This study was investigated the radical scavenging effect and the protective activity of caffeic acid (CA) against oxidative stress. CA showed strong 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH) and hydroxyl radical (·OH) scavenging activity, showing 42.00% and 87.22% at 5 μM concentration of DPPH and ·OH scavenging activity, respectively. Furthermore, we studied protective activity of CA from amyloid beta (Aβ _25-35 ) and lipopolysaccharide (LPS) induced neuronal cell damage and neuronal inflammation using C6 glial cells. The treatment of Aβ _25-35 to C6 glial cell showed declines in cell viability and high generation levels of reactive oxygen species (ROS). However, the treatment of CA increased cell viability. The treatment of 5 μM CA led to the elevation of cell viability from 59.28% to 81.22%. In addition, the production of ROS decreased cellular levels of ROS by the treatment of CA. The treatment of LPS to C6 glial cells increased significant elevation of nitric oxide (NO) production, while CA decreased NO production significantly. The production of NO increased by the treatment of LPS to 131.08%, while CA at the concentration of 1 μM declined the NO production to 104.86%. The present study indicated thatCA attenuated Aβ _25-35 -induced neuronal oxidative stress and inflammation by LPS, suggesting as a promising agent for the neurodegenerative diseases. 세포 종류 및 시약 −본 실험에 사용한 CA는 Sigma(Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)사에서 구입하여 사용하였다. C6 glial 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, South Korea)에서 분양 받았으며 배양을 위해 100 units/mL의 penicillin streptomycin, 10% fetal bovine serum(FBS), Dulbecco’ modified eagle medium(DMEM) 배지, trypsin EDTA용액은 Welgene(Welgene, Daegu, South Korea)에서 구입하여 사용하였다. 산화적 스트레스를 유발하기 위한 Aβ _25-35 와 lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma사의 제품을 구입하여 사용하였다. 세포생존율과 ROS 측정을 하기 위해 사용한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)는 BIO BASIC Inc.(Toronto, Canada)에서, dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Bio Pure(Ontario, Canada)에서, dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), 2-deoxy-ribose, naphthyl ethylene diamine dihydrochloride, sulfanilamide는 Sigma사 제품을 사용하였다. FeSO ₄ ·7H ₂ O는 Daejung Chemicals & Metals Co. Ltd.(Gyeonggi-do, South Korea)에서, EDTA disodium salt dehydrate와 phosphoric acid는 Samchun Pure Chemical Co. Ltd.(Gyeonggi-do, South Korea)에서, thiobarbituric acid(TBA)는 Acros Organics(New Jersey, USA)에서, trichloroacetic acid(TCA)는 Kanto Chemical Co. Inc.(Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다. DPPH 소거능 측정 −Ethanol에 농도 별로 희석한 시료와 60 μM DPPH 용액을 각각 100 μl씩 동량으로 96 well plate에 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 free radical 소거 효과를 백분율(%)로 나타내었다. Positive control으로 L-ascorbic acid를 농도별로 조제하여 사용하였다. 19) ·OH Radical 소거능 측정 −PBS에 농도 별로 희석한 시료와 10 mM FeSO ₄ ·7H ₂ O-EDTA, 10 mM 2-deoxy-ribose solution를 혼합하였다. 그 뒤, 10 mM H ₂ O ₂ 를 혼합하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후, 1% TBA solution과 2.8% TCA solution을 혼합하여 20분간 100℃에서 반응시킨 다음, 냉각시켜 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 hydroxyl radical(·OH) 소거 효과를 백분율(%)로 나타내었다. Positive control으로 L-ascorbic acid를 농도별로 조제하여 사용하였다. 20) 세포배양 −C6 glial 세포는 100 units/ml의 penicillin streptomycin과 10% FBS가 함유된 DMEM배지를 사용하여 37℃, 5% CO ₂ incubator에서 배양하였다. 배양된 세포는 1~2일에 한번씩 세포 분화가 최대에 도달하였을 때 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)로 세척 후, 0.05% trypsin과 0.02% EDTA 혼합액으로 부착된 세포를 분리하여 원심분리를 통해 세포를 집적시켰다. 집적된 세포를 배지에 넣고 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. Cell Viability 측정 − C6 glial 세포를 96 well plate에 well당 5×10 ⁴ cells/ml로 seeding하여 37℃에서 2시간 배양 후, 세포가 잘 부착되면 25 μM Aβ _25-35 를 주입하여 24시간 배양하였다. 배양 후, 1, 2.5, 5 μM의 농도별로 CA를 처리하여 24시간 배양하였다. LPS를 처리한 경우, well당 1×10 ⁶ cells/ml로 seeding하여 세포가 잘 부착되면 1, 2.5, 5 μM의 농도별로 CA를 처리하여 3시간동안 배양 후, 8 μg/ml의 LPS 를 처리하여 36시간 배양하였다. 그 뒤, 5 mg/ml의 MTT solution을 각 well에 주입하였다. 37℃에서 4시간 배양한 후 생성된 보라색의 formazan 결정을 DMSO에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 21) ROS 생성률 측정 − C6 glial 세포를 96 well plate에 well 당 5×10 ⁴ cells/ml로 seeding하여 37℃에서 2시간 배양 후, 세포가 잘 부착되면 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 25 μM Aβ _25-35 를 주입하여 24시간 배양하였다. 산화적 스트레스가 유발된 후 CA를 1, 2.5, 5 μM의 농도 별로 처리하여 24시간 배양한 뒤 80 μM DCF-DA용액을 각 well에 주입하여 37℃에서 30분간 배양 후, FLUOstar OPTIMA (BMG lavtech., Ortenberg, Germany)로 excitation-480 nm, emission-535 nm에서 측정하였다. 22) NO 생성률 측정 − C6 glial 세포가 포화상태가 되었을 때, 96 well plate에 well당 1×10 ⁶ cells/ml로 seeding하여 37℃ 에서 2시간 배양 후, CA를 1, 2.5, 5 μM의 농도 별로 처리하여 3시간 동안 배양하였다. 산화적 스트레스를 유발하기 위해 8 μg/ml의 LPS를 처리하여 36시간 배양 후, 상층액과 griess reagent를 각각 100 μl씩 동량으로 반응시킨 후 빛을 차단하여 실온에서 30분간 반응 시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 통계 분석 − 실험 결과들은 평균±표준편차로 나타내었고, 통계 프로그램인 SAS 4.2를 이용하여 각 실험 결과들로부터 ANOVA(analysis of variance)를 구한 후 Duncan’ multiple test( P <0.05)를 이용하여 각 군의 평균 간의 유의성을 검정하였다. ROS의 과다한 축적으로 인한 산화적 스트레스의 독성은 신경세포 사멸과 신경퇴행성 질환의 원인이 되며, 항산화제는 AD, Parkinson’ disease, ischemia와 같이 노화와 관련된 여러 신경 퇴행성 질환에 대한 보호효과가 있다. 23) DPPH 소거 활성은 분자 내 free radical을 가지고 있는 DPPH와 항산화제가 반응하면 불가역적으로 DPPH를 DPPHH의 형태로 환원시키고, 이 과정 중에 보라색에서 무색으로 탈색되게 되는데, 이러한 원리를 이용하여 흡광도의 변화를 측정한 방법으로 가장 널리 사용되는 항산화 측정법이다. 24) Table I 에서 살펴보면, CA의 DPPH 소거능은 농도 의존적으로 증가하였으며, 또한 그 수치가 positive control로 사용한 천연 항산화제인 L-ascorbic acid와 유사한 수치를 나타내어 우수한 DPPH radical 소거능을 나타냈다. ·OH radical은 ROS 중 가장 반응성이 큰 free radical로써, 이는 단백질, 지질, 당, DNA 등의 생체 분자와 반응하여 세포에 산화적 손상을 일으켜 체내에서 심각한 질병을 초래하는 물질로써 알려지고 있다. 25) ·OH radical 소거능 측정은 ·OH radical이 금속이온의 존재 하에 H ₂ O ₂ 와 O ₂ ⁻ 로부터 형성되는 원리를 이용한 Fenton 반응에 의해 측정하였다. 26) CA의 ·OH radical 소거능을 살펴보면( Table II ), 농도 의존적으로 소거 효과가 증가함을 확인하였다. 모든 농도에서 80% 이상의 높은 소거 효과를 확인하였고, 특히 1 μM의 낮은 농도에서 80.16%의 소거효과를 나타내는데, 이는 Lascorbic acid의 77.03% 보다 높은 수치로써 우수한 ·OH radical 소거효과를 확인할 수 있었다. 이상에서 CA가 DPPH, ·OH radical에 대한 소거효과를 확인하여 산화적 스트레스 보호효과가 우수함을 살펴보았다. 신경퇴행성 질환이 증가함에 따라 신경계와 관련된 glial 세포와 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 중추신경계의 신경세포의 하나인 glial 세포는 뇌 내 항상성을 조절하며, 산화적 스트레스로부터 뉴런을 보호하는 역할을 한다. 27) 또한, glial 세포는 염증성 cytokine에 의해 활성화 되며, 이는 AD와 같은 신경퇴행성 질환에서 흔히 발견 된다. 28) Aβ는 39-43개 peptide로 이루어져있으며, 과다하게 축적시 senile plaque를 형성하여 산화적 스트레스로 인한 인지능력과 기억능력이 손상되는 AD의 원인으로 알려지고 있다. Aβ _25-35 fragment는 AD환자의 뇌에서 관찰되며, 응집성과 신경독성의 특징을 나타내어 산화적 스트레스, apoptosis, necrosis, 조직 손상 등의 결과를 초래한다. 29 - 31) MTT assay는 세포 생존율 측정에 널리 사용되는 방법으로, 탈수소효소 작용에 의해 미토콘드리아의 능력을 이용하는 측정법이다. 32) Fig. 1 은 C6 glial 세포에 Aβ _25-35 를 처리하여, 산화적 스트레스를 유발시킨 후 MTT assay를 이용하여 세포 생존율에 미치는 효과를 측정한 결과이다. Aβ _25-35 만을 처리한 control군의 경우에는 59.10%의 낮은 세포 생존율을 나타내어 산화적 스트레스로 인한 세포 손상을 확인하였고, Aβ _25-35 와 caffeic acid를 동시에 처리한 군의 경우 control군보다 높은 세포 생존율을 나타내었으며 특히, 5 μM 의 농도에서는 80% 이상의 높은 세포 생존율을 나타내어 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호효과를 확인하였다. 위 결과는 이전에 보고된 연구인 CA가 PC12 신경세포에서 Aβ _25-35 에 의해 유도된 신경독성에 대한 보호 효과와 일치하는 바이다. 33) 뿐만 아니라, CA는 신경아교세포에서 카드뮴의 결합에 의한 해독효과로 인해 신경세포 보호효과가 밝혀진 바 있으며, HT22 해마세포에서 acrolein에 의해 유도된 신경세포 사멸에 대한 AD 보호효과를 확인하였고, in vivo 상에서 AlCl ₃ 로 유도된 치매에 대한 보호효과도 밝혀진 바 있다. 17 , 18 , 34) 그러므로 CA의 신경퇴행성 질환에 대한 개선효과가 우수할 것으로 사료된다. 세포 내 ROS 농도의 측정은 DCF-DA의 산화에 의한 형광도의 변화로써 측정하였다. DCF-DA는 세포막을 통과하여, 세포 내 ROS를 측정하는 대표적인 물질이며, 세포막을 자유롭게 통과하여 세포 내 esterase에 의해 비형광성 DCFH 로 탈아세틸화되며, DCFH는 H ₂ O ₂ , NO, peroxide, peroxynitrite와 같은 여러 ROS에 의해 산화되어 강한 형광을 나타내는 DCF가 되는 원리를 이용하여 측정하였다. 35) Fig. 2 는 Aβ _25-35 를 처리하였을 때 발생되는 세포 내 ROS 생성율을 알아본 결과이다. 시간이 지남에 따라 모든 군에서 ROS 생성량이 증가하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 산화적 스트레스가 유발되었음을 확인할 수 있었다. 60분 기준으로 ROS 생성량을 측정한 결과 Aβ _25-35 만을 처리한 control군의 ROS 생성량을 100%로 하였을 때, 나머지 군에서는 모두 control 군보다 낮은 ROS 생성량을 확인하였다. 특히, CA를 처리한 군의 경우 normal군보다 낮은 NO 생성량을 확인하여, 산화적 스트레스 개선 효과가 우수한 것으로 생각된다. 이전에 보고된 연구에서 CA는 ROS의 일종인 singlet molecular oxygen 소거효과가 우수 하였으며, 지질 과산화의 지표인 LDL(low-density lipoprotein) 산화 저해 효과에 우수한 효과가 있다는 것이 보고되어 있다. 13 , 14) ROS 뿐만 아니라 reactive nitrogen species(RNS)도 체내 산화적 스트레스에 중요한 영향을 미친다. RNS의 일종인 nitric oxide(NO)는 면역계, 심혈관계, 신경계와 관련한 인자로써, 다양한 생리학적 과다를 조절하는 세포 신호 전달 경로를 매개하는 역할을 한다. 36) 특히, 정상적인 상태에서 신경계에서는 neuro-modulation, neuro-transmission, synaptic plasticity와 같은 중요한 역할을 하지만, 뇌 내 과다한 NO가 축적될 시에는 신경세포 사멸에 영향을 미치며 IL-1β, TNF-α와 같은 염증성 cytokine의 합성을 촉진하여 염증반응으로 인한 신경퇴행성질환의 원인이 된다. 29 , 37) . 특히, AD 환자의 뇌에서 높은 농도의 Aβ는 O ₂ ⁻ 와 NO생성을 증가시켰고, 이들의 상호작용으로 인해 peroxynitrite(ONOO ⁻ )를 형성하여 AD 환자의 뇌에서 손상을 일으킨다. 38) 그러므로, NO농도의 측정은 nitrative stress와 신경세포 손상의 직접적인 원인으로써 이용되는 지표이다. LPS는 뇌에서 glial 세포를 자극하는 내독소로써, IL-1β, TNF-α, IL-6과 같은 염증성 cytokine을 방출시켜 세포에 손상을 주는 것으로 알려져 있다. 39) C6 glial 세포에 LPS를 처리했을 경우 염증반응에 의해 유전자 전사단계에서 유도되는 인자인 inducible nitric oxide synthase(iNOS)를 분비하고, iNOS에 의해 생성된 NO는 세포 사멸을 일으킨다는 연구가 되어진 바 있다. 40) 따라서 본 연구에서 LPS를 처리하여 염증 반응을 유도한 C6 glial 세포에 CA를 처리하여 LPS로 인한 산화적 손상에 대한 신경세포 보호 효과를 확인하였다. Table III 은 LPS로 자극한 C6 glial 세포의 생존율을 알아본 결과이다. LPS가 내독소로 작용하여 세포의 생존율에는 영향을 미치지 않은 것을 확인하였다. 반면에 Fig. 3 은 LPS 처리로 유발된 NO 생성량에 대한 CA의 효과를 살펴본 결과이다. LPS를 처리하지 않은 normal군의 NO 생성량을 100%라고 하였을 때, LPS를 처리 한 control군은 131.08%의 NO 생성량을 나타내어 세포에 손상을 준 것을 확인하였다. 그러나, CA를 함께 처리한 군의 경우, 모든 농도에서 NO 생성량이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 이전의 연구에서 CA가 Raw 264.7 세포에서 NO 생성을 억제하여 세포 내 비가역적 손상을 일으키는 ONOO-의 생성을 억제하여 세포의 손상을 방지한 것으로 보고되어 있으며, in vivo 만성 염증 모델에서 CA를 투여한 결과 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 cytokine의 분비를 감소시켜 항염증 효과가 보고되어 있다. 15 , 41) 본 연구에서는 CA의 항산화 활성과 신경세포의 일종인 C6 glial 세포에 Aβ _25-35 와 LPS로 인한 산화적 스트레스에 대한 보호 효과를 확인하였다. 그 결과, CA는 천연 항산화 제인 L-ascorbic acid와 유사한 수준으로 DPPH 라디칼 소거능, ·OH radical 소거능을 나타내어 우수한 항산화 효과가 있음을 확인하였다. 또한, CA의 Aβ _25-35 로부터 유발된 산화적 스트레스에 대한 보호효과를 확인 해 본 결과, 신경 세포 생존율을 증가 시켰으며 ROS 생성을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다. 게다가, LPS에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 NO 생성 억제를 통한 보호 효과를 살펴볼 수 있었다. 그러므로, CA는 라디칼 소거능 및 신경세포 보호효과가 우수한 것으로 생각된다.