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Development of Analytical Method for Quality Control from New Herbal Medicine(HPL-4)
Development of Analytical Method for Quality Control from New Herbal Medicine(HPL-4)
Korean Journal of Pharmacognosy. 2014. Dec, 45(4): 338-345
Copyright © 2014, The Korean Society of Pharmacognosy
  • Received : August 28, 2014
  • Accepted : December 05, 2014
  • Published : December 31, 2014
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세건 김
디박 쿠마르 서르마
라마칸타 라미차네
경희 이
상미 한
현주 정
hyun104@wku.ac.kr

Abstract
HPL-4 is a new herbal formulation developed for the treatment of osteoarthritis. In this study, we took HPL-4 to develop a method for simultaneous determination of nine marker compounds (protocatechuic acid, chlorogenic acid, liriodendrin, nodakenin, β -D-(3- O -sinapoyl)frucofuranosyl- α -D-(6- O -sinapoyl)glucopyranoside, quercitrin, 6-gingerol, decursin and decursinol angelate) present in the formulation. The analytes were separated by UPLC system consisting of diode array detector at 205 nm and RP-amide column, and solvent system of ACN/0.1%H 3 PO 4 . Analytical method was validated to evaluate its linearity, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), precision, and accuracy. All standards showed good linearity (R 2 >0.99) in the rage of 0.25-400.0 μg/mL. The LOD and LOQ were within the range of 0.021-0.148 and 0.070-0.448 μg/mL, respectively. Intra- and inter-day precision was less than RSD 4.0% and the accuracy was range from 92.00-104.81% with RSD<4.2%. The results suggest that the developed UPLC method is precise, accurate and effective, and could be applied for quality control of HPL-4 formulation.
Keywords
재료 및 방법
시약 및 표준품 − Methanol, acetonitrile, water는 Burdik & Jackson(Muskegon, Ml, USA)사의 HPLC grade를 사용하였다. 표준품으로 사용된 chlorogenic acid, quercitrin, protocatechuic acid(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), nodakenin, decrusin, decrusinol angelate(Korea Promotion Institute for Traditional Medicine Industry, Gyeongsan, Korea), 6-gingerol(Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)은 시약회사로부터 구입하였고, 해동피로부터 분리된 liriodendrin은 충남대학교 약학대학 김영호 교수로부터 공급받아 사용하였다. β -D-(3- O -sinapoyl)fructofuranosyl- α -D-(6- O -sinapoyl) glucopyranoside는 Ko 등 7) 의 방법에 따라 분리한 후 구조를 동정하여 분석에 사용하였으며, 지표성분으로 사용한 각 화합물의 구조는 Fig. 1 과 같다. 분석에 사용된 기기는 Agilent(Santa clara, CA, USA)사의 UPLC-DAD 1290 infinity모델을, 컬럼은 Advanced materials technology(Wilmington, DE, USA)사의 Halo TM RP-amide(2.7 μm, 4.6 ×150 mm)를 사용하였다.
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Chemical structures (1-9) of marker compounds.
HPL-4의 조제 − 원광허브(Jinan, Korea)로부터 구입한 해동피(Kalopanacis Cortex), 목과(Chaenomelis Fructus), 당귀(Angelicae Gigantis Radix), 생강(Zingiberis Rhizoma Crudus), 내복자(Raphani Semen), 삼백초(Saururi Herba)에 각각 10배수의 정제수를 넣고 95~100℃ 3시간 동안 환류추출을 2회 실시 후, 추출액을 25 μm 필터로 여과한 후 여과액을 60℃ 이하에서 감압 농축하여 각각의 건조엑스를 얻은 후에 2(해동피) : 7(목과) : 7(당귀) : 1(생강) : 1(내복자) : 2(삼백초)의 비율로 혼합하였으며, HPL-4 분석시료는 한풍제약으로부터 공급받아 사용하였다.
검액과 표준액의 제조 − 10 mL 용량플라스크에 HPL-4 제제와 표준품을 넣은 후에 50% MeOH을 사용하여 각각 20 mg/mL, 1 mg/mL의 농도가 되도록 만들고 초음파를 이용하여 60분간 추출한 후, 0.45 μm membrane 필터를 이용하여 여과하였다. 표준용액은 5가지 농도범위로 희석하여 냉장고에 보관하여 사용하였다.
분석조건 − UPLC에 RP-amide 컬럼을 장착하여 flow rate 1.3 mL/min, column temperature 45℃, injection volume 4 μL 및 UV wavelength 205 nm로 설정하였으며, 이동상은 아래와 같다.
(A) ACN, (B) 0.1%H3PO4 − (A) 2-4%, 0-3 min; (A) 4-14%, 3-19 min; (A) 14-21%, 19-37 min; (A) 21-44%, 37-44 min; (A) 44-50 %, 44-50 min; (A) 50-56 %, 50-55 min.
분석법 밸리데이션 − UPLC-DAD를 통한 분석법의 타당성을 검토하기 위하여 ‘생약/한약제제의 성분 프로파일 설정 가이드라인’ 8) International Conference on Harmonization(ICH) 가이드라인 9 , 10) 을 참고하여 정량시험법의 밸리데이션 파라미터인 직선성(linearity), 특이성(specificity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ), 정밀성(precision) 및 정확성(accuracy)에 대하여 평가하였다.
직선성 −지표성분으로 설정한 protocatechuic acid( 1 ), chlorogenic acid( 2 ), liriodendrin( 3 ), nodakenin( 4 ), β -D-(3- O -sinapoyl)fructofuranosyl- α -D-(6- O -sinapoyl)glucopyranoside( 5 ), quercitrin( 6 ), 6-gingerol( 7 ), decrusin( 8 ) 및 decrusinol angelate( 9 ) 9가지 화합물을 각각 0.631-5.0, 3.25-60.0, 10.0-400.0, 2.5-40.0, 1.25-20.0, 0.25-10.0, 3.25-60.0 및 5.0-80.0 μg/mL의 농도범위로 희석하였고, 3회 반복 실험하여 검량선을 작성하였다. 작성된 검량선으로부터 상관계수(R 2 )를 구하여 직선성을 검토하였다.
특이성 −분석대상물질을 불순물로부터 정확하게 분리해 낼 수 있는 능력을 말하는 것으로 HPL-4제제 중 지표성분( 1-9 )으로 설정한 피크의 UV spectrum을 DAD로 추출하고, 표준품의 UV spectrum과 비교하여 특이성을 평가하였다.
검출한계 및 정량한계 −검출한계와 정량한계는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법을 사용하였고, 아래의 식을 이용하여 산출하였다.
  • 검출한계 = 3.3×σ/S
  • 정량한계 = 10×σ/S
  • σ: 회귀직선에서 y절편의 표준편차, S: 검량선의 기울기
정밀성 − 9가지 지표성분( 1-9 )에 대하여 직선성 범위 내에 있는 각 3가지 농도에서 하루 3회씩 반복 실험하여 일내(intra-day) 정밀성을 구하였고, 3일간 반복 측정하여 일간(inter-day) 정밀성을 평가하였다. 분석을 통하여 산출된 값들은 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)로 나타내었다.
정확성 −정확성은 분석시료(HPL-4)에 직선성 범위 내에 있는 지표성분( 1-9 )의 3가지 기지량(이미 알고 있는 양)을 각각 첨가하고 이것을 검체로 하였다. 각 시험은 구간마다 3회 반복하여 실험하였고, 측정된 양은 표준용액의 양과 비교하여 회수율(recovery)로 나타내었다.
결과 및 고찰
분석조건의 최적화 − 생약복합제제 HPL-4를 구성하는 6종의 생약 중 목과로부터 protocatechuic acid( 1 ), 해동피로부터 chlorogenic acid( 2 ), liriodendrin( 3 ), 당귀로부터 nodakenin ( 4 ), decrusin( 8 ), decrusinol angelate( 9 ), 내복자로부터 β -D-(3- O -sinapoyl)fructofuranosyl- α -D-(6- O -sinapoyl)glucopyranoside( 5 ), 삼백초로부터 quercitrin( 6 ) 및 생강으로부터 6-gingerol( 7 )을 각각 지표성분으로 설정하였다( Fig. 1 ). 9가지 지표성분들과 인접한 피크의 분리도를 증가시키기 위하여 Waters사의 C 18 (1.8 μm, 2.1×50 mm), Agilent사의 C 18 (1.8 μm, 2.1×50 mm), Advanced materials technology사의 C 18 (2.7 μm, 4.6×100 mm) 및 Halo RP-amide(2.7 μm, 4.6×150 mm) 컬럼을 사용하였고, 컬럼 오븐의 온도변화 30-45℃ 그리고 이동상으로써 MeOH, ACN 및 pH 변화를 준 buffer 를 사용하여 HPL-4 분석에 이상적인 분리조건을 탐색하고 자 하였다(data 미제시). 그 결과 Halo RP-amide(2.7 μm, 4.6×150 mm)컬럼, 컬럼 오븐 온도 45℃, 검출파장 205 nm 및 ACN과 0.1%H 3 PO 4 /H 2 O 혼합용매의 기울기 조건에서 지표성분들의 분리도가 가장 우수하였다. 피크의 순도테스트는 HPL-4제제 내에서 검출된 지표성분의 피크와 표준용액 혼합물의 피크 UV spectrum을 비교하여 흡수파장의 일치 여부를 확인하였으며, 모든 지표성분에서 각각의 표준물질과 동일한 spectrum으로 나타났다. 지표성분 1-9 의 retention time은 5.506, 12.291, 18.717, 20.872, 30.403, 32.985, 44.552, 49.005 및 49.229분으로 나타났다( Fig. 2 ). 또한 최적화된 분석방법으로 HPL-4제제를 구성하는 해동피, 목과, 당귀, 생강, 내복자, 삼백초 등의 6종 생약 추출물을 UPLC에 주입하여 분석한 결과에서도 지표성분으로 설정한 피크는 양호한 분리도를 가지는 것으로 확인되었다( Fig. 3 ).
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UPLC chromatograms of standard mixure (A), HPL-4 extract (B), and UV spectra of marker compounds (C). protocatechuic acid (1), chlorogenic acid (2), liriodendrin (3), nodakenin (4), β-D-(3-O-sinapoyl)-fructofuranosyl-α-D-(6-O-sinapoyl)glucopyranoside (5), quercitrin (6), 6-gingerol (7), decrusin (8), and decrusinol angelate (9).
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UPLC chromatograms of individual plant extract of HPL-4. Kalopanacis Cortex (A), Chaenomelis Fructus (B), Angelicae Gigantis Radix (C), Zingiberis Rhizoma Crudus (D), Raphani Semen (E) and Saururi Herba (F).
직선성, 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ) −지표성분인 1-9 를 0.25-400.0 μg/mL의 농도범위에서 5가지 농도로 희석하여 UPLC 분석조건으로 측정한 결과, 검량선의 상관계수(correlation coefficient, R 2 )는 9가지 지표성분 모두에서 0.998 이상의 우수한 직선성을 나타내었다. 또한 검출한계와 정량한계는 각각 0.021-0.148 μg/mL, 0.070-0.048 μg/mL의 범위를 나타내어 미량의 성분을 검출 또는 정량할 수 있을 것으로 확인되었다( Table I ).
Analyzed data of linearity regression, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) for nine marker compounds in HPL-4
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(a)Y: Peak area, x: sample concentration (μg/mL) (b)R2: correlation coefficient
정밀성 −분석시료에 대한 분석 환경 및 시간 변동에 따른 함량의 변화를 확인하기 위하여 각 지표성분( 1-9 )의 직선성 농도범위에 포함된 3가지 농도(0.63-200.0 μg/mL)를 기준으로 하여 일내 및 일간 정밀성 평가를 실시하였고, 정밀성의 평가는 분석하여 측정된 농도 및 함량값의 상대표준편차로 표시하고, 그 한계는 ±15% 이내로 하였다. 11) 정밀성 시험 결과 일내 정밀성의 RSD는 최소 0.03%에서 최고 2.41%를 나타내었고, 일간 정밀성은 최소 0.01%에서 최고 3.93%의 RSD를 보였으며, 측정된 모든 값은 5% 이내로 개발된 분석조건은 적합한 정밀성을 가지는 것으로 확인되었다( Table II ).
Precision data of each analyte in different concentration
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Conc.: concentration, SD: standard deviation, RSD: relative standard deviation.
회수율 − 분석시료의 이미 알고 있는 참값에 근접한 정도를 확인하기 위하여 분석검체(HPL-4)에 9가지 지표성분( 1-9 )을 각각 3가지농도로 첨가한 뒤 회수율 시험을 통하여 분석법의 정확성을 측정하였다. 회수율의 판정범위는 Kim 등 12) 의 기준에 따라 최소 85%에서 최고 115%, RSD 10% 이하로 정하였고, 회수율 시험 측정 결과 decrusin( 8 )과 liriodendrin( 3 )에서 각각 최소값(100.75%)과 최대값(104.81%)을 보였으며, RSD는 decrusin( 8 )과 protocatechuic acid( 1 )에서 각각 최소값(0.37%)과 최대값(4.17%)으로 나타났다. 측정된 모든 회수율 수치(%)는 판정범위기준 내의 값으로 확인되어 개발된 분석조건은 우수한 정확성을 나타냈다( Table III ).
Analysis result of accuracy test
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(a)Recovery (%)= [(amount found–original amount)/amount spiked] × 100
HPL-4제제 중 지표성분(1-9)의 함량분석 −천연물 소재로부터 개발된 의약품은 단일성분보다는 다양한 화합물의 상호작용으로 생리활성을 나타내는데, 모든 성분들에 대한 구조 및 생리 활성을 규명하는 것은 어렵다고 알려져 있다. 또한, 구성성분 중 약리작용을 나타내는 화합물이 밝혀져 약리활성과의 상관관계가 성립되는 경우도 있지만 모든 생약제제에 적용되는 것은 아니다. 특히 생약복합제제는 두가지 이상의 생약추출물을 합친 것으로 특정성분 하나만으로 약효를 설명할 수 없기에 생약복합제제를 구성하는 구성생약별로 지표성분을 설정하고, 검출되는 모든 성분에 대한 성분프로파일링을 통하여 화합물의 조성과 비율을 관리하는 것이 일정한 약효 및 품질관리를 위해 중요하다. 8) HPL-4 제제의 일관된 품질생산 및 일정한 약효를 기대하기 위하여 UPLC-DAD를 사용한 분석법의 확립 및 검증을 실시하였고, HPL-4 제제 중 9가지 지표성분( 1-9 )의 양호한 직선성을 나타낸 검량식에 의거하여 함량을 측정하였다. 그 결과, HPL-4 제제 내 지표성분으로 설정한 9가지 화합물 1-9 의 함량은 각각 0.16, 1.16, 1.66, 12.98, 0.57, 0.28, 0.02, 1.28, 1.14 mg/g으로 측정되었으며, 지표성분 4 , nodakenin의 함량은 12.98 mg/g으로 가장 높았다( Table IV ). 의약품 개발 가능성을 지닌 HPL-4 제제의 각 지표성분의 함량비를 적용하여 lot간 생산된 제품의 품질 동등성평가를 실시한다면 품질일관성을 평가할 수 있다고 사료된다. 본 연구를 통하여 개발된 HPL-4의 다성분 동시분석법은 천연물을 사용하여 개발되는 건강기능성식품 및 천연물의약품 등의 일관된 품질 생산을 위한 품질 평가법으로써 우수한 기초자료가 될 것이라 판단하였다.
Content of nine marker compounds in HPL-4
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Content of nine marker compounds in HPL-4
결 론
본 연구에서는 항골관절염 활성을 가지는 새로운 생약복합제제 HPL-4의 9가지 지표성분인 protocatechuic acid, chlorogenic acid, liriodendrin, nodakenin, decrusin, decrusinol angelate, β -D-(3- O -sinapoyl)fructofuranosyl- α -D-(6- O -sinapoyl) glucopyranoside, quercitrin, 6-gingerol의 다성분 동시분석법의 개발과 분석법에 대한 검증을 실시하였다. 분석법은 UPLC-DAD를 사용하여 RP-amide 컬럼과 ACN 및 0.1%H 3 PO 4 의 혼합용매를 gradient elution 조건으로 최적화 하였고, 분석법의 검증은 직선성(linearity), 검출한계(LOD), 정량한계(LOQ), 정밀성(precision), 회수율(recovery) 시험을 통하여 입증되었다. 본 연구결과를 통하여 개발된 다성분동시분석법은 HPL-4 제제의 효율적인 품질관리에 사용될 수 있을 것이라 기대된다.
Acknowledgements
본 연구는 지식경제부, 한국산업기술진흥원, 호남광역경제권 선도산업지원단의 광역경제권 선도산업 육성사업으로 수행된 연구결과입니다.
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