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Quantitative Determination of the Six Marker Compounds in Eucommiae Cortex by Processing Method
Quantitative Determination of the Six Marker Compounds in Eucommiae Cortex by Processing Method
Korean Journal of Pharmacognosy. 2015. Jun, 46(2): 123-132
Copyright © 2015, The Korean Society of Pharmacognosy
  • Received : May 29, 2015
  • Accepted : June 18, 2015
  • Published : June 30, 2015
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창섭 서
정훈 김
현규 신
병수 김
kbsoo@dju.kr

Abstract
In this study, we carried out quantification analysis of the six marker components, geniposidic acid, chlorogenic acid, geniposide, pinoresinol diglucoside, liriodendrin, and genipin in the 70% ethanol extracts of non-processed Eucommiae Cortex and processed Eucommiae Cortex using a high-performance liquid chromatography coupled with photodiode array detector. The six components were separated on Gemini C 18 column (5 μm, 4.6×250 mm) by the gradient elution with 1.0% (v/v) acetic acid in water and 1.0% (v/v) acetic acid in acetonitrile as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min and the injection volume was 10 mL. The amount of geniposidic acid, chlorogenic acid, geniposide, pinoresinol diglucoside, liriodendrin, and genipin in non-processed Eucommiae Cortex were 1.31, 0.31, 0.66, 0.46, 0.46, and 0.03%, respectively, while the amount of the six compounds in non-processed Eucommiae Cortex were 0.04-0.78, 0.01-0.14%, 0.05-0.63%, 0.01-0.37%, 0.15-0.42%, and not detected, respectively. After processing treatment, the contents of three iridoids, two lingnan, and one phenylpropanoid decreased in Eucommiae Cortex.
Keywords
재료 및 방법
실험재료 − 본 실험에 사용된 두충은 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 규격품을 구입하여 동국대학교 한의과대학 이제현 교수(Gyeongju, Korea)와 대전대학교 한의과대학 서영배 교수(Daejeon, Korea) 등의 전문가로부터 기원 동정 후 실험에 사용하였다. 두충 표본(2012-RISEC)은 한국한의학연구원 K-herb연구단에 보관하였다.
시약 및 기기 − 함량분석을 위해 사용된 geniposidic acid, geniposide 및 genipin은 Wako(Osaka, Japan)에서 구입하였으며, chlorogenic acid, pinoresinol diglucoside 및 liriodendrin은 Acros Organics(Pittsburgh, PA, USA), Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.(Chengdu, China) 및 BioBioPha Co., Ltd.(Kunming, China)에서 순도 98%이상의 표준품을 구입하여 사용하였다. 정량 및 정성분석을 위한 메탄올, 아세토나이트릴 및 물은 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, 초산은 Junsei(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 그 외의 시약은 HPLC 또는 특급 시약을 구입하여 사용하였다. 6종의 정량분석은 Shimadzu Prominence LC-20A series(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하였으며 LC-20AT pump, DGU-20A 3 online degasser, CTO-20A column oven, SIL-20AC autosampler 및 SPD-M20A photodiode array(PDA) detector로 구성되어 있다. 데이터 수집과 처리는 LC solution software(Version 1.24, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하였다. 회화로는 Thermolyne 48000 furnace(Barnstead, Dubuque, IA, USA), 건조기는 OF-22G (JeioTech, Daejeon, Korea), 초음파추출기는 Branson 8510E-DTH(Branson Ultrasonic Co., Danbury, CT, USA) 및 포제는 CBR-101A(GeneCafe, Ansan, Korea)를 사용하였다.
두충 포제 − 구입된 두충 규격품을 온도(160, 180, 200, 220 및 240℃)와 시간(5, 10 및 15분)별로 포제 하였다. 포제 전 해당 온도에서 예비가열을 한 후 설정 온도에 도달했을 때 두충을 넣고 조건대로 조작을 하여 포제하였다. 두충의 온도 및 시간에 따른 포제의 조건은 다음과 같다. 포제하지 않은 원 생약(Eucommiae Cortex; EC1), 160℃-5분(EC2), 160℃-10분(EC3), 160℃-15분(EC4), 180℃-5분(EC5), 180℃-10분(EC6), 180℃-15분(EC7), 200℃-5분(EC8), 200℃-10분 (EC9), 200℃-15분(EC10), 220℃-5분(EC11), 220℃-10분 (EC12), 220℃-15분(EC13), 240℃-5분(EC14), 240℃-10분 (EC15) 및 240℃-15분(EC16). 포제가 완료되면 실온에서 냉각시킨 후 polyethylene:polypropylene(1:1) bag으로 포장하여 냉장 보관 후 실험에 사용하였다.
관능검사 − 청초법(淸炒法)으로 포제를 한 두충에 대하여 적절한 온도와 시간을 설정하기 위하여 위와 같이 포제 한 생약을 본초학 교재 14) 와 대한약전외한약(생약)규격집 15) 을 바탕으로 본초학 전문가인 대전대학교 한의과대학 서영배 교수와 동국대학교 한의과대학 이제현 교수에 의해 관능검사를 실시하였다.
묽은에탄올엑스함량 − 대한약전 생약시험법의 엑스함량 시헙법 16) 에 따라 분석용 검체 약 2.3 g을 정밀하게 달아 삼각 플라스크에 넣고 묽은에탄올 70 mL를 넣어 때때로 흔들어 섞어 5 시간 침출한 후 다시 16~20시간 방치한 다음 여과하였다. 플라스크 및 잔류물은 여액이 100 mL로 될 때까지 묽은 에탄올로 씻어 주었으며, 여액 50 mL를 수욕에서 증발건고하고 105℃에서 4시간 건조하여 데시케이터(실리카겔)에서 식힌 다음 그 질량을 정밀하게 달고 2를 곱하여 묽은에탄올엑스의 양으로 하였다. 건조감량에서 얻은 값에서 건조물로 환산한 검체량에 대한 엑스함량(%)을 산출하여 묽은에탄올엑스함량을 계산하였다.
건조감량 − 대한약전의 생약시험법 16) 에 따라 칭량병을 미리 105℃에서 1시간 건조한 후 그 무게를 정밀하게 달았다. 그 후 무게를 단 칭량병에 시료 약 2 g을 넣어 그 층의 높이가 5 mm 이하가 되도록 편 다음 무게를 정밀하게 측정하여 105℃에서 5시간 건조하여 데시케이터(실리카겔)에서 식힌 후 칭량병을 꺼내어 그 무게를 정밀하게 달아 건조감량(%)을 계산하였다.
회분 − 대한약전의 생약시험법 16) 에 따라 도가니를 미리 550℃에서 1시간 강열하여 데시게이터에서 방냉 한 후 그 무게를 달았다. 무게를 단 도가니에 시료 약 2 g을 넣어 무게를 정밀하게 측정하여 550℃에서 5시간 동안 강열하여 탄화물이 남지 않을 때까지 회화하였다. 방냉 한 후 질량을 정밀하게 달고 다시 항량이 될 때까지 회화하고 방냉 한 다음 그 질량을 정밀하게 달아 회분함량(%)을 계산하였다.
산불용성회분 − 대한약전의 생약시험법 16) 에 따라 회분에 묽은 염산 25 mL을 가하여 5분간 약한 열에 끓여 불용물을 정량용 여과지로 여과한 후 잔류물을 열탕으로 잘 씻어 여과지와 함께 건조하였다. 회분과 같은 방법으로 550℃에서 5시간 동안 강열하여 데시케이터(실리카겔)에서 방냉 한 후 그 무게를 정밀하게 달아 산불용성회분량(%)으로 하였다.
벤조피렌시험 − 두충과 포제된 두충(220℃-10분, 220℃-15분, 240℃-10분 및 240℃-15분)에 대하여 식품의약품안전처 고시 17) 에 따라 시료 약 5.0 g을 정밀하게 달아 물 100 mL 를 넣어 90분간 초음파 추출하였다. 여기에 헥산 약 100 mL 및 내부표준액 1 mL을 넣어 Homogenizer로 5분간 균질 하게 섞은 다음 30분간 초음파 추출하였다. 헥산층을 분액깔 대기에 옮기고 다시 물층에 헥산 약 50 mL씩을 넣고 2회 반복하여 진탕 추출한 후 헥산층을 취하여 분액깔대기에 합하였다. 합한 헥산층에 물 약 50 mL를 넣어 세척하고, 이 헥산층을 무수황산나트륨을 넣은 여과지를 사용하여 탈수 여과한 다음 45℃의 수욕상에서 감압하여 헥산 약 2 mL가 될 때까지 농축하였다. 플로리실카트리지는 미리 디클로로 메탄 10 mL 및 헥산 20 mL를 순서대로 초당 2~3 방울의 속도로 유출시켜 활성화시킨 후 사용하였다. 활성화된 카트리지에 위의 추출용액을 넣어 헥산:디클로로메탄혼합액(3:1) 20 mL를 초당 2~3방울의 속도로 용출시켰다. 이 용출된 액을 35℃이하의 수욕상에서 질소가스 하에 날려 보낸 후 잔류물을 아세토니트릴 1 mL에 녹인 다음 공경 0.45 μm 이하의 멤브레인필터(Woongki Science, Seoul, Korea)로 여과하여 검액으로 하였다. 따로 벤조피렌표준품 및 3-메틸콜란트렌표준품 적당량을 정밀하게 달아 각각 아세토니트릴에 녹여 mL당 1 μg을 함유하는 표준원액 및 내부표준원액을 만들었다. 이 표준원액과 내부표준원액 적당량을 정확하게 취하여 아세토니트릴로 μL 당 3, 5, 10, 20 및 40 ng의 벤조피렌과 각각 50 ng의 내부표준물질이 함유되도록 희석하여 표준액으로 하였다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 Table I 의 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하였으며, 각 표준액에서 얻은 내부표준물질 피크면적에 대한 벤조피렌의 피크면적비[A S /A IS ]를 Y축으로 하고 벤조피렌의 농도를 X축으로 하여 만든 검량곡선을 작성하고, 검액의 내부 표준물질 피크면적에 대한 벤조피렌의 피크면적비[A SAM /A SAMIS ]를 Y축에 대입하여 벤조피렌의 농도를 구하였다.
  • AS: 검량곡선표준용액의 표준물질 피크면적
  • AIS: 검량곡선표준용액의 내부표준물질 피크면적
  • ASAM: 시험용액의 벤조피렌 피크면적
  • ASAMIS: 시험용액의 내부표준물질 피크면적
HPLC condition for benzo(a)pyrene analysis
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HPLC condition for benzo(a)pyrene analysis
내부표준액으로는 3-메틸콜란트렌 표준품을 정밀하게 달아 아세토니트릴에 녹여 1 mL 중 50 ng을 함유하는 용액으로 하였다.
- 정량
- 1) HPLC 분석조건
두충의 주요성분인 geniposidic acid, chlorogenic acid, geniposide, pinoresinol diglucoside, liriodendrin 및 genipin ( Fig. 1 )에 대하여 함량 분석을 위해 Table II 의 조건에 따라 분석하였다.
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Chemical structures of the six marker compounds of Eucommiae Cortex.
HPLC conditions for quantitative analysis
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HPLC conditions for quantitative analysis
- 2) 표준액 및 검액 조제
Geniposidic acid, chlorogenic acid, geniposide, pinoresinol diglucoside, liriodendrin 및 genipin 등 6종의 표준품에 대하여 무게를 정확하게 측정한 후 메탄올로 녹여 모두 1.0 mg/ mL의 농도로 표준용액을 제조한 후 4℃에 보관하면서 사용 전에 희석하여 사용하였다. 검액은 두충 및 포제된 두충분말 약 500 mg을 정밀하게 달아 70% 에탄올을 넣어 50 mL로 한 후 60분간 초음파추출 하였다. 추출액은 0.2 μm syringe filter(SmartPor, Woongki Science, Seoul, Korea)로 여과하여 검액으로 사용하였다.
결과 및 고찰
두충 포제 − 두충의 적절한 포제 방법을 설정하고자 시중 유통품인 두충 생품을 구입하여 시간(5, 10 및 15분)과 온도(160, 180, 200, 220 및 240℃)에 따라 포제를 실시하였다. 생품 두충과 포제된 두충을 Fig. 2 에 나타내었다.
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A macroscopic picture of non-processed Eucommiae Cortex (A) and the processed Eucommiae Cortex produced by ‘plain stir-baking’ with various times and temperatures (B).
관능검사 − 두충을 청초법에 따라 가공하였으며 탄화되지 않고 단면의 백색사(白色絲)가 잘 끊어지는 정도를 기준으로 하였다. 본 실험에서는 180℃-15분과 200℃-10분 및 200℃-15분 동안 가열하는 것을 두충의 초법(炒法)에 적절한 포제 시간과 온도로 판단하였다.
묽은에탄올엑스함량 − 생품 및 두충초의 대한약전 기준에 따른 묽은에탄올엑스함량 측정 결과 평균 및 표준편차는 25.85±4.53%( n =3)이었고 각각의 시료에 따라 17.4535.88%로 나타났다. 이는 대한약전 기준치인 9.0% 이상에 모두 적합하였으며, 두충 및 두충초의 묽은에탄올엑스함량을 9.0% 이상으로 규정하는 것이 타당하다고 사료된다( Table III ).
The results of extract content and loss on drying for the Eucommiae Cortex and its processed products (n=3)
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EC1, Non-processed; EC2, 160℃-5 min; EC3, 160℃-10 min; EC4, 160℃-15 min; EC5, 180℃-5 min; EC6, 180℃-10 min;EC7, 180℃-15 min; EC8, 200℃-5 min; EC9, 200℃-10 min; EC10, 200℃-15 min; EC11, 220℃-5 min; EC12, 220℃-10 min;EC13, 220℃-15 min; EC14, 240℃-5 min; EC15, 240℃-10 min; EC16, 240℃-15 min
건조감량 − 두충 및 두충초의 대한약전에 따른 건조감량 측정 결과 평균 및 표준편차는 3.42±1.28%( n =3)이었고 각각의 시료에 따라 0.36~5.37%로 나타났다. 이는 두충의 대한약전 기준치인 10.0% 이하에 모두 적합하였으며, 두충 및 두충초의 건조감량을 10.0% 이하로 규정하는 것이 타당하다고 사료된다( Table III ).
회분 − 두충 및 두충초의 대한약전에 따른 회분 측정 결과 평균 및 표준편차는 6.57±0.68%( n =3)이었고 각각의 시료에 대하여 5.52~7.88%로 나타났다. 이는 대한약전 기준치 8.0%이하에 적합하였으며, 두충 및 두충초의 회분을 8.0% 이하로 규정하는 것이 타당하다고 사료된다( Table IV ).
The results of ash and acid-insoluble ash for the Eucommiae Cortex and its processed products (n=3)
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EC1, Non-processed; EC2, 160℃-5 min; EC3, 160℃-10 min; EC4, 160℃-15 min; EC5, 180℃-5 min; EC6, 180℃-10 min;EC7, 180℃-15 min; EC8, 200℃-5 min; EC9, 200℃-10 min; EC10, 200℃-15 min; EC11, 220℃-5 min; EC12, 220℃-10 min;EC13, 220℃-15 min; EC14, 240℃-5 min; EC15, 240℃-10 min; EC16, 240℃-15 min
산불용성 회분 − 두충 및 두충초의 대한약전에 따른 산불용성회분 측정 결과 평균 및 표준편차는 4.91±0.76%( n =3) 이었고 각각의 시료에 대한 평균값이 3.72∼5.94%로 나타났다. 이는 대한약전 기준치인 6.0%이하에 적합하였으며, 두충 및 두충초의 산불용성 회분을 6.0%로 설정하는 것이 타당하다고 사료된다( Table IV ).
벤조피렌 − 한약재의 고온건조 및 가공 시 생성될 수 있는 벤조피렌은 1급 발암물질로서 인체에 축적될 경우 폐암, 위암, 피부암, 대장암 및 유방암 등의 각종 암을 유발하고 돌연변이를 일으킨다고 알려져 있다. 18) 따라서 두충을 220℃ 이상의 고온에서 포제 할 경우 발암물질인 벤조피렌의 생성여부 및 생성 량을 조사하고자 식품의약품안전처 고시 17) 에 따라 시험을 실시하였다. 시료 중 생품과 220℃-10분, 220℃-15분, 240℃-10분 및 240℃-15분 동안 포제 한 두충초 등 총 5종의 시료에 대해서 벤조피렌 시험을 실시한 결과 불검출, 0.7, 0.3, 0.3 및 1.4 μg/kg으로 각각 나타났다. 현재 우리나라에서는 생약의 벤조피렌 기준은 지황과 숙지황을 기준으로 5 μg/kg 이하로 허용하고 있다. 19) 이러한 결과와 비교할 경우 두충을 포제 할 때 가해진 온도(220℃ 및 240℃)에서는 벤조피렌의 생성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
정량 − 두충의 성분 분석에 대한 연구는 Ding 등 20) 이 두충의 꽃에서 4종의 iridoids, 1종의 phenylpropanoid 및 6종의 flavonoids에 대하여 HPLC-DAD를 이용하여 분석법을 설정하고 이에 대한 검증을 실시하였다. Dai 등 21) 은 두충의 잎에서 HPLC-UV와 DPPH-HPLC-UV를 이용하여 7종의 성분에 대한 분석과 항산화능을 비교하였으며, Tong 등 22) 은 HPLC와 LC-MS를 이용하여 두충 잎의 추출방법에 따른 chlorogenic acid의 함량을 비교 분석하였다. 또한 Ha 등 10) 은 두충의 수피와 잎에서 geniposide, geniposidic acid 및 aucubin 등 3종의 성분에 대하여 정량분석을 실시하고 이들의 골다공증 효능을 검증하였다. 이에 본 저자들은 이러한 선행 연구를 바탕으로 두충에 포함된 geniposidic acid, chlorogenic acid, geniposide, pinoresinol diglucoside, liriodendrin 및 genipin 등 6종의 성분을 대상으로 포제 전·후에 대하여 함량의 변화를 비교 분석하였다. 함량분석을 위하여 6종의 성분에 대하여 서로 다른 농도 범위에서 검량선을 작성한 결과 상관계수( r 2 )가 0.9997이상의 양호한 직선성을 나타내었으며( Table V ), 상관계수 값이 1.00에 가까운 직선성을 보여 본 실험에서의 직선성이 매우 좋음을 의미한다. Fig. 3 은 HPLC-PDA를 이용하여 두충의 표준품과 추출물에 대한 각각의 검출 파장에서의 크로마토그램을 보여주며, geniposidic acid, chlorogenic acid, geniposide, pinoresinol diglucoside, liriodendrin 및 genipin 등 6종의 성분은 8.76, 12.77, 14.43, 15.10, 16.11 및 17.16분에 각각 검출되었다. 설정된 분석법을 이용하여 두충의 6종 성분에 대하여 시간과 온도에 따라 포제 한 후 이들 성분의 변화를 HPLC로 측정하였다( Fig. 4 ). 두충 및 두충초의 geniposidic acid, chlorogenic acid, geniposide, pinoresinol diglucoside, liriodendrin 및 genipin의 함량 분석 결과 0.04-1.31%, 0.01-0.31%, 0.05-0.66%, 0.01-0.46%, 0.15-0.46% 및 미검출-0.03%로 각각 나타났다( Table VI ). Table VI 에서와 같이 함량 분석 결과를 살펴보면 genipin은 포제할 경우 검출이 되지 않았으며, 이를 제외한 5가지 성분 모두 포제 온도와 시간이 증가할수록 성분의 함량은 오히려 감소하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 Chen 등 23) 의 결과에서 pinoresinol diglucoside가 포제 온도와 시간이 증가하면 성분의 함량은 감소한다는 연구결과와 같은 결과를 보인 반면, 박 등 12) 과 김 등 24) 의 연구 결과와는 다른 결과를 보였다. 이들은 청초법(淸炒法)이 아닌 염자법(鹽炙法), 강자법(薑炙法) 및 초탄법(炒炭法)과 같은 방법으로 포제를 실시한 후 성분의 함량을 비교하였다. 이와 같이 포제 방법에 따라 주요 성분의 함량 차이를 보이므로 최적의 포제법 및 방법을 제시하기 위하여 다양한 방법의 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
Calibration curves of the six compounds
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ay: peak area (mAU) of compounds; x: concentration (μg/mL) of compounds.
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HPLC chromatograms of a standard solution (A, each 100 μg/mL) and 70% ethanol extract of non-processed Eucommiae Cortex (B) at wavelength 240 (I), 270 (II), and 320 (III) nm.
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HPLC profiles of Eucommiae Cortex and its processed products at wavelength 240 (A), 270 (B), and 320 (C) nm. EC1 (1), EC2 (2), EC3 (3), EC4 (4), EC5 (5), EC6 (6), EC7 (7), EC8 (8), EC9 (9), EC10 (10), EC11 (11), EC12 (12), EC13 (13), EC14 (14), EC15 (15), and EC16 (16).
Analytical results (%) of the six marker compounds in Eucommiae Cortex and its processed products (n=3)
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EC1, Non-processed; EC2, 160℃-5 min; EC3, 160℃-10 min; EC4, 160℃-15 min; EC5, 180℃-5 min; EC6, 180℃-10 min;EC7, 180℃-15 min; EC8, 200℃-5 min; EC9, 200℃-10 min; EC10, 200℃-15 min; EC11, 220℃-5 min; EC12, 220℃-10 min;EC13, 220℃-15 min; EC14, 240℃-5 min; EC15, 240℃-10 min; EC16, 240℃-15 min
결 론
본 연구에서는 대한약전에 수록되어 있는 두충을 시간(5, 10 및 15분)과 온도(160, 180, 200, 220 및 240℃)에 따라 포제 할 경우 두충의 주요 성분 중 항염증과 간장질환 (geniopsidic acid), 25) 혈당강화와 항산화(chlorogenic acid), 26) 신경보호(geniposide), 27) 항고혈압(pinoresinol diglucoside), 28) 항염증과 항통증(liriodendrin) 29) 및 신경성장(genipin) 30) 등의 효과를 가진 6종의 성분에 대하여 포제 전·후의 함량 변화를 측정하였다. 함량 분석 결과 genipin은 포제 후 검출이 되지 않았으며, geniposidic acid와 geniposide는 EC5 (180℃, 5분), chlorogenic acid와 pinoresinol diglucoside는 EC2(160℃, 5분) 및 liriodendrin은 EC4(160℃, 15분)에서 포제품 중 최고치인 0.94%, 0.63%, 0.14%, 0.37% 및 0.42%로 각각 검출되었다.
Acknowledgements
본 논문은 2012년도 지식경제부의 재원으로 지역연고산업육성사업(R0001989) 중 우수 한약재 유통을 위한 공동브랜드 육성사업(D12030)의 지원을 받아 수행된 연구임.
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