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Screening of Vietnamese Herbal Medicines with Inhibitory Effect on Aldose Reductase (XI)
Screening of Vietnamese Herbal Medicines with Inhibitory Effect on Aldose Reductase (XI)
Korean Journal of Pharmacognosy. 2014. Dec, 45(4): 366-375
Copyright © 2014, The Korean Society of Pharmacognosy
  • Received : September 30, 2014
  • Accepted : November 12, 2014
  • Published : December 31, 2014
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소진 최
영숙 김
주환 김
진숙 김
jskim@kiom.re.kr

Abstract
Aldose reductase (AR) has been indicated the critical enzyme of the polyol pathway in the development of the diabetic complications. In this study, 119 Vietnamese herbal medicines have been investigated for inhibitory activities on AR. Among them, 7 herbal medicines, Synedrella nodiflora (stems and leaves), Combretum sundaicum (stems and leaves), Argyreia acuta (stems and leaves), Platea latifolia (whole plants), Linociera sangda (whole plants), Rhaphiolepis indica (whole plants), Harrisonia perforata (stems and leaves) and 2 fractions from Harrisonia perforata (stems and leaves) with EtOAc and BuOH, exhibited a significant inhibitory activity against AR. Particularly, S. nodiflora, A. acuta and H. perforata (stems and leaves) showed 1.0-1.8 times more potent inhibitory activity than the positive control, 3,3-tetramethyleneglutaric acid (TMG).
Keywords
재료 및 방법
실험재료 −본 실험에 사용된 베트남산 약용식물들( Table I )은 가천대학교 김주환 교수팀에 의해 베트남에서 채집되었으며, 동정을 거친 후 실험에 사용하였다. 증거표본은 한국한의학연구원 한약연구본부 한의신약연구그룹 표본실에 보관중이다.
Inhibitory effect of extracts from Vietnamese herbal medicines on the activities of aldose reductase
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IC50 values were calculated from the dose inhibition curve.
추출 및 시료조제 −분쇄한 시료 200 g에 2 L의 에탄올을 넣고 실온상태에서 3일간 3회 추출하였다. 이를 여과하여 40℃의 수욕 상에서 감압농축을 실시한 후, 동결 건조기에서 건조하였다. 추출물은 실험 수행 전에 감압 하에서 P 2 O 5 를 이용하여 24시간 이상 재건조 한 후 DMSO(Sigma, St. Louis, MO, USA)에 용해시켜 stock solution을 조제하였으며, 분획물은 에탄올 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(n-BuOH), 증류수로 각각 3 회씩 순차적으로 용매분획하여 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물들을 각각 얻었다. 최종 DMSO의 농도가 0.2%가 되도록 15% TWEEN 80(Sigma, St. Louis, MO, USA)용액으로 희석하여 사용하였다. 추출에 이용한 에탄올 및 그 외 시약은 1급 및 특급시약을 사용하였다.
In vitro에서 알도즈 환원 효소 억제 실험 − Sprague-Dawley rat(250-280 g)의 수정체로부터 aldose reductase를 Dufrane 19) 방법으로 분리하였다. 150 mM sodium phosphate buffer(pH 6.2)와 10 mM 2-mercaptoethanol을 적출한 수정체와 함께 분쇄하여 14,000 rpm에서 30분 간 원심 분리한 다음 상층액을 0.22 μM의 filter로 여과하였다. 효소의 단백질은 bovine serum albumin을 표준으로 이용하여 Bradford 20) 방법으로 정량하였다. 150 mM sodium phoshate buffer(pH 6.2), 0.15 mM NADPH, 10 mM DL-glyceraldehyde와 700 μg/ml 효소 혼합액에 0.5% DMSO에 녹인 시료를 가하여 최종용액을 1 ml로 한 뒤 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이때 공시료는 10 mM DL-glyceraldehyde를 첨가하지 않았으며, 표준액은 시료 대신 0.5% DMSO가 들어가도록 하였다. 0.15 ml의 0.5 N HCl을 첨가하여 반응을 종료시킨 뒤, 10 mM imidazole이 첨가된 6M NaOH 0.5 ml을 가하여 60℃에서 15분간 반응시켜 NADPH가 NADP로 전환되는 것을 Spectrofluorometric detector(Ex. 360 nm, Em. 460 nm)로 측정하였다. 모든 시료는 triplicate로 수행하여 IC 50 값으로 나타냈다. Aldose reductase inhibitor로 알려진 3,3-tetramethyleneglutaric acid(TMG) 21) 를 양성대조군으로 택하여 효능을 비교하였다.
결과 및 고찰
천연물로부터 알도즈 환원효소 억제 약물을 검색하기 위해 베트남산 119종의 에탄올 추출물을 이용해 효능을 검색하여 Table I 과 같은 결과를 얻었다.
Table I 에서 보여주는 것과 같이 양성대조군인 TMG의 IC 50 값(1.23±0.01 μg/ml)을 기준으로 알도즈 환원 효소 억제효능을 판단하였다. 이 중 Synedrella nodiflora 의 줄기와 잎(0.88±0.04 μg/ml), Combretum sundaicum 의 줄기와 잎(1.78±0.06 μg/ml), Argyreia acuta 의 줄기와 잎(0.67±0.01 μg/ml), Platea latifolia 의 전초(2.47±0.01 μg/ml), Linociera sangda 의 전초(1.93±0.18 μg/ml), Rhaphiolepis indica 의 전초(1.36±0.01 μg/ml), Harrisonia perforata 의 줄기와 잎(1.23±0.01 μg/ml), Harrisonia perforata 의 줄기와 잎의 EtOAc(2.37±0.12 μg/ml) and BuOH(2.35±0.05 μg/ml) 분획, 9종이 IC 50 <5 μg/ml으로 효능이 뛰어났고, 그 중 S. nodiflora 의 줄기, 잎 그리고 A. acuta 의 줄기, 잎, H. perforata 의 줄기와 잎이 TMG보다 1.0-1.8 배 이상의 우수한 효능이 있음을 알 수 있었다.
국화과의 S. nodiflora 추출물은 항염 효과와 살충 효과가 있다고 보고되었다. 22 , 23) 콤브레타과의 Combretum sundaicum 의 잎과 꽃의 EtOAc 추출물에서 분리된 pentacyclic trierpenoids와 그 외 새로 발견된 물질들이 antiapoptotic protein인 Bcl-xL을 억제하고, 다양한 암세포들의 세포 활성을 억제하여 항암 작용을 한다고 보고되었다. 24) 메꽃과의 A. acuta 의 줄기와 잎은 본 연구팀의 연구 결과 당뇨합병증의 중요한 원인 중 하나인 최종당화산물의 생성을 억제효능이 우수하여 25) in vitro 실험을 통한 효능이 확인이 필요하다고 사료된다. 장미과의 R. indica 뿌리의 methanol 분획의 dibenzofurans, biphenyls와 trierpenoids가 염증매개물질인 N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine(fMLP)가 유도된 산화 생성물을 억제하는 효능이 보고되었다. 26 , 27) 소태나무과의 H. perforate 의 뿌리와 줄기의 methanol 추출물은 Staphylococcus aureus Mycobacterium smegmatis 에 대해 우수한 항균성이 나타났으며, 28) 뿌리는 유방암 세포인 MCF-7에 독성을 나타내 항암작용이 보고되었다. 29) 또한 plasmodium flaciparum을 억제하여 항말라리아 활성이 보고되었다. 30) P. latifolia 와 물푸레나무과의 L. sangda 는 효능 및 성분에 관한 연구가 진행된 바 없으며, 위 7종의 추출물과 2종의 분획 모두 알도즈 환원 효소 억제 효능에 관해 보고된 바 없었다. 본 연구 결과는 안전하고 우수한 알도즈 환원 효소 억제제 후보 물질 발굴을 위한 기초자료로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 당뇨합병증 예방 및 치료제 개발에 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
결 론
119종의 베트남산 약용식물 에탄올 추출물과 분획을 in vitro 에서알도즈 환원 효소 억제활성 검색하였다. 그 결과 S. nodiflora 의 줄기와 잎(0.88±0.04 μg/ml), C. sundaicum 의 줄기와 잎(1.78±0.06 μg/ml), A. acuta 의 줄기와 잎(0.67±0.01 μg/ml), P. latifolia 의 전초(2.47±0.01 μg/ml), L. sangda 의 전초(1.93±0.18 μg/ml), R. indica 의 전초(1.36±0.01 μg/ml), H. perforata 의 줄기와 잎(1.23±0.01 μg/ml), H. perforata 의 줄기와 잎의 EtOAc(2.37±0.12 μg/ml)와 BuOH(2.35±0.05 μg/ml) 분획, 9종이 IC 50 <5 μg/ml으로 효능이 뛰어났고, 추출물이 양성대조군인 TMG와 근접한 효능이 있음을 확인하였고, 그 중 S. nodiflora 의 줄기, 잎 그리고 A. acuta 의 줄기, 잎, H. perforate 의 줄기와 잎이 3종은 양성대조군 TMG보다 1.0-1.8배 이상의 우수한 효능이 있음을 알 수 있었다.
Acknowledgements
본 연구는 한국한의학연구원 기관고유사업 (K13040, K14040)의 지원으로 수행되었으며 이에 감사드립니다.
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