, 20:80 →25:75, 40분)에서 화합물
4
를 획득하였다.
Cleomiscosin C
(
1
): UV λ
max
(in HPLC solvent) 232 (sh), 327 nm;
1
H-NMR (500 MHz, DMSO-
d
6
) δ: 7.97 (1H, d,
J
=9.5 Hz, H-4), 6.92 (1H, s, H-5), 6.75 (2H, s, H-2'/6'), 6.35 (1H, d,
J
=9.5 Hz, H-3), 4.96 (1H, d,
J
= 8.0 Hz, H-7'), 4.37 (1H, ddd,
J
=8.0, 4.3, 2.0 Hz, H-8'), 3.79 (3H, s, 6-OCH
3
), 3.77 (6H, s, 3'/5'-OCH
3
), 3.66 (1H, dd,
J
=12.5, 2.0 Hz, H-9'a), 3.39 (1H, dd,
J
=12.5, 4.3 Hz, H-9'b);
13
C-NMR (125 MHz, DMSO-
d
6
) δ: 160.08 (C-2), 147.98 (C-3'/5'), 145.30 (C-6), 144.88 (C-4), 138.04 (C-9), 137.06 (C-7), 136.20 (C-4'), 131.72 (C-8), 125.72 (C-1'), 113.28 (C-3), 111.30 (C-10), 105.62 (C-2'/6'), 100.76 (C-5), 77.76 (C-8'), 76.62 (C-7'), 59.87 (C-9'), 56.13 (3'/5'-OCH
3
), 55.84 (6-OCH
3
).
Cleomiscosin D
(
2
): UV λ
max
(in HPLC solvent) 232 (sh), 327 nm;
1
H-NMR (600 MHz, DMSO-
d
6
) δ: 7.95 (1H, d,
J
=9.6 Hz, H-4), 6.94 (1H, s, H-5), 6.77 (2H, s, H-2'/6'), 6.32 (1H, d,
J
=9.6 Hz, H-3), 4.96 (1H, d,
J
=7.8 Hz, H-7'), 4.36 (1H, ddd,
J
=7.8, 4.2, 2.0 Hz, H-8'), 3.84 (3H, s, 6-OCH
3
), 3.77 (6H, s, 3'/5'-OCH
3
), 3.62 (1H, dd,
J
=12.3, 2.0 Hz, H-9'a), 3.36 (1H, dd,
J
=12.3, 4.2 Hz, H-9'b);
13
C-NMR (150 MHz, DMSO-
d
6
) δ: 160.05 (C-2), 148.00 (C-3'/5'), 145.28 (C-6), 144.87 (C-4), 138.06 (C-9), 136.93 (C-7), 136.23 (C-4'), 131.97 (C-8), 125.70 (C-1'), 113.19 (C-3), 111.11 (C-10), 105.59 (C-2'/6'), 100.97 (C-5), 78.22 (C-8'), 76.27 (C-7'), 59.91 (C-9'), 56.12 (3'/5'-OCH
3
), 55.86 (6-OCH
3
).
5-
O
-methyl-(
E
)-resveratrol-3-
O
-β-D-glucopyranoside (
3
): UV λ
max
(in HPLC solvent) 306, 320 nm;
1
H-NMR (500 MHz, CD
3
OD) δ: 7.39 (2H, d,
J
=8.5 Hz, H-2'/6'), 7.07 (1H, d,
J
=16.0 Hz, H-β), 6.91 (1H, brs, H-2), 6.90 (1H, d,
J
=16.0 Hz, H-α), 6.77 (2H, d,
J
=8.5 Hz, H-3'/5'), 6.74 (1H, brs, H-6), 6.58 (1H, t,
J
=2.0 Hz, H-4), 4.94 (1H, d,
J
=7.3 Hz, H-1''), 3.94 (1H, dd,
J
=12.3, 2.0 Hz , H-6''), 3.80 (3H, s, 5-OCH
3
), 3.70 (1H, dd,
J
=12.3, 6.5 Hz, H-6''), 3.45~3.48 (3H, m, H-3'', 4'', 5''), 3.38 (1H, m, H-2''); ESI-MS
m/z
403 [M-H]
-
.
5-
O
-methyl-(
E
)-resveratrol-3-
O
-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside(
4
): UV λ
max
(in HPLC solvent) 215, 307, 320 nm;
1
H-NMR (500 MHz, CD
3
OD) δ: 7.39 (2H, d,
J
=9.0 Hz, H-2'/6'), 7.06 (1H, d,
J
=16.3 Hz, H-β), 6.90 (1H, d,
J
=16.3 Hz, H-α), 6.84 (1H, brs, H-2), 6.78 (2H, d,
J
=9.0 Hz, H-3'/5'), 6.76 (1H, brs, H-6), 6.59 (1H, t,
J
=2.0 Hz, H-4), 4.98 (1H, d,
J
=2.5 Hz, H-1'''), 4.90 (1H, d,
J
=7.5 Hz, H-1''), 4.05 (1H, m, H-6''), 3.97 (1H, d,
J
=10.0 Hz, H-4'''), 3.89 (1H, d,
J
=2.5 Hz, H-2'''), 3.81 (3H, s, 5-OCH
3
), 3.75 (1H, d,
J
=10.0 Hz, H-4'''), 3.61 (1H, m, H-5''), 3.61 (1H, m, H-6''), 3.54 (2H, s, H-5'''), 3.46 (1H, m, H-3''), 3.46 (1H, m, H-2''), 3.37 (1H, brt,
J
=8.5 Hz, H-4'');
13
C-NMR (125 MHz, CD
3
OD) δ: 162.4 (C-5), 160.5 (C-3), 158.7 (C-4'), 141.5 (C-1), 130.4 (C-β), 130.3 (C-1'), 129.2 (C-2'/6'), 126.7 (C-α), 116.7 (C-3'/5'), 111.1 (C-1'''), 108.6 (C-2), 106.8 (C-6), 103.2 (C-4), 102.6 (C-1''), 80.7 (C-3'''), 78.3 (C-2'''), 78.1 (C-3''), 77.0 (C-5''), 75.2 (C-4'''), 75.1 (C-2''), 71.7 (C-4''), 68.9 (C-6''), 65.9 (C-5'''), 56.0 (5-OCH
3
); ESI-MS
m/z
535 [M-H]
-
.
Scopoletin
(
5
): UV λ
max
(in HPLC solvent) 230, 296, 341 nm;
1
H-NMR (500 MHz, CD
3
OD) δ: 7.85 (1H, d,
J
=9.0 Hz, H-4), 7.09 (1H, s, H-5), 6.76 (1H, s, H-8), 6.20 (1H, d,
J
=9.0 Hz, H-3), 3.90 (3H, s, 6-OCH
3
);
13
C-NMR (125 MHz, CD
3
OD) δ: 164.3 (C-2), 153.1 (C-8a), 151.5 (C-7), 147.2 (C-6), 146.3 (C-4), 112.7 (C-3), 112.7 (C-4a), 110.0 (C-5), 104.1 (C-8), 56.9 (6-OCH
3
).
(E)-Resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside
(
6
,
trans
-piceid): UV λ
max
(in HPLC solvent) 210, 310, 321 nm;
1
H-NMR (500 MHz, CD
3
OD) δ: 7.37 (2H, d,
J
=8.5 Hz, H-2'/6'), 7.02 (1H, d,
J
=16.3 Hz, H-β), 6.85 (1H, d,
J
=16.3 Hz, H-α), 6.79 (1H, brs, H-2), 6.77 (2H, d,
J
=8.5 Hz, H-3'/5'), 6.62 (1H, brs, H-6), 6.45 (1H, t,
J
=2.0 Hz, H-4) 4.90 (1H, d,
J
=7.5 Hz, H-1''), 3.94 (1H, dd,
J
=12.0, 2.0 Hz, H-6''), 3.72 (1H, dd,
J
=12.0, 6.0 Hz, H-6''), 3.50 (1H, m, H-5'''), 3.47 (1H, m, H-3''), 3.45 (1H, m, H-2''), 3.38 (1H, d,
J
=9.0 Hz, H-4'');
13
C-NMR (125 MHz, CD
3
OD) δ: 160.6 (C-3), 159.7 (C-5), 158.6 (C-4'), 141.6 (C-1), 130.4 (C-β), 130.1 (C-1), 129.1 (C-2'/6'), 126.8 (C-α), 116.6 (C-3'/5'), 108.4 (C-6), 107.1 (C-2), 104.2 (C-4), 102.5 (C-1''), 78.4 (C-5''), 78.2 (C-3''), 75.1 (C-2''), 71.6 (C-4''), 62.7 (C-6''); ESI-MS
m/z
389 [M-H]
-
.
β-Cyclodextrin(β-CD)을 이용한 Cleomiscosin 포접화합물 제조
− Cleomiscosin C(
1
) 및 cleomiscosin D(
2
)가 로딩된 CD 나노입자는 고속진동마쇄기(高速振動磨碎機, highspeed vibration milling system)에서 고체상반응(solid-state reaction)을 통해 만들어졌다(Retsch Co. Ltd., MM 200). 각 cleomiscosin 화합물과 CD는 두 개의 스테인리스 mixing balls과 함께 스테인리스 스틸 capsule 안에 넣어진 후, 상온 20 Hz에서 60분 동안 격렬하게 마쇄되었다. 고속진동마쇄를 통해 얻은 물질을 증류수에 1 mg/mL 농도로 녹이고, 8000 g에서 10분 동안 원심분리(Hanil Science Industrial, MICRO 17TR)하여 포접되지 않은 free cleomiscosin을 제거하였다. 이 과정을 추가 반복하여 상등액을 취합하고 동결 건조하였으며(Samwon Engineering, SFDSM12), 제조된 입자의 모양과 표면전하를 SEM 및 ELS-Z의 zeta-potential 모드에서 각각 측정하여 확인하였다. 입자의 hydrodynamic size를 검사하기 위하여 동결 건조된 시료를 물에 녹이고 ultra-sonication을 1분 동안 실시(Sonics and Materials Inc., Model VC 750)한 후, ELS-Z를 이용하여 DLS (dynamic light scattering) 모드에서 검정하였다. 생성된 포접복합체에서 cleomiscosin 화합물의 부하율(loading efficiency)은 UVVis spectroscopy(Hitachi spectrometer U-2000)를 통해 확인 되었다.
암세포증식 억제활성 평가
− 세포의 증식 및 생존율은 MTT법에 의해 평가되었다. 사람 유래 HCT116 대장암세포 (HCT116 colon cancer cells)와 암-연관 섬유아세포(cancerassociated fibroblasts)를 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 DMEM 배지에 분주하고 37℃로 유지되는 5% CO
2
배양기 내에서 유지하였다. 그 후 각 세포를 96 well plate에 동일하게 분주하고(6×10
3
cells/well), 24시간 동안 배양하였다. 이어 기존의 culture media를 제거하고 serum-free media로 교체한 후, cleomiscosin과 β-CD 포접복합체를 일정 농도로 가하여 48시간 동안 배양하였다. 세포의 활성도(cell viability %)를 측정하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) 용액(1 mg/mL)을 가하고 3시간 동안 더 배양하였다. 상등액을 제거한 후, 생성된 formazan을 DMSO 200 μL로 녹여내고 microplate reader(BioRad, Versamax) 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3회 반복 실시하여 평균값 (means±SD)을 구하였으며, DMSO 대조군의 흡광도값을 기준으로 세포생존율을 비교하였다.
결과 및 고찰
고로쇠나무 심재에 존재하는 화합물의 분리를 위해 해당 원재료에 대한 MeOH 추출물을 제조하였고, 이를 대상으로 용매극성에 따른 분획을 시행하여
n
-hexane, EtOAc,
n
-BuOH 및 H
2
O 등 4종의 분획물을 획득하였다. 이어 EtOAc 분획물에 silica gel chromatography, HPLC 등을 적용하여 총 6종의 화합물을 분리하였다(
Fig. 1
). 효율적인 성분분석을 위해 각 화합물의 HPLC profile과 UV spectra가 DAD (diode array detector)를 바탕으로 190-400 nm에서 스캔하여 수집되었다. 화합물
1
,
2
및
5
의 UV 스펙트럼을 확인한 결과, 이 화합물들은 330 nm 근처에서 강한 흡수피크를 보여주었으며, 이는 해당 화합물들이 coumarin 유도체임을 시사하였다. 특히 화합물
1
과
2
는 동일한 UV 흡수 스펙트럼을 나타내었으며, 이는 두 화합물이 구조적으로 이성체임을 드러내었다. 화합물
3
,
4
및
6
또한 서로 유사한 UV 흡수형태를 보여주었으며, 307 및 320 nm에서 나타나는 전형적인 흡수피크는 이 화합물들이 stilbene 유도체임을 시사하였다(
Fig. 2
).
Chemical structures of compounds 1-6.
HPLC profile and UV spectra for compounds 1-6. Analytic HPLC was performed by a gradient solvent system of MeCNH2O (0.1% HCOOH) (13:87→50:50) with a Waters SunFireTM (4.6×150 mm, 5 μM) for 50 min followed by an isocratic elution with 100% MeCN for 10 min. (A) HPLC chromatograms of 1-6 in the EtOAc fraction from heartwood of A. mono; 1 (tR 26.24 min), 2 (tR 25.08 min), 3 (tR 22.93 min), 4 (tR 20.70 min), 5 (tR 13.90 min), 6 (tR 13.04 min). (B) UV spectra of 1-6 obtained by diode array detector.
화합물
1
과
2
는 모두 백색의 파우더 형태로 분리되었다. 화합물
1
의
1
H-NMR 스펙트럼은 δ
H
6.35 및 7.97(각 1H, d,
J
=9.5 Hz)과 δ
H
6.92(1H, s)에서 coumarin 모핵에 해당하는 proton signals과 더불어 δ
H
6.75(2H, s)에서 두 개의 aromatic protons을, δ
H
4.96(1H, d,
J
=8.0 Hz)과 δ
H
4.37(1H, ddd,
J
=8.0, 4.3, 2.0 Hz)에서 두 개의 oxymethine 기를 확인하였고, δ
H
3.66(1H, dd,
J
=12.5, 2.0 Hz)과 δ
H
3.39(1H, dd,
J
=12.5, 4.3 Hz)에서 hydroxymethylene기를, δ
H
3.79(3H, s) 및 δ
H
3.77(6H, s)에서 세 개의 methoxyl기를 보여주었다. 이 화합물의
13
C-NMR 스펙트럼 또한 coumarin의 구성요소인 α,β-unsaturated lactone을 δ
C
160.08 (C=O), 113.28(CH), 144.88(CH)에서, 그리고 aromatic ring 을 δ
C
100.76(CH), 145.30(C), 137.06(C), 131.72(C), 138.04(C), δ 111.30(C)에서 나타내었으며, phenylpropanoid 의 구성요소인 1,3,4,5-tetrasubstituted aromatic ring이 δ
C
125.72(C), 105.62(2×CH), 147.98(2×C), δ 136.20(C)에서, oxygenated aliphatic carbons에 해당하는 δ
C
76.62(CH), 77.76(CH) 및 δ
C
59.87(CH
2
)과 함께 관찰되었다. 추가적인 2D NMR 분석과 함께, 이상의 데이터를 기존문헌에 보고 된 바와 비교하여
10
,
11)
이 화합물의 구조는 cleomiscosin C(aquillochin)임을 확인할 수 있었다.
화합물
2
의 NMR 데이터는 cleomiscosin C(
1
)와 아주 유사하게 나타났으나, C-7'과 C-8'의 chemical shift값에서 차이를 나타내었다. 화합물
1
과 비교할 때, 화합물
2
는 C-7'의 경우 δ
C
76.27(-0.35 ppm)로 upfileld shift로 관찰되었으며, C-8' carbon의 경우 downfield shift로 δ
C
78.22(+0.46 ppm) 에서 관찰되었다. 이 결과는 기존 보고된 문헌과 비교되었으며,
11
,
12)
이를 토대로 화합물
2
의 구조가 cleomiscosin D임을 확인할 수 있었다. 두 coumarinolignan 물질은 circular dichroism spectroscopy에서 흡수밴드를 나타내지 않았다. 또한 HPLC 크로마토그램 상에서 보인 각 성분의 분리행태, 즉, retention time(
t
R
)의 차이(cleomiscosin C > cleomiscosin D)가 이들의 congeners인 cleomiscosin A와 B의 결과 (cleomiscosin A > cleomiscosin B)와 동일한 양식으로 나타남이 확인되었다.
13
,
14)
화합물
3
,
4
와
6
은 NMR spectrum에서 모두 (
E
)-resveratrol aglycone에 해당하는 1,3,5-trisubstituted aromatic ring과 1,4-disubstituted aromatic ring, 그리고
trans
-olefinic bond (
J
=~16 Hz)의 signals을 보여주었으며, 동시에 당(糖)에 대응하는 전형적인
1
H- 및
13
C-NMR 피크를 나타내어 3종 모두 배당체 화합물임을 시사해 주었다. 이 중 화합물
3
과
4
는 한 개의 methoxyl기(δ
H
~3.80)가 존재함을 드러내었고, 그 결합위치는 (
E
)-resveratrol aglycone의 C-5임을 HMBC를 통해 확인할 수 있었다. 또한 각 aglycone에 결합된 당의 종류와 위치는 2D NMR과 문헌비교를 통해 이루어졌는데,5) 화합물
3
과
6
에 존재하는 당은 하나의 β-D-glucopyranose로 규명되었으며, 화합물
4
에는 이당류인 β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranose가 존재함을 알 수 있었다. 각 당의 결합위치는 HMBC 스펙트럼에서 당의 anomeric proton과 aglycone의 carbon 사이에 나타나는 correlation 피크를 토대로 C-3 위치로 규명하였다. 상기 분석을 바탕으로 화합물
3
,
4
와
6
의 구조는 5-
O
-methyl-(
E
)-resveratrol-3-
O
-β-Dglucopyranoside(
3
), 5-
O
-methyl-(
E
)-resveratrol-3-
O
-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside(
4
)와 (
E
)-resveratrol-3-
O
-β-D-glucopyranoside(
6
)로 판명되었다. 기존 연구된 고로쇠나무(
A. mono
) 유래의 2차 대사산물로서, 잎으로부터 화합물
3
및
4
의 존재가 보고되어 있으며 이 화합물들은 간세포보호 활성을 나타냄이 알려져 있다.
5
,
6)
화합물
5
는 coumarin 모핵에 해당하는 proton signals이 δ
H
7.85와 6.20(각 1H, d,
J
=9.0 Hz)에서 나타났고 δ
H
7.09 와 6.76에서 aromatic protons(1H, s)이, 또한 δ
H
3.90에서 하나의 methoxyl기가 나타나는 것을 확인하였다. 각 피크의 위치, coupling constants 및 HMBC correlation 결과를 문헌
15)
과 비교하여 이 화합물은 scopoletin임이 확인되었다.
고로쇠나무 심재로부터 나온 주요 coumarinolignoid 성분이자, 난용성 화합물인 cleomiscosin C(
1
)와 D(
2
)에 대한 암세포증식 억제효능이 사람유래 대장암세포 HCT116에서 MTT법으로 평가되었다. 세포배지 환경에서 화합물
1
과
2
는 극도로 낮은 용해성으로 인해 세포배지 환경에서 다시 석출되어 세포막에 침전을 형성하는 현상을 일으켰으며, 이는 MTT법의 장애요소로 나타났다. 이를 개선하기 위하여 cleomiscosin C(
1
)와 D(
2
)가 로딩된 β-cyclodextrin(β-CD) 나노입자를 제조하였으며, 이 복합체는 고속진동마쇄계(highspeed vibration milling system)에서 β-CD와 함께 고체상 반응(solid-state reaction)에 의해 생성되었다. 상기 방법을 거쳐 생성된 각 cleomiscosin-CD 포접화합물에 함유되어 있는 cleomiscosin의 함유량(percentage compound content)은 UV spectroscopy에 의해 15.6%로 확인되었다.
화합물
1
과
2
의 암세포증식 억제효능은 수용성이 cleomiscosin-CD 복합체를 이용하여 성공적으로 측정되었다(
Fig. 3
). 나노입자 cleomiscosin C-CD는 최대 200 μg/mL 농도에서도 HCT116 세포에 대한 증식 억제효능을 나타내지 않았다. 반면, cleomiscosin D-CD 포접화합물은 12.5~200 μg/mL 농도, 즉, 1.95~31.2 μg/mL의 cleomiscosin D가 농도의존적으로 암세포의 증식을 억제함을 보여주었다. 더구나 해당 동일농도에서 cleomiscosin D는 암-연관 섬유아세포(cancer-associated fibroblasts)에 세포증식 억제 효능을 나타내지 않는 것으로 확인되었으며, 이 결과로 판단컨대 이 화합물이 HCT116 대장암세포에 대한 세포독성만을 선택적으로 나타냄을 시사하였다.
Anti-proliferation activities of cleomiscosins with β-cyclodextrin inclusion (CD) complexes. They displayed in vitro cytotoxicity of both cleomiscosin C-CD (black bar) and cleomiscosin D-CD (gray bar) nanoparticles in HCT116 colon cancer cells (A), and cancer-associated fibroblasts (B). Each dose (μg/mL) in the lower line corresponds the amount of cleomiscosin that is loaded in the cleomiscosin-CD nanoparticle described in the upper line.
결 론
단풍나무과(Aceraceae)에 속하는 고로쇠나무(
Acer mono
Maximowicz) 심재로부터 총 6종의 페놀성 성분을 분리하였으며, 그 화학구조는 각각 cleomiscosin C(
1
)와 cleomiscosin D(
2
), 5-
O
-methyl-(
E
)-resveratrol-3-
O
-β-D-glucopyranoside(
3
), 5-
O
-methyl-(
E
)-resveratrol-3-
O
-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside(
4
)와 scopoletin(
5
), 그리고 (
E
)-resveratrol-3-
O
-β-D-glucopyranoside(
6
)으로 밝혀졌다. 이 중 주요 coumarinolignoid 성분이자 난용성 화합물인 cleomiscosin C(
1
)와 cleomiscosin D(
2
)의 암세포증식 억제효능을 HCT116 대장암세포주를 이용하여 MTT법으로 평가하였다. 이는 화합물의 수용성 증대를 목표로 β-cyclodextrin을 이용한 cleomiscosin-CD 포접화합물을 제조한 후 in vitro assay계에 적용함으로써 성공리에 이루어졌으며, 세포활성 결과는 cleomiscosin D(
2
)가 HCT116 암세포에 대한 선택적인 증식억제효능을 나타냄을 증명하였다. 이에 본 연구결과는 고로쇠나무의 성분분석 및 생리활성 연구의 기초자료로 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 천연물 유래 난용성화합물의 생물활성평가를 수월하게 진행할 수 있는 방법의 예시 중 하나로 제시될 수 있으리라 사료된다.
Acknowledgements
본 논문은 2012학년도 목포대학교 교내연구비 지원에 의하여 연구되었으며, 이에 감사드립니다.
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