Two coumarinolignans, cleomiscosins C ( 1 ) and D ( 2 ) were isolated from the heartwood of Acer mono , together with four compounds, 5- O -methyl-( E )-resveratrol-3- O -β-D-glucopyranoside ( 3 ), 5- O -methyl-( E )-resveratrol-3- O -β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside ( 4 ), scopoletin ( 5 ), and ( E )-resveratrol-3- O -β-D-glucopyranoside ( 6 ). Of them, cleomiscosins C ( 1 ) and D ( 2 ) were applied to preparing inclusion complex molecules with β-cyclodextrin (β-CD) to improve the very poor solubility in cell media. The CD complexes of 1 and 2 exhibited an enhancement of water solubility which is feasible to measure their cytotoxicity using a spectrophotometer in a cell-based assay. Anti-proliferative activity of these complex molecules was successfully estimated on HCT116 human colon cancer cells, and cleomiscosin D ( 2 ) showed anti-proliferative effects at the concentration of 1.95~31.2 μg/mL in a dose-dependent manner. 실험재료 − 본 실험에 이용된 고로쇠나무( Acer mono Maximowicz)는 2009년 4월에 전남 광양에서 채취되었으며, 목포대학교 약학대학 김현정교수가 감정한 후 줄기껍질과 심재를 분리하여 음건하였다. 표본(No. P2009AMH)은 목포대학교 약학대학 표본실에 보관되어 있다. 기기 및 시약 − 1D 및 2D를 포함한 NMR 스펙트럼은 Varian사의 INOVA 500MHz NMR( ¹ H: 499.998 MHz)과 VNMRS 600 MHz NMR spectrometer( ¹ H: 600.006 MHz) 를 이용하여 측정하였다. MS는 Varian 320-MS TQ mass spectrometer를 이용하여 negative electrospray ion(ESI) mode에서 측정하였으며, CD(circular dichroism) 스펙트럼은 JASCO J-810 spectrometer를 이용하였다. HPLC는 DAD (diode array detector)가 장착된 Agilent사의 HP1100 series 를 이용하였으며, column으로 Waters사의 SunFire ^TM C18 (4.6×150 mm, 5 μm) 및 SunFire ^TM Prep C18 OBD(5 μm, 19×150 mm)를 이용하였다. Column chromatography는 Merck사의 silica gel 60(70-230 mesh)을 적용하였다. 추출 및 분리 − 고로쇠나무 심재 4.30 kg을 잘게 분쇄하고 25 L의 MeOH로 상온에서 3회 추출한 후 감압농축하여 134.0 g의 추출물을 획득하였다. 이 추출물을 증류수에 현탁한 후 n -hexane, EtOAc, n -BuOH를 이용, 순차적으로 분획하여 각각 n -hexane(8.02 g), EtOAc(17.06 g), n -BuOH (27.58 g) 분획물을 얻었다. 심재 EtOAc 분획물 일부를 silica gel 60 chromatography에 적용하고 CHCl ₃ -MeOH(0.5% formic acid 함유) 조건으로 극성을 증대(24:1→20:1→15:1→10:1→6:1→3:1→1:1, 100% MeOH)시키면서 용출하여 총 12종의 분획(F01-12)을 획득하였다. 화합물 분리정제를 위해 최종적으로 각 분획에 대하여 semi-preparative HPLC를 적용하였고, 그 결과, MeCN-0.1% formic acid 함유 H ₂ O을 이용, 13:87→50: 50 조건에서 50분 동안 용출하여 분획 F03에서 화합물 1 과 5 를, 분획 F04에서 화합물 2 를, F09에서 화합물 3 을 획득하였으며, 분획 F10 (MeCN-0.1% formic acid 함유 H ₂ O 조건, 13:87→40:60, 50분)에서 화합물 6 을, F11 분획(MeCN-0.1% formic acid 함유 H ₂ O 조건, 20:80 →25:75, 40분)에서 화합물 4 를 획득하였다. Cleomiscosin C ( 1 ): UV λ _max (in HPLC solvent) 232 (sh), 327 nm; ¹ H-NMR (500 MHz, DMSO- d ₆ ) δ: 7.97 (1H, d, J =9.5 Hz, H-4), 6.92 (1H, s, H-5), 6.75 (2H, s, H-2'/6'), 6.35 (1H, d, J =9.5 Hz, H-3), 4.96 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-7'), 4.37 (1H, ddd, J =8.0, 4.3, 2.0 Hz, H-8'), 3.79 (3H, s, 6-OCH ₃ ), 3.77 (6H, s, 3'/5'-OCH ₃ ), 3.66 (1H, dd, J =12.5, 2.0 Hz, H-9'a), 3.39 (1H, dd, J =12.5, 4.3 Hz, H-9'b); ¹³ C-NMR (125 MHz, DMSO- d ₆ ) δ: 160.08 (C-2), 147.98 (C-3'/5'), 145.30 (C-6), 144.88 (C-4), 138.04 (C-9), 137.06 (C-7), 136.20 (C-4'), 131.72 (C-8), 125.72 (C-1'), 113.28 (C-3), 111.30 (C-10), 105.62 (C-2'/6'), 100.76 (C-5), 77.76 (C-8'), 76.62 (C-7'), 59.87 (C-9'), 56.13 (3'/5'-OCH ₃ ), 55.84 (6-OCH ₃ ). Cleomiscosin D ( 2 ): UV λ _max (in HPLC solvent) 232 (sh), 327 nm; ¹ H-NMR (600 MHz, DMSO- d ₆ ) δ: 7.95 (1H, d, J =9.6 Hz, H-4), 6.94 (1H, s, H-5), 6.77 (2H, s, H-2'/6'), 6.32 (1H, d, J =9.6 Hz, H-3), 4.96 (1H, d, J =7.8 Hz, H-7'), 4.36 (1H, ddd, J =7.8, 4.2, 2.0 Hz, H-8'), 3.84 (3H, s, 6-OCH ₃ ), 3.77 (6H, s, 3'/5'-OCH ₃ ), 3.62 (1H, dd, J =12.3, 2.0 Hz, H-9'a), 3.36 (1H, dd, J =12.3, 4.2 Hz, H-9'b); ¹³ C-NMR (150 MHz, DMSO- d ₆ ) δ: 160.05 (C-2), 148.00 (C-3'/5'), 145.28 (C-6), 144.87 (C-4), 138.06 (C-9), 136.93 (C-7), 136.23 (C-4'), 131.97 (C-8), 125.70 (C-1'), 113.19 (C-3), 111.11 (C-10), 105.59 (C-2'/6'), 100.97 (C-5), 78.22 (C-8'), 76.27 (C-7'), 59.91 (C-9'), 56.12 (3'/5'-OCH ₃ ), 55.86 (6-OCH ₃ ). 5- O -methyl-( E )-resveratrol-3- O -β-D-glucopyranoside ( 3 ): UV λ _max (in HPLC solvent) 306, 320 nm; ¹ H-NMR (500 MHz, CD ₃ OD) δ: 7.39 (2H, d, J =8.5 Hz, H-2'/6'), 7.07 (1H, d, J =16.0 Hz, H-β), 6.91 (1H, brs, H-2), 6.90 (1H, d, J =16.0 Hz, H-α), 6.77 (2H, d, J =8.5 Hz, H-3'/5'), 6.74 (1H, brs, H-6), 6.58 (1H, t, J =2.0 Hz, H-4), 4.94 (1H, d, J =7.3 Hz, H-1''), 3.94 (1H, dd, J =12.3, 2.0 Hz , H-6''), 3.80 (3H, s, 5-OCH ₃ ), 3.70 (1H, dd, J =12.3, 6.5 Hz, H-6''), 3.45~3.48 (3H, m, H-3'', 4'', 5''), 3.38 (1H, m, H-2''); ESI-MS m/z 403 [M-H] ^- . 5- O -methyl-( E )-resveratrol-3- O -β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside( 4 ): UV λ _max (in HPLC solvent) 215, 307, 320 nm; ¹ H-NMR (500 MHz, CD ₃ OD) δ: 7.39 (2H, d, J =9.0 Hz, H-2'/6'), 7.06 (1H, d, J =16.3 Hz, H-β), 6.90 (1H, d, J =16.3 Hz, H-α), 6.84 (1H, brs, H-2), 6.78 (2H, d, J =9.0 Hz, H-3'/5'), 6.76 (1H, brs, H-6), 6.59 (1H, t, J =2.0 Hz, H-4), 4.98 (1H, d, J =2.5 Hz, H-1'''), 4.90 (1H, d, J =7.5 Hz, H-1''), 4.05 (1H, m, H-6''), 3.97 (1H, d, J =10.0 Hz, H-4'''), 3.89 (1H, d, J =2.5 Hz, H-2'''), 3.81 (3H, s, 5-OCH ₃ ), 3.75 (1H, d, J =10.0 Hz, H-4'''), 3.61 (1H, m, H-5''), 3.61 (1H, m, H-6''), 3.54 (2H, s, H-5'''), 3.46 (1H, m, H-3''), 3.46 (1H, m, H-2''), 3.37 (1H, brt, J =8.5 Hz, H-4''); ¹³ C-NMR (125 MHz, CD ₃ OD) δ: 162.4 (C-5), 160.5 (C-3), 158.7 (C-4'), 141.5 (C-1), 130.4 (C-β), 130.3 (C-1'), 129.2 (C-2'/6'), 126.7 (C-α), 116.7 (C-3'/5'), 111.1 (C-1'''), 108.6 (C-2), 106.8 (C-6), 103.2 (C-4), 102.6 (C-1''), 80.7 (C-3'''), 78.3 (C-2'''), 78.1 (C-3''), 77.0 (C-5''), 75.2 (C-4'''), 75.1 (C-2''), 71.7 (C-4''), 68.9 (C-6''), 65.9 (C-5'''), 56.0 (5-OCH ₃ ); ESI-MS m/z 535 [M-H] ^- . Scopoletin ( 5 ): UV λ _max (in HPLC solvent) 230, 296, 341 nm; ¹ H-NMR (500 MHz, CD ₃ OD) δ: 7.85 (1H, d, J =9.0 Hz, H-4), 7.09 (1H, s, H-5), 6.76 (1H, s, H-8), 6.20 (1H, d, J =9.0 Hz, H-3), 3.90 (3H, s, 6-OCH ₃ ); ¹³ C-NMR (125 MHz, CD ₃ OD) δ: 164.3 (C-2), 153.1 (C-8a), 151.5 (C-7), 147.2 (C-6), 146.3 (C-4), 112.7 (C-3), 112.7 (C-4a), 110.0 (C-5), 104.1 (C-8), 56.9 (6-OCH ₃ ). (E)-Resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside ( 6 , trans -piceid): UV λ _max (in HPLC solvent) 210, 310, 321 nm; ¹ H-NMR (500 MHz, CD ₃ OD) δ: 7.37 (2H, d, J =8.5 Hz, H-2'/6'), 7.02 (1H, d, J =16.3 Hz, H-β), 6.85 (1H, d, J =16.3 Hz, H-α), 6.79 (1H, brs, H-2), 6.77 (2H, d, J =8.5 Hz, H-3'/5'), 6.62 (1H, brs, H-6), 6.45 (1H, t, J =2.0 Hz, H-4) 4.90 (1H, d, J =7.5 Hz, H-1''), 3.94 (1H, dd, J =12.0, 2.0 Hz, H-6''), 3.72 (1H, dd, J =12.0, 6.0 Hz, H-6''), 3.50 (1H, m, H-5'''), 3.47 (1H, m, H-3''), 3.45 (1H, m, H-2''), 3.38 (1H, d, J =9.0 Hz, H-4''); ¹³ C-NMR (125 MHz, CD ₃ OD) δ: 160.6 (C-3), 159.7 (C-5), 158.6 (C-4'), 141.6 (C-1), 130.4 (C-β), 130.1 (C-1), 129.1 (C-2'/6'), 126.8 (C-α), 116.6 (C-3'/5'), 108.4 (C-6), 107.1 (C-2), 104.2 (C-4), 102.5 (C-1''), 78.4 (C-5''), 78.2 (C-3''), 75.1 (C-2''), 71.6 (C-4''), 62.7 (C-6''); ESI-MS m/z 389 [M-H] ^- . β-Cyclodextrin(β-CD)을 이용한 Cleomiscosin 포접화합물 제조 − Cleomiscosin C( 1 ) 및 cleomiscosin D( 2 )가 로딩된 CD 나노입자는 고속진동마쇄기(高速振動磨碎機, highspeed vibration milling system)에서 고체상반응(solid-state reaction)을 통해 만들어졌다(Retsch Co. Ltd., MM 200). 각 cleomiscosin 화합물과 CD는 두 개의 스테인리스 mixing balls과 함께 스테인리스 스틸 capsule 안에 넣어진 후, 상온 20 Hz에서 60분 동안 격렬하게 마쇄되었다. 고속진동마쇄를 통해 얻은 물질을 증류수에 1 mg/mL 농도로 녹이고, 8000 g에서 10분 동안 원심분리(Hanil Science Industrial, MICRO 17TR)하여 포접되지 않은 free cleomiscosin을 제거하였다. 이 과정을 추가 반복하여 상등액을 취합하고 동결 건조하였으며(Samwon Engineering, SFDSM12), 제조된 입자의 모양과 표면전하를 SEM 및 ELS-Z의 zeta-potential 모드에서 각각 측정하여 확인하였다. 입자의 hydrodynamic size를 검사하기 위하여 동결 건조된 시료를 물에 녹이고 ultra-sonication을 1분 동안 실시(Sonics and Materials Inc., Model VC 750)한 후, ELS-Z를 이용하여 DLS (dynamic light scattering) 모드에서 검정하였다. 생성된 포접복합체에서 cleomiscosin 화합물의 부하율(loading efficiency)은 UVVis spectroscopy(Hitachi spectrometer U-2000)를 통해 확인 되었다. 암세포증식 억제활성 평가 − 세포의 증식 및 생존율은 MTT법에 의해 평가되었다. 사람 유래 HCT116 대장암세포 (HCT116 colon cancer cells)와 암-연관 섬유아세포(cancerassociated fibroblasts)를 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 DMEM 배지에 분주하고 37℃로 유지되는 5% CO ₂ 배양기 내에서 유지하였다. 그 후 각 세포를 96 well plate에 동일하게 분주하고(6×10 ³ cells/well), 24시간 동안 배양하였다. 이어 기존의 culture media를 제거하고 serum-free media로 교체한 후, cleomiscosin과 β-CD 포접복합체를 일정 농도로 가하여 48시간 동안 배양하였다. 세포의 활성도(cell viability %)를 측정하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) 용액(1 mg/mL)을 가하고 3시간 동안 더 배양하였다. 상등액을 제거한 후, 생성된 formazan을 DMSO 200 μL로 녹여내고 microplate reader(BioRad, Versamax) 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3회 반복 실시하여 평균값 (means±SD)을 구하였으며, DMSO 대조군의 흡광도값을 기준으로 세포생존율을 비교하였다. 고로쇠나무 심재에 존재하는 화합물의 분리를 위해 해당 원재료에 대한 MeOH 추출물을 제조하였고, 이를 대상으로 용매극성에 따른 분획을 시행하여 n -hexane, EtOAc, n -BuOH 및 H ₂ O 등 4종의 분획물을 획득하였다. 이어 EtOAc 분획물에 silica gel chromatography, HPLC 등을 적용하여 총 6종의 화합물을 분리하였다( Fig. 1 ). 효율적인 성분분석을 위해 각 화합물의 HPLC profile과 UV spectra가 DAD (diode array detector)를 바탕으로 190-400 nm에서 스캔하여 수집되었다. 화합물 1 , 2 및 5 의 UV 스펙트럼을 확인한 결과, 이 화합물들은 330 nm 근처에서 강한 흡수피크를 보여주었으며, 이는 해당 화합물들이 coumarin 유도체임을 시사하였다. 특히 화합물 1 과 2 는 동일한 UV 흡수 스펙트럼을 나타내었으며, 이는 두 화합물이 구조적으로 이성체임을 드러내었다. 화합물 3 , 4 및 6 또한 서로 유사한 UV 흡수형태를 보여주었으며, 307 및 320 nm에서 나타나는 전형적인 흡수피크는 이 화합물들이 stilbene 유도체임을 시사하였다( Fig. 2 ). 화합물 1 과 2 는 모두 백색의 파우더 형태로 분리되었다. 화합물 1 의 ¹ H-NMR 스펙트럼은 δ _H 6.35 및 7.97(각 1H, d, J =9.5 Hz)과 δ _H 6.92(1H, s)에서 coumarin 모핵에 해당하는 proton signals과 더불어 δ _H 6.75(2H, s)에서 두 개의 aromatic protons을, δ _H 4.96(1H, d, J =8.0 Hz)과 δ _H 4.37(1H, ddd, J =8.0, 4.3, 2.0 Hz)에서 두 개의 oxymethine 기를 확인하였고, δ _H 3.66(1H, dd, J =12.5, 2.0 Hz)과 δ _H 3.39(1H, dd, J =12.5, 4.3 Hz)에서 hydroxymethylene기를, δ _H 3.79(3H, s) 및 δ _H 3.77(6H, s)에서 세 개의 methoxyl기를 보여주었다. 이 화합물의 ¹³ C-NMR 스펙트럼 또한 coumarin의 구성요소인 α,β-unsaturated lactone을 δ _C 160.08 (C=O), 113.28(CH), 144.88(CH)에서, 그리고 aromatic ring 을 δ _C 100.76(CH), 145.30(C), 137.06(C), 131.72(C), 138.04(C), δ 111.30(C)에서 나타내었으며, phenylpropanoid 의 구성요소인 1,3,4,5-tetrasubstituted aromatic ring이 δ _C 125.72(C), 105.62(2×CH), 147.98(2×C), δ 136.20(C)에서, oxygenated aliphatic carbons에 해당하는 δ _C 76.62(CH), 77.76(CH) 및 δ _C 59.87(CH ₂ )과 함께 관찰되었다. 추가적인 2D NMR 분석과 함께, 이상의 데이터를 기존문헌에 보고 된 바와 비교하여 10 , 11) 이 화합물의 구조는 cleomiscosin C(aquillochin)임을 확인할 수 있었다. 화합물 2 의 NMR 데이터는 cleomiscosin C( 1 )와 아주 유사하게 나타났으나, C-7'과 C-8'의 chemical shift값에서 차이를 나타내었다. 화합물 1 과 비교할 때, 화합물 2 는 C-7'의 경우 δ _C 76.27(-0.35 ppm)로 upfileld shift로 관찰되었으며, C-8' carbon의 경우 downfield shift로 δ _C 78.22(+0.46 ppm) 에서 관찰되었다. 이 결과는 기존 보고된 문헌과 비교되었으며, 11 , 12) 이를 토대로 화합물 2 의 구조가 cleomiscosin D임을 확인할 수 있었다. 두 coumarinolignan 물질은 circular dichroism spectroscopy에서 흡수밴드를 나타내지 않았다. 또한 HPLC 크로마토그램 상에서 보인 각 성분의 분리행태, 즉, retention time( t _R )의 차이(cleomiscosin C > cleomiscosin D)가 이들의 congeners인 cleomiscosin A와 B의 결과 (cleomiscosin A > cleomiscosin B)와 동일한 양식으로 나타남이 확인되었다. 13 , 14) 화합물 3 , 4 와 6 은 NMR spectrum에서 모두 ( E )-resveratrol aglycone에 해당하는 1,3,5-trisubstituted aromatic ring과 1,4-disubstituted aromatic ring, 그리고 trans -olefinic bond ( J =~16 Hz)의 signals을 보여주었으며, 동시에 당(糖)에 대응하는 전형적인 ¹ H- 및 ¹³ C-NMR 피크를 나타내어 3종 모두 배당체 화합물임을 시사해 주었다. 이 중 화합물 3 과 4 는 한 개의 methoxyl기(δ _H ~3.80)가 존재함을 드러내었고, 그 결합위치는 ( E )-resveratrol aglycone의 C-5임을 HMBC를 통해 확인할 수 있었다. 또한 각 aglycone에 결합된 당의 종류와 위치는 2D NMR과 문헌비교를 통해 이루어졌는데,5) 화합물 3 과 6 에 존재하는 당은 하나의 β-D-glucopyranose로 규명되었으며, 화합물 4 에는 이당류인 β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranose가 존재함을 알 수 있었다. 각 당의 결합위치는 HMBC 스펙트럼에서 당의 anomeric proton과 aglycone의 carbon 사이에 나타나는 correlation 피크를 토대로 C-3 위치로 규명하였다. 상기 분석을 바탕으로 화합물 3 , 4 와 6 의 구조는 5- O -methyl-( E )-resveratrol-3- O -β-Dglucopyranoside( 3 ), 5- O -methyl-( E )-resveratrol-3- O -β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside( 4 )와 ( E )-resveratrol-3- O -β-D-glucopyranoside( 6 )로 판명되었다. 기존 연구된 고로쇠나무( A. mono ) 유래의 2차 대사산물로서, 잎으로부터 화합물 3 및 4 의 존재가 보고되어 있으며 이 화합물들은 간세포보호 활성을 나타냄이 알려져 있다. 5 , 6) 화합물 5 는 coumarin 모핵에 해당하는 proton signals이 δ _H 7.85와 6.20(각 1H, d, J =9.0 Hz)에서 나타났고 δ _H 7.09 와 6.76에서 aromatic protons(1H, s)이, 또한 δ _H 3.90에서 하나의 methoxyl기가 나타나는 것을 확인하였다. 각 피크의 위치, coupling constants 및 HMBC correlation 결과를 문헌 15) 과 비교하여 이 화합물은 scopoletin임이 확인되었다. 고로쇠나무 심재로부터 나온 주요 coumarinolignoid 성분이자, 난용성 화합물인 cleomiscosin C( 1 )와 D( 2 )에 대한 암세포증식 억제효능이 사람유래 대장암세포 HCT116에서 MTT법으로 평가되었다. 세포배지 환경에서 화합물 1 과 2 는 극도로 낮은 용해성으로 인해 세포배지 환경에서 다시 석출되어 세포막에 침전을 형성하는 현상을 일으켰으며, 이는 MTT법의 장애요소로 나타났다. 이를 개선하기 위하여 cleomiscosin C( 1 )와 D( 2 )가 로딩된 β-cyclodextrin(β-CD) 나노입자를 제조하였으며, 이 복합체는 고속진동마쇄계(highspeed vibration milling system)에서 β-CD와 함께 고체상 반응(solid-state reaction)에 의해 생성되었다. 상기 방법을 거쳐 생성된 각 cleomiscosin-CD 포접화합물에 함유되어 있는 cleomiscosin의 함유량(percentage compound content)은 UV spectroscopy에 의해 15.6%로 확인되었다. 화합물 1 과 2 의 암세포증식 억제효능은 수용성이 cleomiscosin-CD 복합체를 이용하여 성공적으로 측정되었다( Fig. 3 ). 나노입자 cleomiscosin C-CD는 최대 200 μg/mL 농도에서도 HCT116 세포에 대한 증식 억제효능을 나타내지 않았다. 반면, cleomiscosin D-CD 포접화합물은 12.5~200 μg/mL 농도, 즉, 1.95~31.2 μg/mL의 cleomiscosin D가 농도의존적으로 암세포의 증식을 억제함을 보여주었다. 더구나 해당 동일농도에서 cleomiscosin D는 암-연관 섬유아세포(cancer-associated fibroblasts)에 세포증식 억제 효능을 나타내지 않는 것으로 확인되었으며, 이 결과로 판단컨대 이 화합물이 HCT116 대장암세포에 대한 세포독성만을 선택적으로 나타냄을 시사하였다. 단풍나무과(Aceraceae)에 속하는 고로쇠나무( Acer mono Maximowicz) 심재로부터 총 6종의 페놀성 성분을 분리하였으며, 그 화학구조는 각각 cleomiscosin C( 1 )와 cleomiscosin D( 2 ), 5- O -methyl-( E )-resveratrol-3- O -β-D-glucopyranoside( 3 ), 5- O -methyl-( E )-resveratrol-3- O -β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside( 4 )와 scopoletin( 5 ), 그리고 ( E )-resveratrol-3- O -β-D-glucopyranoside( 6 )으로 밝혀졌다. 이 중 주요 coumarinolignoid 성분이자 난용성 화합물인 cleomiscosin C( 1 )와 cleomiscosin D( 2 )의 암세포증식 억제효능을 HCT116 대장암세포주를 이용하여 MTT법으로 평가하였다. 이는 화합물의 수용성 증대를 목표로 β-cyclodextrin을 이용한 cleomiscosin-CD 포접화합물을 제조한 후 in vitro assay계에 적용함으로써 성공리에 이루어졌으며, 세포활성 결과는 cleomiscosin D( 2 )가 HCT116 암세포에 대한 선택적인 증식억제효능을 나타냄을 증명하였다. 이에 본 연구결과는 고로쇠나무의 성분분석 및 생리활성 연구의 기초자료로 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 천연물 유래 난용성화합물의 생물활성평가를 수월하게 진행할 수 있는 방법의 예시 중 하나로 제시될 수 있으리라 사료된다.