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Phenolic constituents of Nelumbinis Semen and Their Tyrosinase Inhibitory Activity
Phenolic constituents of Nelumbinis Semen and Their Tyrosinase Inhibitory Activity
Korean Journal of Pharmacognosy. 2015. Mar, 46(1): 1-5
Copyright © 2015, The Korean Society of Pharmacognosy
  • Received : December 31, 2014
  • Accepted : March 02, 2015
  • Published : March 31, 2015
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지연 정
은진 모
방연 황
미경 이
mklee@chungbuk.ac.kr

Abstract
In the course of screening tyrosinase inhibitory activity, EtOAc-soluble fraction of Nelumbinis Semen (Seeds of Nelumbo nucifera ) showed significant inhibition. Further fractionation of the EtOAc-soluble fraction resulted in 12 compounds, which were identified as 4-(hydroxymethyl)phenol ( 1 ), tyrosol ( 2 ), 4-(hydroxymethyl)benzaldehyde ( 3 ), 4-hydroxybenzoic acid ( 4 ), 4-(2-methoxyvinyl)benzene-1,2-diol ( 5 ), 2,6-dihydroxybenzoic acid ( 6 ), (2 R -trans)-2,3-dihydro-3,5,7,8-tetrahydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4 H -1-benzopyran-4-one ( 7 ), (+)-catechin ( 8 ), elephantorrhizol ( 9 ), (+)-dehydrovomifoliol ( 10 ), (-)-boscialin ( 11 ) and uridine ( 12 ). Compounds 5 and 7 were first reported from this plant. Among the isolated compounds, compound 7 showed strong inhibition on tyrosinase activity with mixed mechanism of competitive and noncompetitive inhibition.
Keywords
재료 및 방법
실험재료 −실험에 사용한 연자육은 2013년 3월 충북 제천의 약초상에서 구입하여 충북대학교 약초원에서 감정을 받은 후 사용하였으며 표본(CBNU-201303-NS)은 충북대학교 약초원에 보관하고 있다.
성분 분리 −연자육(5 kg)을 80% MeOH로 추출하여 총 MeOH 추출물(103.5 g)을 얻었다. 이를 증류수 현탁한 후 n -hexane, CH 2 Cl 2 , EtOAc, n -BuOH로 용매분획을 반복 실시하였으며, 각각 n -hexane 분획, CH 2 Cl 2 분획, EtOAc 분획 및 n -BuOH 분획을 얻었다. 분획에 대하여 tyrosinase 저해활성 검색한 결과 CH 2 Cl 2 분획과 EtOAc 분획이 저해활성을 나타내었다. 이에 두 분획으로부터 성분분리를 시도하였다. CH 2 Cl 2 분획(8.2 g)을 n -hexane-EtOAc 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 17개의 소분획(NSM1-NSM17)을 얻었다. 그 중 소분획 NSM11에 대하여 CH 2 Cl 2 -MeOH 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 6개의 소분획(NSM11A-NSM11F)을 얻었다. 소분획 NSM11B와 소분획 NSM11D에 대하여 semi-preparative HPLC를 반복 수행하여 화합물 10 11 을 얻었다. EtOAc분획(3.2 g)을 CH 2 Cl 2 -MeOH 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 7개의 소분획(NSE1-NSE7)을 얻었다. 그 중, 소분획 NSE2에 대하여 MeOH을 용매로 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 시행하여 5개의 소분획(NSE2A-NSE2E)을 얻었다. 소분획 NSE2C, 소분획 NSE2D와 소분획 NSE2E에 대하여 semi-preparative HPLC를 반복수행하여 화합물 1 , 2 , 3 7 을 얻었다. 또한 소분획 NSE4에 대하여 CH 2 Cl 2 -MeOH 혼합용매로 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 시행하여 6개의 분획(NSE4A-NSE4F)으로 나누었다. 소분획 NSE4B, 소분획 NSE4C과 소분획 NSE4F에 대하여 semi-preparative HPLC를 반복 수행하여 화합물 4 , 5 9 를 얻었다. 또한 NSE5에 대하여 CH 2 Cl 2 -MeOH을 용매로 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 시행하여 7개의 분획(SCE5A-SCE5G)으로 나누었으며 NSE5F에 대하여 semi-preparative HPLC를 반복 수행하여 화합물 8 을 분리 정제 하였다. 소분획 NSE6에 대하여 CH 2 Cl 2 -MeOH 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼크로마토 그래피를 수행하여 3개의 소분획(NSE6A-NSE6C)을 얻었다. 그 중 소분획 NSE6B에 대하여 semi-preparative HPLC를 반복 수행하여 화합물 6 을 얻었다. 또한 NSE7에 대하여 CH 2 Cl 2 -MeOH을 용매로 Sephadex LH-20 컬럼크로 마토그래피를 시행하여 7개의 분획(SCE7A-SCE7G)으로 나누었으며 NSE7F에 대하여 semi-preparative HPLC를 반복 수행하여 화합물 12 를 분리 정제 하였다. 분리 정제한 화합물은 DRX 400, AMX 500(BRUKER, Germany) NMR과 LCQ Fleet(Thermo Scientific, USA) ESI-MS를 이용하여 구조를 동정하였다.
Tyrosinase 저해 활성 측정 − Tyrosinase 저해 활성은 tyrosine을 기질로 하여 mushroom tyrosinase를 이용하여 측정하였다. Mushroom tyrosinase(Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 50 mM phosphate buffer(pH 6.5)에 녹인 후 시료와 혼합하여 37℃에서 15분간 전처리하였다. 다음 기질인 tyrosine을 가한 후 37℃에서 15분간 반응을 유도하였다. Tyrosinase의 활성은 Eliza reader 측정기를 이용하여 495nm에서 tyrosine이 dopachrome으로 변환되는 것을 측정함으로써 판단하였다. Kojic acid를 대조군으로 사용하였으며 tyrosinase 저해 활성은 시료를 넣지 않은 대조군과 비교하여 상대적인 활성으로 나타내었다.
Lineweaver-Burk 분석 −저해활성을 나타낸 화합물에 대하여 화합물의 농도를 0, 30, 100 μM로 농도를 증가시키면서 tyrosinase 저해 활성을 측정하였다. Lineweaver-Burk식을 이용하여 농도변화에 따른 저해활성을 비교하여 경쟁적, 비경쟁적 저해활성을 판단하였다.
통계분석 −실험결과의 통계적인 유의성은 Student's t-test로 분석하였으며 p value가 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의성있는 것으로 판단하였다.
결과 및 고찰
천연물의 tyrosinase 저해 활성을 검색한 결과 연자육의 EtOAc 분획물이 유의성있는 저해 활성을 나타내었으며 이에 활성성분의 분리를 시도하였다. 연자육의 총 메탄올 추출물을 용매의 극성에 따라 분획하여 n -hexane, CH 2 Cl 2 , EtOAc, n -BuOH 및 물 분획을 얻었으며 각각의 분획에 대하여 tyrosinase 저해활성을 검색한 결과 EtOAc 분획이 가장 뛰어난 활성을 나타내었다( Fig. 1 ). 이에 EtOAc 분획에 대하여 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 성분분리를 시도하였으며 총 12종의 화합물을 분리, 정제하였다. 분리한 화합물은 NMR 및 MS 등의 기기분석을 통하여 그 구조를 규명하였다. 구조 규명 결과 화합물 1 - 6 은 simple phenol성 화합물, 화합물 7 - 9 는 flavonoid 계열 화합물, 화합물 10 , 11 은 megastamine 계열 화합물이다. 이들의 구조는 문헌 15 - 21) 과 비교하여 4-(hydroxymethyl)phenol( 1 ), tyrosol( 2 ), 4-(hydroxy-methyl)benzaldehyde( 3 ), 4-hydroxybenzoic acid( 4 ), 4-(2-methoxyvinyl)benzene-1,2-diol( 5 ), 2,6-dihydroxybenzoic acid( 6 ), (2 R -trans)-2,3-dihydro-3,5,7,8-tetrahydroxy-2-(4-hydroxy-phenyl)-4 H -1-benzopyran-4-one( 7 ), (+)-catechin( 8 ), elephantorrhizol( 9 ), (+)-dehydrovomifoliol( 10 ), (−)-boscialin( 11 )과 uridine( 12 )으로 동정하였다( Fig. 2 ). 분리한 화합물 중 화합물 9 - 11 은 연잎에서 보고되었으며22) 화합물 5 , 7 은 이 식물에서 처음으로 분리 보고되는 화합물이다.
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Effect of total methanolic extract, each fraction of Nelumbinis Semen on tyrosinase activity. Tyrosinase activity was measured using tyrosine as a substrate. Relative activity (%) was calculated as (activity of compound with substrate - negative control of compound without substrate)/(activity without compound and with substrate - negative control without compound and substrate)×100. Results are expressed as the mean±S.D. of three independent experiments, each performed using triplicate wells. Hex, n-hexane fraction; MC, CH2Cl2 fraction; EA, EtOAc fraction; BuOH, n-BuOH fraction; Water, H2O fraction. *p<0.05 compared with control.
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Structures of compounds 1-12 isolated from Nelumbinis Semen.
연자육으로부터 분리한 화합물 12종에 대하여 tyrosinase 저해 활성을 측정하였다. 연자육에서 분리한 화합물 중 flavanonol 계열의 화합물인 화합물 7 이 100 μM에서 유의성있는 저해효능을 나타내었으며 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 69.2%의 저해효능을 나타내었다. 화합물 7 , 8 9 는 모두 flavonoid 계열의 화합물이며 세분하면 화합물은 7 은 flavanonol, 화합물 8 9 는 flavanol 계열의 화합물로 C ring의 carbonyl기의 유무에 차이를 나타낸다. 본 연구의 tyrosinase 저해 실험에서 화합물 7 은 저해효능을 나타내었으나 catechin 계열의 화합물 8 , 9 는 미약한 저해 활성을 나타내었다. Flavanonol 계열의 물질의 경우 B ring의 hydroxyl group의 개수가 tyrosinase 저해 활성에 영향을 준다는 연구 결과가 보고되어 있다 23) . 또한 flavanonol의 3-hydroxy-4-keto 모획은 tyrosinase와 copper chelate 복합체를 형성하여 저해 활성을 증가시킨다는 연구 결과도 보고되어 있다 24) . 따라서 flavonoid B ring의 carbonyl기가 tyrosinase의 저해 효능에 영향을 주는 것으로 추측되며 이에 대해서는 더 연구가 필요하리라 생각된다.
화합물 7 의 tyrosinase 저해활성의 기전을 알아보기 위하여 Lineweaver-Burk 분석을 수행하였다. 화합물 7 의 농도를 0, 30, 100 μM로 농도를 증가시키면서 처리하였을 때, x 절편의 값과 y 절편의 값 모두 증가함을 확인하였다. 따라서 화합물 7 은 경쟁적, 비경쟁적 저해 기전이 모두 관여하는 복합기전에 의하여 tyrosinase의 활성을 저해하는 것으로 추측할 수 있었다.
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Effect of compounds 1-12 from Nelumbinis Semen on tyrosinase activity. Tyrosinase activity was measured using tyrosine as a substrate. Kojic acid was used as the positive control. *p<0.05 compared with control.
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Lineweaver-Burk plots of inhibitory activity of compound 7. Tyrosinase activity was measured using tyrosine as a substrate. The concentration of substrate and compound 7 was added as indicated.
이상의 결과로 연자육으로부터 총 12개의 화합물을 분리하여 그 구조를 동정하였고 tyrosinase의 저해활성을 나타내었다. 또한 연자육의 분획은 melanoma 세포에서 멜라닌 생성에 관여하는 효소의 발현을 억제함으로써 멜라닌의 양을 감소시키는 것으로 보고되었다. 14) 따라서 이러한 멜라닌 생성 저해 및 tyrosinase 저해 효능을 바탕으로 미백 소재로서 연자육의 다양한 응용에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
결 론
본 연구에서는 tyrosinase 저해 활성을 나타낸 연자육르로부터 성분분리를 수행하여 12종의 화합물을 분리 정제하였으며, 분리한 화합물의 구조는 4-(hydroxymethyl)phenol( 1 ), tyrosol( 2 ), 4-(hydroxymethyl)benzaldehyde( 3 ), 4-hydroxy-benzoic acid( 4 ), 4-(2-methoxyvinyl)benzene-1,2-diol( 5 ), 2,6-dihydroxybenzoic acid( 6 ), (2 R -trans)-2,3-dihydro-3,5,7,8-tetrahydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4 H -1-benzopyran-4-one( 7 ), (+)-catechin( 8 ), elephantorrhizol( 9 ), (+)-dehydrovomifoliol( 10 ), (−)-boscialin( 11 )과 uridine( 12 )으로 동정하였다. 분리한 화합물 중 화합물 5 7 은 이 식물에서 처음으로 분리 보고되는 화합물이며 화합물 7 이 유의성있는 tyrosinase 저해활성을 나타냄을 확인하였다. Lineweaver-Burk 분석을 수행하여 화합물 7 의 tyrosinase 저해활성의 기전을 알아보았고 그 결과 경쟁적, 비경쟁적 저해 기전이 모두 관여하는 복합기전에 의해 활성을 저해하는 것으로 추측할 수 있었다.
Acknowledgements
본 연구는 교육부의 산학협력 선도대학(LINC) 육성사업의 지원으로 수행되었으며 이에 감사드립니다.
References
Prota G. (1988) Progress in the chemistry of melanins and related metabolites. Med. Res. Rev. 8 525 - 556    DOI : 10.1002/med.2610080405
Seiberg M. , Paine C. , Sharlow E. , Andrade-Gordon P. , Costanzo M. , Eisinger M. , Shapiro S. S. (2000) Inhibition of melanosome transfer results in skin lightening. J. Invest. Dermatol. 115 162 - 167    DOI : 10.1046/j.1523-1747.2000.00035.x
Yamaguchi Y. , Brenner M. , Hearing V. J. (2007) The regulation of skin pigmentation. J. Biol. Chem. 282 27557 - 27561    DOI : 10.1074/jbc.R700026200
Friedman M. (1996) Food browning and its prevention: an overview. J. Agric. Food Chem. 44 631 - 653    DOI : 10.1021/jf950394r
Sugumaran M. (1991) Molecular mechanisms mammalian melanogenesis comparison with insect culticular sclerotization. FEBS Lett. 293 4 - 10    DOI : 10.1016/0014-5793(91)81140-4
Mayer A. M. (1987) Polyphenol oxidases in plant: recent progress. Phytochemistry 26 11 - 20    DOI : 10.1016/S0031-9422(00)81472-7
Seo S. Y. , Sharma V. K. , Sharma N. (2003) Mushroom tyrosinase: recent prospects. J. Agric. Food Chem. 51 2837 - 2853    DOI : 10.1021/jf020826f
Chang T. S. (2009) An updated review of tyrosinase inhibitors. Int. J. Mol. Sci. 10 2440 - 2475    DOI : 10.3390/ijms10062440
Kim Y.-J. , Uyana H. (2005) Tyrosinase inhibitors from natural and synthetic sources: structure, inhibition mechanism and perspective for the future. Cell. Mol. Life Sci. 62 1707 - 1723    DOI : 10.1007/s00018-005-5054-y
Parvez S. , Kang M. , Chung H. W. , Bae H. (2007) Naturally occurring tyrosinase inhibitors: mechanism and applications in skin health, cosmetics and agriculture industries. Phytother. Res. 21 805 - 816    DOI : 10.1002/ptr.2184
배 기환 (2000) 한국의 약용식물 교학사 서울
Wattanapiromsakul C. , Forsterc P. I. , Waterman P. G. (2003) Alkaloids and limonoids fromBouchardatia neurococca: systematic significance. Phytochemistry 64 609 - 615    DOI : 10.1016/S0031-9422(03)00205-X
Husam M. K. , Dihui H. , Bijun X. , Hui H. , Erning Y. , Binqiang T. , Di X. (2010) Flavonols of lotus (Nelumbo nucifera, Gaertn.) seed epicarp and their antioxidant potential. Eur. Food Res. Technol. 23 387 - 394
Lee J. Y. , Im K. R. , Jung T. K. , Yoon K. S. (2013) The inhibitory effects ofNelumbo nuciferaGaertner extract on melanogenesis. Kor. Soc. Biotechnol. Bioeng. J. 28 137 - 145
Thomas H. F. , Ping C. , Cindy G. U. , Anthony J. D. (1995) One-and two-dimensional NMR study of resol phenol-formaldehyde prepolymer resins. Magn. Reson. Chem. 33 717 - 723    DOI : 10.1002/mrc.1260330905
Yoshiaki T. , Tadashi F. , Shunsuke M. , Takashi A. , Yoshihiro H. , Naohisa I. , Masatake N. (2007) Antoxidant constituents in distillation residue of Awamori spirits. J. Agric. Food. Chem. 55 75 - 79    DOI : 10.1021/jf062029d
Fox M. E. , Jackson M. , Meek G. , Willets M. (2011) Large-scale synthesis of a substitued D-phenylalanine using asymmetric hydrogenation. Org. Process Res. Dev. 15 1163 - 1171    DOI : 10.1021/op200129m
Rukachaisirikul V. , Khamthong N. , Sukpondma Y. , Phongpaichit S. , Hutadilok-Towatana N. , Graidist P. , Sakayaroj J. , Kirtikara K. (2010) Cyclohexene, diketopiperazine, lactone and phenol derivatives from the sea fan-derived fungiNigrosporasp. PSU-F11 and PSU-F12. Arch. Pharm. Res. 33 375 - 380    DOI : 10.1007/s12272-010-0305-3
Mayo F. , Gashe B. A. , Majinda R. R. T. (1999) A new flavan fromElephantorrhiza goetzei. Fitoterapia 70 412 - 416    DOI : 10.1016/S0367-326X(99)00068-4
Wattanapiromsakul C. , Forsterc P. I. , Waterman P. G. (2003) Alkaloids and limonoids fromBouchardatia neurococca: systematic significance. Phytochemistry 64 609 - 615    DOI : 10.1016/S0031-9422(03)00205-X
Yalcin F. N. , Ersoz T. , Akbay P. , Calis I. (2003) Phenolic, megastigmane, nucleotide, acetophenon and monoterpene glycosides fromPhlomis samia and P. carica. Turk. J. Chem. 27 703 - 711
Zheng Z. , Tan H. , Chen J. , Wang M. (2013) Characterization of tyrosinase inhibitors in the twigs ofCudrania tricuspidataand their structure-activity relationship study. Fitoterapia 84 242 - 247    DOI : 10.1016/j.fitote.2012.12.006
Hasnah M. S. , Mohd F. R. , Zanariah U. (2010) Isolation and identification of radical scavenging and tyrosinase inhibition of polyphenols fromTibouchina semidecandraL. J. Agric. Food. Chem. 58 10404 - 10409    DOI : 10.1021/jf102231h