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Quantitative Determination and Antioxidant Effects of Cheonwangbosimdan
Quantitative Determination and Antioxidant Effects of Cheonwangbosimdan
Korean Journal of Pharmacognosy. 2014. Dec, 45(4): 300-314
Copyright © 2014, The Korean Society of Pharmacognosy
  • Received : December 04, 2014
  • Accepted : December 26, 2014
  • Published : December 31, 2014
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창섭 서
온순 김
현규 신
hkshin@kiom.re.kr

Abstract
An ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometer (UPLC-ESI-MS) method was established for the simultaneous quantification of eighteen marker compounds in traditional Korean formula, Cheonwangbosimdan (CWBSD). In addition, we evaluated the antioxidant effects of CWBSD. Eighteen marker components were separated on a UPLC BEH C 18 analytical column (2.1×100 mm, 1.7 μm) and kept at 45℃ by gradient elution with 0.1% (v/v) formic acid in water and acetonitrile as mobile phase. The flow rate was 0.3 mL/min and the injection volume was 2.0 μL. The antioxidant activities of CWBSD were assessed by measuring free radical scavenging activities on 2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) and 1-1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). The calibration curves of all analytes showed good linearity (correlation coefficient ≥0.9937) within the test ranges. The limits of detection and quantification for the 18 marker compounds were 0.01-4.71 ng/mL and 0.03-14.13 ng/mL, respectively. The contents of the 18 compounds in CWBSD extract ranged from none to 1701.00 μg/g. The CWBSD showed the radical scavenging activity in a dose-dependent manner. The concentration required for 50% reduction (RC 50 ) against ABTS and DPPH radicals were 149.42 μg/mL and 339.24 μg/mL.
Keywords
재료 및 방법
실험재료 Table I 과 같이 본 실험에 사용된 天王補心丹을 구성하는 15종의 한약재는 모두 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 규격품을 구입하여 동국대학교 한의과대학 이제현 교수(Gyeongju, Korea)로부터 감정 후 사용하였다. 본 처방을 이루는 구성 한약재들의 표본(2012-KE34-1~2012-KE34-15)은 한국한의학연구원 한약방제연구그룹에 보관하였다
Composition of CWBSD
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Composition of CWBSD
시약 및 기기 − Aucubin(≥98.0%), cinnamic acid(≥98.0%), ginsenoside Rb 1 (≥98.0%), schizandrin(≥98.0%) 및 gomisin A(≥98.0%)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 구입하였으며, catalpol(≥98.0%), spinosin (≥98.0%), ginsenoside Rg 1 (≥98.0%) 및 ( E )-harpagoside(≥98.0%)는 Chengdu Biopurify Phytochemicals(Chengdu, China)에서 구입하였다. Harpagide(≥98.0%), salvianolic acid B(≥98.0%), platycodin D(≥98.0%) 및 tanshinone IIA(≥98.0%)는 ChemFaces(Wuhan, China)에서 구입하였으며, 5-HMF (≥98.0%)와 3,4,5-trimethoxycinnamic acid(≥98.0%)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Nodakenin (≥98.0%), myricetin(≥97.8%) 및 β -asarone(≥98.0%)은 NPC Bio Technology(Yeongi, Korea), TCI(Tokyo, Japan) 및 ROTH(Karlsruhe, Germany)로부터 각각 구입하였다. 이들의 화학적 구조는 Fig. 1 과 같다. 항산화 효능 평가를 위한 dimethyl sulfoxide(DMSO), 2,2'-azinobis-3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS) 및 2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. LC-MS/MS 분석을 위한 메탄올, 아세토나이트릴 및 물은 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, 개미산은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
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Chemical structures of 18 marker compounds of CWBSD.
시료 조제를 위한 추출기는 경서기계산업의 초고속진공 저온농축추출기(COSMOS660, Incheon, Korea)를 사용하여 추출하였다. 본 처방의 함량분석에 사용된 UPLC는 pump, digasser, column oven 및 autosampler로 구성된 Waters의 ACQUITY UPLC system(Milford, MA, USA)를 사용하였으며, 질량분석기는 ESI source가 장착된 탠덤 사중극자 질량분석기(ACQUITY TQD LC-MS/MS, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 분석하였다. 데이터는 Waters MassLynx software(version 4.1, Milford, MA, USA)를 사용하여 수집 및 처리하였다.
天王補心丹 물 추출물 조제 −天王補心丹을 구성하는 한약재를 Table I 과 같이 같은 비율로 배합한 후 총 시료 양을 5.0 kg(1첩 48.75 g × 102.5배)으로 맞춘 후 초고속진공저온추출기(Cosmos 660, Kyungseo Machine Co., Incheon, Korea)에 넣고, 물을 시료의 10배(50 L)로 첨가하여 100℃에서 2시간 전탕한 후 표준체(No. 270, 53 μm, Chung Gye Sang Gong Sa, Seoul, Korea)를 이용하여 여과하였다. 여과액은 동결건조기(PVTFD100R, IlShinBioBase, Dongduchun, Korea)를 사용하여 동결건조하여 1065.1 g(21.3%)의 추출물을 얻었다.
표준액 및 검액의 조제 − Aucubin, catalpol, harpagide, 5-HMF, spinosin, nodakenin, myricetin, salvianolic acid B, ginsenoside Rg 1 , 3,4,5-trimethoxycinnamic acid, platycodin D, ( E )-harpagoside, cinnamic acid, ginsenoside Rb 1 , schizandrin, β -asarone, gomisin A 및 tanshinone IIA 18종의 표준품에 대한 표준용액은 메탄올을 이용하여 100.0 μg/mL의 농도로 조제한 후 4℃에 보관하면서 사용 전에 희석하여 사용하였다. 또한 LC-MS/MS 정량분석을 위하여 동결 건조된 추출물 100 mg을 정확히 취한 후 물을 넣어 5 mL로 맞춘 후 5분간 초음파 추출하였다. 추출액에 0.1 mL을 정확히 취한 후 물을 넣어 10 mL로 100배 희석 후 0.22 μm 멤브레인 필터하여 검액으로 하였다.
UPLC 및 LC-MS/MS 분석 조건 −天王補心丹 내 주요성분의 분리와 검출은 Waters(Milford, MA, USA)사의 질량분석기가 결합된 ACQUITY TQD LC-MS/MS를 사용하여 분석 하였다. 주요 성분의 분리는 UPLC BEH C 18 (2.1×100 mm, 1.7 μm, Waters, Milford, MA, USA) 칼럼을 사용하여 분리하였으며, 칼럼 온도는 45℃를 유지하였다. 이동상, 유속 및 주입량은 Table II 와 같다. 또한 각 성분의 MS 및 MS/MS 분석 조건은 Table II 와 같으며 양이온 모드와 음이온 모드에서 검출하였다. 최적의 MS 검출을 위해 capillary voltage(3.3 kV), extract voltage(3 V), source temperature(120℃), RF lens(0.3 V), desolvation temperature(300℃), desolvation gas(600 L/h), cone gas(50 L/h) 및 collision gas(0.14 mL/min) 등에 대한 조건( Table II )과 각 성분의 precursor ion, product ion, cone voltage 및 collision energy 등에 대한 최적의 조건( Table III )을 설정하여 다중반응탐색법(multiple reaction monitoring)을 이용하여 정량을 실시하였다.
Conditions for LC-MS/MS analysis of CWBSD
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1 0.1%(v/v) formic acid in water 2 Acetonitrile
Chromatographic retention time, MRM parameters, cone voltage, and collision energy for 18 compounds
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Chromatographic retention time, MRM parameters, cone voltage, and collision energy for 18 compounds
검량선 작성 − Aucubin, catalpol, harpagide, 5-HMF, spinosin, nodakenin, myricetin, salvianolic acid B, ginsenoside Rg 1 , 3,4,5-trimethoxycinnamic acid, platycodin D, ( E )-harpagoside, cinnamic acid, ginsenoside Rb 1 , schizandrin, β -asarone, gomisin A 및 tanshinone IIA 등 18종의 표준품에 대한 검량선은 10, 50, 100 및 500 ng/mL의 농도로 희석하여 피크 면적과 농도에 대해서 작성하였다. 작성된 검량선은 상관계수( r 2 )를 구하여 직선성을 판단하였다. 검출한계(limit of detection, LOD)와 정량한계(limit of quantification, LOQ)는 신호 대 잡음 비인 3과 10으로 계산하였다.
- 항산화능 측정
ABTS 라디칼 소거능 측정 − ABTS 라디칼을 이용한 항산화능 측정은 ABTS +• cation decol orization assay 방법을 96 well plate에 맞게 수정하여 실시하였다. 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium perulfate를 최종농도로 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS +• 를 형성 시킨 후 743 nm에서 0.7의 흡광도 값을 갖도록 phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)로 희석하였다. 96 well plate에 ABTS +• 용액과 시료를 혼합하여 실온에서 5분간 반응시킨 후, microplate reader(Benchmark Plus, Bio-Rad. USA)를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 항산화능은 시료를 녹인 용매인 PBS를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다. 활성비교를 위하여 vitamin C를 사용하였다.
  • ABTS radical scavenging activity
  • = (1 − Asample/Acontrol) × 100
DPPH 라디칼 소거능 측정 − DPPH 라디칼을 이용한 항산화능 측정은 96 well plate을 이용하여 실시하였다. 96 well plate에 0.15 mM의 DPPH 용액과 시료를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 항산화능은 시료를 녹인 용매인 DMSO를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다. 활성비교를 위하여 vitamin C를 사용하였다.
  • DPPH radical scavenging activity
  • = (1 − Asample/Acontrol) × 100
결과 및 고찰
LC-MS/MS 분석조건 확립 −天王補心丹을 구성하는 구성 생약의 주요 성분인 aucubin, catalpol(이상 생건지황), β -asarone(석창포), ginsenoside Rb 1 , ginsenoside Rg 1 (이상 인삼), nodakenin(당귀), schizandrin, gomisin A(이상 오미자), 5-HMF(천문동), myricetin(백자인), spinosin(산조인), cinnamic acid, harpagide, ( E )-harpagoside(이상 현삼), salvianolic acid, tanshinone IIA(이상 단삼), platycodin D(길경) 및 3,4,5-trimethoxycinnamic acid(원지) 등 18종 성분에 대하여 LC-MS/MS를 이용하여 동시 정량을 실시하였다. 역상 UPLC 조건에서 UPLC BEH C 18 (2.1 × 100 mm, 1.7μm) 칼럼을 이용하여 성분의 분리를 위해 이동상으로 물-메탄올, 물-아세토나이트릴, 산이 함유된 물-메탄올 및 산이 함유된 물-아세토나이트릴 등을 이용하여 성분들의 검출을 시도하였다. 그 결과 최적의 이동상 조건을 산이 함유된 물-아세토나이트릴로 결정하였으며, 산으로 피크 꼬리 끌림 현상을 줄이고 각 성분의 이온에 대한 검출 감도를 향상시키기 위하여 0.1% 개미산을 첨가하였다. 이와 같이 최적의 이동상을 이용하여 ESI 방법의 양이온 모드와 음이온 모드에서 Table II III 의 조건과 같이 분석을 실시하였으며, 칼럼온도는 45℃, 유속은 분당 0.3 mL로 하여 모든 성분을 11분 이내로 분리하였다.
검량선, 검출한계 및 정량한계 작성 − LC-MS/MS를 이용하여 농도에 대한 피크 면적 값에 대하여 18종 성분의 검량선 작성 결과 상관 계수( r 2 ) 값이 0.99이상으로 양호한 직선성을 나타내었으며, 검출한계와 정량한계는 0.01-4.71 ng/mL와 0.03-14.13 ng/mL로 나타났다( Table IV ).
Linearities, regression equation, correlation coefficients, LOD, and LOQ for 18 marker compounds
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Linearities, regression equation, correlation coefficients, LOD, and LOQ for 18 marker compounds
天王補心丹 추출물 중 주요성분의 함량분석 −확립된 LC-MS/MS 분석 방법에 의해 天王補心丹의 주요 성분에 대한 피크 확인을 실시하였다. 그 결과 5-HMF, spinosin, nodakenin, myricetin, 3,4,5-trimethoxycinnamic acid, cinnamic acid, schizandrin, β -asarone, gomisin A 및 tanshinone IIA 등 10종은 m / z 126.9, 609.5, 409.4, 319.2, 239.2, 148.9, 433.3, 209.2, 417.4 및 295.3에서 [M+H] + 형태의 분자이온 피크를 확인하였으며, aucubin, catalpol, harpagide, salvianolic acid B, ginsenoside Rg 1 , platycodin D, ( E )-harpagoside 및 ginsenoside Rb 1 등 8종의 성분은 m / z 345.3, 361.3, 363.3, 717.5, 799.2, 1224.3, 493.4 및 1107.5에서 [M−H] 형태의 분자이온 피크를 각각 확인하였다( Table III ). LC-MS/MS를 이용한 이들 성분들의 정량분석을 위하여 precursor ion(Q1)과 product ion(Q3) 설정은 다음과 같다( Fig. 2 ). Aucubin, catalpol 및 ginsenoside Rg 1 의 MRM 조건은 m / z 345.1, 361.3 및 800.4(precursor ion)에서 glucose 1분자가 각각 이탈된 [M−H−Glc] 형태의 m / z 183.4, 199.1 및 637.0(product ion)에서 각각의 피크를 확인하였다. 26 , 27) Harpagide는 m / z 363.2에서 1분자의 glucose와 물 분자가 떨어진 [M−H−Glc−H 2 O] 형태의 m / z 183.1에서 피크를 확인하였으며, 28) 5-HMF는 m / z 126.9에서 물 분자 1개가 이탈된 [M+H−H 2 O] + 형태의 m / z 108.8에서 분자 이온 피크를 확인하였다. 29) Spinosin은 m / z 609.6에서 1분자의 glucose와 C 4 H 6 O 4 가 떨어진 [M+H−C 4 H 6 O 4 ] + 형태의 m / z 327.1에서 피크를 확인하였으며, 30) nodakenin은 m / z 409.4에서 glucose가 떨어진 [M+H−Glc] + 형태의 m / z 247.2에서 분자 이온 피크를 확인하였다. 31) Myricetin과 salvianolic acid B는 m / z 319.2와 717.5에서 C 8 H 6 O 4 와 C 9 H 9 O 5 가 각각 떨어진 [M+H−C 8 H 6 O 4 ] + 와 [M−H−C 9 H 9 O 5 ] 형태의 m / z 153.1과 519.2에서 피크를 각각 확인하였으며, 32 - 34) platycodin D는 28번 탄소에 결합된 Ara-Rha-Xyl-Api에서 90 Da이 이탈된 m / z 469.4에서 분자 이온 피크를 확인하였다. 35) 3,4,5-Trimethoxycinnamic acid, cinnamic acid, schizandrin 및 gomisin A는 m / z 239.2, 148.9, 433.4 및 417.4에서 1개의 물분자가 이탈된 [M+H−H 2 O] + 형태의 m / z 221.1, 130.9, 415.1 및 399.4에서 분자 이온 피크를 확인하였다. 36 - 38) ( E )-Harpagoside는 m / z 493.4에서 cinnamic acid가 이탈된 [M−H−cinnamic acid] 형태로 m / z 345.6에서 확인하였으며, 39) ginsenoside Rb 1 은 [Glc−H] 형태의 m / z 178.8에서 분자 이온 피크를 확인하였다. 40) β -Asarone은 m / z 209.1에서 메틸기가 이탈된 물 분자가 떨어진 [M+H−CH 3 ] + 형태의 m / z 194.0에서 확인하였으며, 41) tanshinone IIA는 m / z 295.3에서 1개의 물 분자와 CO 분자가 이탈된 [M+H−H 2 O−CO] + 형태의 m / z 249.2에서 분자 이온 피크를 확인하였다. 42) 이상과 같이 각 성분의 precursor ion과 product ion을 설정한 후 정량을 실시하였으며, 설정된 天王補心丹의 LC-MS/MS MRM 분석법에 의해 분석한 결과 aucubin, catalpol, harpagide, 5-HMF, spinosin, nodakenin, myricetin, salvianolic acid B, ginsenoside Rg 1 , 3,4,5-trimethoxycinnamic acid, platycodin D, ( E )-harpagoside, cinnamic acid, ginsenoside Rb 1 , schizandrin, β -asarone, gomisin A 및 tanshinone IIA 등 18종의 성분은 0.80, 0.80, 0.80, 1.06, 1.37, 1.85, 2.23, 2.35. 2.69, 3.08, 3.38, 3.39, 3.74, 4.34, 6.48, 6.57, 7.10 및 10.44분에서 각각 검출되었다( Table III Fig. 3 ). 함량 분석 결과 天王補心丹 추출물 중에서 천문동(天門冬)의 5-HMF, 백자인(柏子仁)의 myricetin, 오미자(五味子)의 schizandrin 및 단삼(丹蔘)의 tanshinone IIA 등 4종은 검출이 되지 않았으며, 이들 4종을 제외한 14종의 성분 함량은 6.23-1701.00 μg/g으로 나타났다( Table V ).
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Q1 (A) and Q3 (B) mass spectra of 18 standard compounds. Aucubin(1), catalpol(2), harpagide(3), 5-HMF(4), spinosin(5), nodakenin(6), myricetin(7), salvianolic acid B(8), ginsenoside Rg1(9), 3,4,5-trimethoxycinnamic acid(10), platycodin D(11), (E)-harpagoside(12), cinnamic acid(13), ginsenoside Rb1(14), schizandrin(15), β-asarone(16), gomisin A(17), and tanshinone IIA(18).
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Total ion chromatogram of 18 marker compounds (A) and CWBSD sample (B) by LC-MS/MS MRM mode. Aucubin(1), catalpol(2), harpagide(3), 5-HMF(4), spinosin(5), nodakenin(6), myricetin(7), salvianolic acid B(8), ginsenoside Rg1(9), 3,4,5-trimethoxycinnamic acid(10), platycodin D(11), (E)-harpagoside(12), cinnamic acid(13), ginsenoside Rb1(14), schizandrin(15), β-asarone(16), gomisin A(17), and tanshinone IIA(18).
Amount of 18 marker compounds in CWBSD
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天王補心丹 추출물의 항산화 효능 −天王補心丹의 항산화 효능을 평가하고자 추출물을 농도별로 조제한 후 ABTS와 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다. ABTS 라디칼의 소거활성을 비교한 결과 추출물의 농도가 증가함에 따라 ABTS 라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 보였다. 天王補心丹 추출물 25, 50, 100, 200 및 400 μg/mL 농도에서 각각 9.78, 20.31, 35.49, 65.21 및 94.87%의 라디칼 소거활성을 나타냈으며, 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 감소시키는데 필요한 시료의 양(RC 50 )은 149.92 μg/mL 로 관찰되었다. 양성대조군인 vitamin C의 RC 50 값은 3.40 μg/mL로 관찰되었다( Fig. 4 A). DPPH 라디칼의 소거활성 또한 ABTS 라디칼의 소거활성과 유사하게 농도의존적인 증가를 나타냈다. 추출물 25, 50, 100, 200 및 400 μg/mL 농도에서 각각 4.02, 9.92, 17.61, 37.18 및 57.02%의 라디칼소거활성을 나타냈으며, RC 50 는 339.24 μg/mL로 관찰되었다. 양성대조군인 vitamin C의 DPPH 라디칼에 대한 RC 50 값은 12.62 μg/mL로 관찰되었다( Fig. 4 B).
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Effects of CWBSD on ABTS and DPPH free radical scavenging activity. ABTS(A) or DPPH(B) radical solution was added to a 96-well plate containing of indicated concentrations of CWBSD or vitamin C. After 30 min of incubation, the absorbance(ABTS; 734 nm, DPPH; 517 nm) was measured using a microplate reader. The quantitative data were presented as mean±S.E.M. of triplicate experiments.
결 론
天王補心丹을 구성하는 15가지 구성 생약의 주요 성분 중 aucubin, catalpol, harpagide, 5-HMF, spinosin, nodakenin, myricetin, salvianolic acid B, ginsenoside Rg 1 , 3,4,5-trimethoxycinnamic acid, platycodin D, ( E )-harpagoside, cinnamic acid, ginsenoside Rb 1 , schizandrin, β -asarone, gomisin A 및 tanshinone IIA 등 18종의 성분에 대하여 LC-MS/MS를 이용한 함량분석을 실시하였다. 분석 결과 본 한약 처방에서는 단삼(丹蔘)의 주요 성분인 salvianolic acid B가 가장 많은 1701.00 μg/g으로 검출되었으며, 당귀(當歸)의 nodakenin(463.50 μg/g), 길경(桔梗)의 platycodin D(225.00 μg/g), 현삼(玄蔘)의 ( E )-harpagoside(202.50 μg/g), 석창포(石菖蒲)의 β -asarone(204.17 μg/g) 및 생건지황(生乾地黃)의 catalpol(167.83 μg/g) 등이 다른 성분에 비해 많이 함유되어 있음을 확인하였다. 또한 天王補心丹의 ABTS와 DPPH 라디칼 제거를 통한 항산화 활성은 용량이 높을수록 높은 활성을 나타내었다. 이러한 분석 결과는 天王補心丹의 품질관리와 새로운 생리활성 연구를 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료되며, 天王補心丹의 항산화 효능을 통해 산화적 스트레스에 의한 다양한 질환의 초기단계를 예방하는데 활용할 수 있을 것으로 기대 된다.
Acknowledgements
본 연구는 한국한의학연구원에서 지원하는 ‘한약 처방의 과학적 근거 기반 구축사업(K14030)’에 의해 수행되었으며 이에 감사 드린다.
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