The present study was conducted to evaluate the hair growth-promoting effect of Clitocybin A from mushroom Clitocybe aurantiaca with dermal papilla cells (DPCs), which play important roles in the regulation of hair cycle. Clitocybin A significantly increased the proliferation of immortalized rat vibrissa DPCs. Flow cytometry analysis revealed that Clitocybin A promoted cell-cycle progression through G0/G1 to S phase in immortalized rat vibrissa DPCs. In addition, Clitocybin A increased the level of cell cycle proteins such as cyclin D1, phospho-pRB, and phospho-CDK2. To elucidate the molecular mechanisms of Clitocybin A on the proliferation of DPCs, we examined the activation of wnt/β-catenin signaling which is known to regulate hair follicle development, differentiation and hair growth. Clitocybin A activated wnt/β-catenin signaling via the increase of phospho(ser552)-β-catenin, phospho(ser675)-β-catenin and phospho(ser9)-GSK3β. Furthermore, Clitocybin A markedly increased the activation of extracellular signal-regulated kinase (ERK). These results suggest that the Clitocybin A may induce hair growth by proliferation of DPCs via cell-cycle progression as well as the activation of Wnt/β-catenin signaling and ERK pathway. 시료 − 실험재료인 Clitocybin A는 한국생명공학연구원 화학생물연구센터에서 공급받아 사용하였다. 시료는 dimethyl sulfoxide(DMSO)로 녹여 실험에 사용하였으며, DMSO의 최종 농도는 0.2%를 초과하지 않도록 하였다. 모유두 세포의 배양 − 흰쥐 수염에서 분리된 모유두 세포를 불멸화한 세포(Rat vibrissa immortalized dermal papilla cell) 26) 는 ㈜아모레퍼시픽 피부과학연구소로부터 제공받았다. 모유두 세포를 100 units/ml penicillin-100 µg/ml streptomycin(Gibco Inc, NY, USA)과 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; Gibco Inc, NY, USA)이 함유된 DMEM (Hyclone Inc, UT, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO ₂ 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양 하였다. MTT assay − 모유두 세포의 증식은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay를 이용하여 측정하였다. 27) 모유두 세포(1.0×10 ⁴ cells/ml)를 1% FBS를 포함한 DMEM 배지에 혼탁하여 96 well plate에 넣고 24시간 배양 후 Clitocybin A(0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 및 50 µM)를 처리하였다. 양성 대조군으로 minoxidil(Sigma, MO, USA)을 10 µM의 농도로 처리하였다. 4일 동안 배양한 후 2 mg/ml 농도의 MTT(Sigma, MO, USA) 50 µl씩을 well에 첨가하고 4시간 동안 반응시켰다. 상층액은 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO) 200 µl을 가하여 침전물을 용해 시킨 후 microplate reader(Amersham Pharmacia Biotech, NY, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 증식정도를 조사하였다. 세포주기 분석 − 모유두 세포는 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 24시간 동안 배양한 후에 Clitocybin A (0.001, 0.01, 0.1 µM) 또는 10 µM minoxidil을 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하고, PBS로 세척한 다음, -20℃에서 30분 동안 70% ethanol로 고정하였다. RNase A(50 µg/ml) 처리하고, propidium iodide(PI)로 염색한 다음 FACScan flow cytometer(Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA)로 세포주기를 분석하였다. Western blot analysis − 모유두 세포를 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 24시간 동안 배양한 후에 Clitocybin A(0.001, 0.01, 0.1 µM) 또는 10 µM minoxidil을 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척한 후 200 µl의 lysis buffer [50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO ₃ , 10 mM NaF, 1 mM dithiothreitol(DTT), 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF), 25 µg/ml aprotinin, 25 µg/ml leupeptin and 1% NP-40]를 첨가한 다음, 4℃에서 30분 동안 lysis 시켰다. Cell lysate는 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었고 실험에 사용전까지 -20℃에 보관하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin(BSA)를 표준물질로 사용하여 Bradford method에 의하여 정량하였다. 28) 20-30 µg의 lysate를 8-12% Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 변성 분리한 다음 polyvinylidene fluoride(PVDF) membranes(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 200 mA에서 2시간 동안 transfer하였다. 그리고 membrane의 blocking은 5% nonfat dried milk가 함유된 Tween-20-TBS(T-TBS)(50 mM Tris, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20) 용액에서 2시간 동안 실시하였다. Membrane은 여러 단백질의 발현을 조사하기 위해 Cyclin D1(1:1000), phospho-CDK2(1:1000), CDK2(1:1000), Cyclin E(1:2000), phospho(ser780)-pRB(1:1000), phospho-ERK1/2 (1:1000), phospho(ser552)-β-catenin(1:1000), phospho(ser675)-β-catenin(1:1000), β-catenin(1:2000), phospho(ser9)-GSK3β (1:1000), GSK3β(1:1000) and β-actin(1:5000)에 대한 primary antibody로 4℃에서 overnight 결합시켰다. Secondary antibody는 Horse Radish Peroxidase(HRP)가 결합된 anti-rabbit IgG, anti-mouse IgG를 1:5000으로 희석하여 1시간 동안 상온에서 반응을 진행하였다. 그 다음 T-TBS로 membane을 3회 세척한 후, ECL 기질(Intron, Seoul, Korea)로 1분 동안 반응시킨 다음 X-ray film(AGFA, Mortsel, Belgium)에 감광하였다. Band intensities는 NIH Image 소프트웨어를 이용하여 정량하였다( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). 통계분석 − 모든 측정결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 통계학적 유의성 검정은 student's t-test으로 검정하였으며, p -value가 0.05 이하일 경우 유의성을 인정하였다. 통계 처리는 Sigma Stat software(Jandel Scientific Software, USA)를 사용하였다. Clitocybin A가 모유두 세포의 성장증식 효능이 있는지 불멸화된 모유두 세포를 사용하여 조사하였다. 모유두 세포는 모낭의 기저에 위치하는 중배엽 유래 세포로써, 모기질 세포(matrix cells)와의 상호작용, hair germ을 통한 stem cell 활성화 및 모발의 재생에 중요한 작용을 한다고 알려져 있다. 12 , 16 , 29 , 30) Clitocybin A을 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 및 50 μM 농도로 처리하였을 때, 대조군(100.0±7.1)%에 비하여 각각 116.7±11.3%( p <0.001), 115.3±11.7%( p <0.001), 112.6±11.5%( p <0.01), 110.5±7.9%( p <0.01), 100.3±6.5% 및 80.2 ±6.0% 정도 모유두 세포의 증식이 증가하였다. Clitocybin A(0.001 and 0.01 μM)의 모유두 세포의 증식 효과는 양성 대조물질로 사용한 10 μM minoxidil의 115.7±9.9%( p < 0.001)와 비슷한 증식 증가 효과를 나타내었다( Fig. 1 ). 반면 50 μM 이상의 농도에서 Clitocybin A는 세포성장을 억제함을 확인하였다( Fig. 1 ). 이전 연구에서 Clitocybin A는 5 μM 이상의 농도에서 platelet-derived growth factor(PDGF) 에의해 유도된 혈관평활근 세포의 증식을 억제함이 밝혀졌다 25) . 즉, Clitocybin A는 세포성장을 억제하지 않는 낮은 농도에서 minoxidil 보다 높은 세포증식 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다( Fig. 1 ). 이러한 결과를 통하여 Clitocybin A가 모유두 세포의 증식을 통해 육모 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다. G0/G1, S및 G2/M phase로의 cell cycle의 진행과정은 포유류 세포 증식의 주요과정이며, 18 - 20) Clitocybin A가 cell cycle의 진행을 유도하는지 알아보기 위해 DNA에 결합하는 형광물질인 PI를 처리하여 유세포분석기로 조사하였다. 그 결과, Clitocybin A 처리군에서 대조군에 비해 sub G1 phase 세포가 감소하였고 G1 phase 세포 및 G2/M phase 세포가 증가함을 확인할 수 있었다( Fig. 2 ). Cell cycle의 진행은 cyclin E/CDK2 complex의 활성화, cyclin D1 증가 및 pRB의 인산화 증가등의 단백질 발현을 동반함이 알려져 있다. 18 - 20) 이러한 cell cycle 진행과 관련된 단백질의 발현이 Fig. 2 의 결과와 일치하게 변화화하는지 알아보기 위해, cyclin D1, cyclin E, phospho-CDK2, CDK2, phospho (ser780)-pRB의 발현을 조사하였다. Fig. 3 에서 보는 바와 같이, 모유두 세포에 24시간 동안 Clitocybin A(0.001, 0.01 및 0.1 μM)를 처리하였을 때, cyclin D1, phospho-CDK2 및 phospho(ser780)-pRB의 발현이 유의하게 증가함을 확인할수 있었다. 그러나 Clitocybin A 처리는 Cyclin E 및 CDK2 의 발현에는 영향을 미치지 않음을 관찰할 수 있었다. Minoxidil를 처리하였을 때도 역시 Clitocybin A와 비슷한 결과를 확인할 수 있었다( Fig. 3 ). Clitocybin A가 모유두세포의 성장 증식을 유도하는 분자적 기전을 밝히기 위해 Wnt/β-catenin 신호 전달 경로에 관하여 조사하였다. Wnt/β-catenin 신호전달 경로는 모발성장, 세포증식 조절등의 과정에서 중요한 역할을 하며, 6 , 10 , 31) PKA, Akt 및 GSK3β 등의 다양한 인자에 의해 조절됨이 알려져 있다. Akt의 활성화는 β-catenin의 인산화(ser552) 및 GSK3β의 인산화(ser9)를 유도하며, PKA는 β-catenin의 인산화(ser552 및 ser675)를 유도하여 세포질 내에서 β-catenin의 분해를 저해하고 안정화를 증가시킨다. 13 , 15 , 32) 그로 인해 β-catenin세포핵으로의 이동이 촉진되고 타겟 유전자의 발현을 조절한다. 13 , 15 , 32) 24시간 동안Clitocybin A를 처리한 경우, phospho(ser552)-β-catenin, phospho(ser675)-β-catenin, phospho(ser9)-GSK3β의 레벨이 유의하게 증가하였다. 이런 결과로 Clitocybin A가 β-catenin 신호전달 경로를 활성화함을 확인할 수 있었다( Fig. 4 ). 또한 양성대조 물질인 minoxidil도 Kwack 등의 연구결과와 비슷하게 phospho(ser552)-β-catenin, phospho (ser675)-β-catenin, phospho(ser9)-GSK3β의 레벨을 증가시키는 것으로 β-catenin 신호전달 경로를 활성화함을 확인하였다. 8) 한편, MAPK 경로 중 하나인 ERK는 성장인자들에 의해 활성화되어 세포 생존 및 성장을 조절하는 것으로 알려져 있으며 33) , ERK의 활성화는 세포주기 단백질 중 하나인 cyclin D1의 발현을 증가시킴이 보고되었다. 34) 특히, minoxidil에 의한 ERK의 활성화는 모유두세포의 apoptosis 저해와 관련됨이 알려져 있다. 9) Fig. 5 에서 보이는 결과와 같이 모유두세포에 Clitocybin A를 처리하였을 때 phosphoERK1/2의 레벨이 증가하는 것으로 ERK1/2의 신호전달을 활성화 시킴을 확인하였다. 위와 같은 연구결과로부터 Clitocybin A가 cyclin D1, phospho-CDK2, phospho-pRB 같은 세포주기 조절 단백질의 레벨을 증가시킬 뿐만 아니라 Wnt/β-catenin 신호전달 경로 및 ERK 신호전달 경로의 활성화를 유도하여 모유두 세포의 증식증가 효능을 나타냄을 알 수 있다. 본 연구에서는 Clitocybin A이 모발의 성장에서 중요한 역할을 하는 모유두 세포에서 cell cycle proteins, Wnt/β-catenin 및 ERK 신호전달 경로의 활성화를 유도하여 모유두세포의 성장증식을 촉진함을 밝혔다. 이와 같은 연구결과는 Clitocybin A가 탈모치료 및 탈모예방에 이용될 수 있는 가능성을 가지고 있다는 근거를 제시하는 것이다.