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The Effects of Bee Venom on Tumor Necrosis Factor (TNF)-<TEX>${\alpha}$</TEX> Induced Inflammatory Human HaCaT Keratinocytes
The Effects of Bee Venom on Tumor Necrosis Factor (TNF)-${\alpha}$ Induced Inflammatory Human HaCaT Keratinocytes
Korean Journal of Pharmacognosy. 2014. Sep, 45(3): 256-261
Copyright © 2014, The Korean Society of Pharmacognosy
  • Received : August 20, 2014
  • Accepted : September 17, 2014
  • Published : September 30, 2014
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About the Authors
우람 이
경현 김
현진 안
정연 김
상미 한
광길 이
관규 박
kkpark@cu.ac.kr

Abstract
Bee venom (BV) therapy has been used as a traditional medicine to treat a variety of conditions, such as arthritis, back pain, cancerous tumors, and skin diseases. However, regulatory effects of BV on tumor necrosis factor (TNF)- α -induced HaCaT cell migration or anti-inflammatory have not been explored. In the present study, we investigated the effects of BV on HaCaT cell migration and anti-inflammation. HaCaT cell migration was evaluated by wound-healing assay. The pro-inflammatory cytokines such as TNF- α , interleukin (IL)-1 β , and IL-8 were examined by ELISA or Western blotting. BV treatment led to an increase in migration of HaCaT cells for 24 and 48 h. Especially, 10 ng/ml of BV were significantly increased HaCaT cell migration. Also, BV suppressed the secretion of TNF- α , IL-1 β , and IL-8 in culture medium with HaCaT cells. In addition, Western blot results demonstrate that BV suppressed the expression of TNF- α and IL-1 β ‚ in HaCaT cells. Especially, 1 or 10 ng/ml of BV markedly decreased the expression of pro-inflammatory cytokines. These results demonstrate the potential of BV for the prevention of skin inflammation induced by TNF- α .
Keywords
재료 및 방법
시험 물질 −본 실험에 사용한 봉독은 농촌진흥청의 국립농업과학원에서 사육 중인 서양종 꿀벌( Apis mellifera )로부터 봉독채집장치(청진테크, 안산, 한국)를 이용하여 봉독을 분리하였고, 불순물을 제거하여 순수 정제 봉독(purified bee venom)을 취하였다. 19) 취한 봉독 추출물은 -20℃에서 보관하고, 투여 직전 멸균 수에 용해시킨 후 필요한 농도로 희석하여 사용하였다.
세포주 및 세포 배양 −본 연구에서는 피부각질형성세포주인 HaCaT 세포를 사용하였다. HaCaT 세포는 일정한 습도와 온도가 유지되는 37℃에서 95% O 2 와 5% CO 2 의 혼합기체를 공급해주면서 초기배양(5×10 5 cells/ml) 농도로 배양하였다. HaCaT 세포는 용기표면에 부착하도록 배양한 후 TNF- α 를 100 ng/ml 농도로 처리하여 인위적 독성의 최적유발 조건을 검토한 다음 순수 정제 봉독을 1, 10, 100 ng/ml 농도로 투여하여 세포의 변화를 확인하였다.
Wound-healing Assay −세포 배양용 6 well plate에 HaCaT 세포를 5×10 5 cells/ml로 배양한 후 PBS로 세척하여 FBS가없는 배지로 overnight 배양하였다. 200 μl Yellow tip을 이용하여 단일 세포층을 긁은 후 PBS로 1번 세척해 주었다. 그 후 봉독을 농도 별로(1, 10, 100 ng/ml) 처리하여 24, 48시간 CO 2 배양기에서 배양하였다. 세포이동성 평가는 24, 48 각 시간 마다 현미경을 통해 사진 촬영하였고 긁혀진 면적을 측정하였다. 이때, 0시간은 세포를 긁은 직후를 말한다. 면적 측정은 촬영 된 사진의 긁혀진 면적을 측정하여 24, 48시간 동안의 이동 거리를 측정하였다.
TNF-α, IL-1β와 IL-8의 발현 측정 −봉독이 HaCaT 세포의 TNF- α , IL-1 β 와 IL-8의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit(R&D, MN, USA)를 이용하여 측정하였다. TNF- α , IL-1 β 와 IL-8의 일차항체와 이차항체를 순서대로 반응시키고 3,3',5,5'-tetramethyl benzidine을 첨가하여 발색시킨 다음 ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, TNF- α , IL-1 β 와 IL-8 표준용액을 이용한 그래프로부터 시료의 농도를 환산하였다.
단백질 분리와 Western Blot 분석 −분리한 HaCaT 세포를 60 mm 배양 dish에 5×10 5 cells/ml이 되도록 분주하여 부착시킨 다음, 봉독과 TNF- α 를 함께 처리하여 8시간 배양하였다. 배양된 세포를 회수하여 IPH lysis buffer(50 mM pH 8.0 Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 100 mM PMSF, 1 mg/ml leupeptin, 1 mg/ml aprotinin and 1 M DTT)를 첨가한 후 4℃에서 15분간 lysis시키고, 12,000 rpm에서 30분 동안 원심 분리 후 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질을 Bradford법(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)으로 정량 하였으며, 정량한 단백질은 SDS-PAGE로 전기영동하고 PVDF membrane(Milipore, MA, USA)에 옮겼다. Membrane은 일차 항체 항IL-1 β (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)와 항TNF- α (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 와 반응시키고 TBS-T로 15분간 2회 세척 후 membrane을 2차 항체로 2시간 반응시켰다. 항체들에 대한 발현 분석은 horseradish peroxidase-linked(HRP) 이차항체에 의해 발현되는 enhanced chemiluminescence(ECL) Western Blot Analysis(Amersham, NJ, USA)시스템을 이용하였으며 X-ray 필름에 현상한 후 Science Lab 2005(Fujifilm, Japan)를 이용하여 비교 분석 하였다.
통계처리 −실험의 분석결과는 각각의 군별로 평균과 표준편차(mean±S.D.)를 사용하여 표기하였으며, 모든 자료는 SPSS 프로그램(Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., IL, USA)을 이용하여 처리하였고, 반복측정에 의한 ANOVA test를 적용하여 유의도 수준 p <0.05에서 확인하였다.
결과 및 고찰
봉독이 HaCaT 세포의 이동에 미치는 영향 −피부의 각질형성세포는 면역 및 염증 반응과 세포 증식에 관여하는 다양한 cytokine 및 성장 인자를 생산 함으로서, 피부의 항상성 유지에 중요한 역할을 수행한다. 19) 본 연구에서는 봉독이 피부각질형성세포의 이동 능력에 어떠한 영향을 미치는가에 대하여 알아보고자 Wound-healing assay를 실시하였다. 단층으로 균일하게 자란 HaCaT 세포에 멸균 Tip으로 긁은 후 실선 안의 세포를 모두 제거하였다. 그 후, 24시간 동안 배양하여 세포가 제거된 실선 안의 영역으로 세포가 이주되는 정도를 실험 군 별로 비교 관찰하였다. 그 결과, 아무런 물질도 처리하지 않은 세포는 Tip으로 긁은 직 후의 세포와 비교해 약간의 이동능력을 관찰할 수 있었다(Fig. A, B). 이에 반해, 봉독을 농도 별로 처리한 세포에서는 세포이동이 증가하는 현상을 관찰할 수 있었다. 특히, 10 ng/ml의 봉독을 처리한 세포에서 가장 많은 세포 이동능력을 관찰 할 수 있었다( Fig. 1 C-E). 또한, 같은 방법으로 봉독을 48시간 처리하였을 때에도 유사한 결과를 관찰할 수 있었다( Fig. 2 ). 이러한 결과를 미루어 볼 때 봉독은 HaCaT 세포의 이동 능력을 증가시키는데 효과가 있는 것으로 사료되고 특히, 10 ng/ml농도의 봉독이 다른 농도보다 더 효과가 있는 것으로 확인되었다. 100 ng/ml농도의 봉독은 10 ng/ml의 봉독보다 세포독성이 있어 효과가 떨어지는 것으로 사료된다.
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Effects of bee venom (BV) on migration of HaCaT cells. HaCaT cells were scratched using 200 μl sterile pipette tip. Migration levels of HaCaT cells were observed using the optical microscope and photographs were obtained. HaCaT cells were treated with different concentrations of BV (1, 10, 100 ng/ml) for 24 h. BV treatment led to an increase in migration of HaCaT cells. Especially, 10 ng/ml of BV were significantly increased the HaCaT cells migration. (A) None treatment cell (0 h), (B) None treatment cell (24 h), (C) 1 ng/ml of BV treatment cell (24 h), (D) 10 ng/ml of BV treatment cell (24 h), (E) 100 ng/ml of BV treatment cell (24 h). Data were expressed as means±S.D. *p<0.05 compared to the A group, p<0.05 compared to the B group.
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Effects of bee venom (BV) on migration of HaCaT cells. HaCaT cells were scratched using 200 μl sterile pipette tip. Migration levels of HaCaT cells were observed using the optical microscope and photographs were obtained. HaCaT cells were treated with different concentrations of BV (1, 10, 100 ng/ml) for 48 h. BV treatment led to an increase in migration of HaCaT cells. Especially, 10 ng/ml of BV were significantly increased the HaCaT cells migration. (A) None treatment cell (0 h), (B) None treatment cell (48 h), (C) 1 ng/ml of BV treatment cell (48 h), (D) 10 ng/ml of BV treatment cell (48 h), (E) 100 ng/ml of BV treatment cell (48 h). Data were expressed as means±S.D. *p<0.05 compared to the A group, p<0.05 compared to the B group.
봉독이 TNF-α, IL-1β와 IL-8의 발현에 미치는 영향 − TNF- α 와 IL-1 β 는 대표적인 염증성 cytokine으로서 발현양이 증가하면 염증성 피부질환을 심화시키는 것으로 알려져있다. 21 , 22) 종양괴사인자인 TNF- α 는 많은 염증반응에서 가장 중추적 역할을 하는 중요인자로서 대식세포나 림프구 등 백혈구에 의해 생성된다. 이는 정상 상태에서는 생성되지 않으나, 다양한 요인에 의해 세포가 자극을 받으면 합성되어 분비 되는 것으로 알려져 있다. 23 , 24) IL-1 β 는 급성 혹은 만성 염증반응의 초기반응에 관여하여 염증의 발생 및 진행 과정에서 중요한 역할을 한다. 또한, IL-8은 CXC chemokine으로서 백혈구의 탈 과립을 유도하여 염증세포들이 자극부위로 모여들게 하여 염증반응을 촉진시키는 기능을 한다. 25) 따라서 TNF- α , IL-1 β 와 IL-8의 합성 조절은 염증성 질환에서 중요한 역할을 한다. 26 , 27) 본 연구에서는 ELISA실험을 통해 TNF- α , IL-1 β 와 IL-8의 발현양을 관찰하였다. TNF- α (100 ng/ml)를 8시간 동안 단독 처리한 세포에서는 TNF- α , IL-1 β 와 IL-8의 발현양이 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군에 비해 현저히 증가하는 현상을 관찰할 수 있었다. 반면, 봉독을 함께 처리한 세포에서는 TNF- α , IL-1 β 와 IL-8의 발현양이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 특히, 10 ng/ml 농도의 봉독이 다른 농도 보다 더 효과가 있는 것을 관찰할 수 있었다. 한 등의 28) 연구에 따르면 human dermal fibroblast에서 적정 농도 이상의 봉독은 세포 독성을 보이는 것을 보고한 바 있다. 따라서 본 연구에서도 100 ng/ml농도의 봉독은 세포독성으로 인해 효과가 떨어지는 것으로 사료된다. 이러한 결과는 TNF- α 는 HaCaT 세포에서 염증반응을 유도하는 것으로 여겨지며, 적절한 농도의 봉독은 대표적 염증성 cytokine인 TNF- α 와 IL-1 β 의 발현양을 억제 함으로서 염증성 피부질환을 완화시킬 수 있을 것으로 생각된다.
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Effect of bee venom (BV) on TNF-α-induced HaCaT cells. The HaCaT cells were cultured with presence or absence of BV for 8 h, followed by TNF-α treatment. The ELISA results demonstrate that BV suppressed the secretion of TNF-α (A), IL-1β (B), and IL-8 (C) in culture medium with HaCaT cells. Especially, 10 ng/ml of BV were significantly suppressed TNF-α, IL-1β, and IL-8 secretion. Data were expressed as means±S.D. *p<0.05 compared to the normal control, p<0.05 compared to the only TNF-α treatment cells.
봉독이 염증성 Cytokines 발현에 미치는 영향 −우리는 선행연구를 통해 봉독은 여드름 유발균인 Propionibacterium acnes 의 활성과 염증반응을 억제시킴으로써 염증성 여드름에 대한 치료 효과를 증명한 바 있다. 15) 특히, 봉독은 염증이 유발된 동물모델에서 대표적 염증성 cytokine인 TNF- α 와 IL-1 β 의 발현을 조절 함으로서 염증반응을 억제하였다. 따라서 본 연구에서는 각질형성세포에서 TNF- α 와 IL-1 β 의 발현변화를 Western blot을 통해 관찰하였다. TNF- α (100 ng/ml)를 8시간 동안 단독 처리한 세포에서는 TNF- α 와 IL-1 β 발현양이 크게 증가하는 모습을 확인할 수 있었다. 이에 반해, 봉독을 함께 처리한 HaCaT 세포에서는 1 또는 10 ng/ml의 농도에서 TNF- α 와 IL-1 β 발현양이 현저히 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 이는, ELISA 실험 결과와 유사한 결과로서 봉독은 염증이 유도된 동물모델뿐만 아니라 염증성 세포모델에서도 염증억제 효과가 있는 것으로 생각된다.
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Bee venom (BV) effectively inhibits pro-inflammatory cytokines in TNF-α-induced HaCaT cells. The HaCaT cells were cultured with presence or absence of BV for 8 h, followed by TNF-α treatment. Western blot result demonstrate that BV suppressed the expression of TNF-α (A) and IL-1β (B) in HaCaT cells. Especially, 1 or 10 ng/ml of BV markedly decreased the expression of pro-inflammatory cytokines. Data were expressed as means±S.D. *p<0.05 compared to the normal control, p<0.05 compared to the only TNF-α treatment cells.
결 론
봉독에 대한 연구는 항염증 및 항균효과와 관련하여 다양한 질환에서 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 염증성 피부질환에 봉독이 미치는 영향에 관한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 TNF- α (100 ng/ml)를 처리한 인간각질형성세포주인 HaCaT 세포에서 봉독이 세포 이동에 미치는 영향과 항염증 효과를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. 봉독은 HaCaT 세포의 이동 능력을 증가시키는데 효과가 있는 것을 wound-healing assay를 통해 관찰하였다. 특히, 10 ng/ml농도의 봉독을 처리하였을 때 가장 효과가 있는 것을 확인하였다.
2. TNF- α 를 8시간 동안 단독 처리하였을 때 TNF- α , IL-1 β 와 IL-8의 발현이 정상 대조군에 비해 현저히 증가하였고, 이러한 결과로 TNF- α 가 HaCaT 세포의 염증을 유도하는 것을 확인하였다.
3. 적절한 농도의 봉독은 염증이 유도된 HaCaT 세포에서 대표적 염증성 cytokines인 TNF- α 와 IL-1 β 의 발현을 억제하였다. 또한, chemokine중의 하나인 IL-8의 발현을 조절하는 것을 분자생물학적 실험 기법을 통해 확인하였다.
봉독은 피부각질세포의 이주능력을 증가시켰고 대표적인 염증유발 인자인 TNF- α 와 IL-1 β 의 활성을 억제함으로써 염증반응에 효과가 뛰어난 것으로 사료된다. 또한, 천연물인 봉독은 약리효과가 뛰어나며 부작용이 적어 염증성 피부질환 예방물질로서의 개발 가능성이 있다고 생각되며, 궁극적으로 피부건강에 있어 선제적 예방 차원의 근거자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
Acknowledgements
본 논문은 농촌진흥청 차세대바이오그린21사업(과제번:PJ009519)의 지원에 의해 이루어진 것임.
References
Athar M. (2002) Oxidative stress and experimental carcinogenesis. Indian J. Exp. Biol. 40 656 - 667
Kim N. , Koo B. , Lee S. , Hwang E. , So S. , Do J. (2007) Effect of Korean red ginseng on collagen biosynthesis and MMP-I activity in human dermal fibroblast. J. Ginseng. Res. 31 86 - 92    DOI : 10.5142/JGR.2007.31.2.086
Beissert S. , Cavazzana I. , Mascia F. , Meroni P. , Pastore S. , Tessari G. , Girolomoni G. (2006) Mechanisms of immune-mediated skin diseases: an overview. Clin. Exp. Rheumatol. 24 S1 - 6
Maas-Szabowski N. , Shimotoyodome A. , Fusenig N. E. (1999) Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism J. Cell. Sci. 112 1843 - 53
Han Y. P. , Tuan T. L. , Wu H. , Hughes M. , Garner W. L. (2001) TNF-alpha stimulates activation of pro-MMP2 in human skin through NF-(kappa)B mediated induction of MT1-MMP. J. Cell. Sci. 114 131 - 139
Shinozaki M. , Kawara S. , Hayashi N. , Kakinuma T. , Igarashi A. , Takehara K. (1997) Induction of subcutaneous tissue fibrosis in newborn mice by transforming growth factor beta-simultaneous application with basic fibroblast growth factor causes persistent fibrosis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 237 292 - 296    DOI : 10.1006/bbrc.1997.7134
Eisinger M. , Sadan S. , Silver I. A. , Flick R. B. (1988) Growth regulation of skin cells by epidermal cell-derived factors: implications for wound healing. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 85 1937 - 1941    DOI : 10.1073/pnas.85.6.1937
Kwon D. J. , Bae Y. S. , Ju S. M. , Goh A. R. , Choi S. Y. , Park J. (2011) Casuarinin suppresses TNF-α-induced ICAM-1 expression via blockade of NF-κB activation in HaCaT cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 409 780 - 785    DOI : 10.1016/j.bbrc.2011.05.088
Seo W. S. , Oh H. N. , Park W. J. , Um S. Y. , Kang S. M. (2014) Study for Possibility of N,N,N-Trimethylphytosphingosine (TMP) for Management of Chronic Skin Diseases. KSBB. Journal 29 36 - 41    DOI : 10.7841/ksbbj.2014.29.1.36
Gates T. (2007) Atopic dermatitis: diagnosis, treatment, and aeromedical inplications. Aviat. Space. Environ. Med. 78 29 - 37
Wüthrich B. , Cozzio A. , Roll A. , Senti G. , Kündig T. , Schmid-Grendelmeier P. (2007) Atopic eczema: genetics or environment? Ann. Agric. Environ. Med. 14 195 - 201
Son D. J. , Lee J. W. , Lee Y. H. , Song H. S. , Lee C. L. , Hong J. T. (2007) Therapeutic application of anti-arthritis, pain-releasing, and anti-cancer effect of bee venom and its constituent compounds. Phaemacol. Ther. 115 246 - 270    DOI : 10.1016/j.pharmthera.2007.04.004
Habermann E. (1971) Chemistry, pharmacology and toxicology of bee, wasp and hornet venoms. In Venomous Animals and their Venoms. Academic Press 3 - 61
Assem E. S. , Atkinson G. (1973) Histamine release by MCDP (401), a peptide from the venom of the honey bee. Birt. Phamacol. 337 - 338
Lee W. R. , Park J. H. , Kim K. H. , An H. J. , Han S. M. , Park. K. K. (2011) Effects of bee venom on propionibacterium acnes-induced inflammatory skin disease in mice. Kor. J. Pharmacign. 42 366 - 370
Han S. M. , Han C. S. (2012) The effect of cosmetic included purified bee venom on the improvement of acne. J. Kor. Soc. Cosm. 18 391 - 396
Dunn J. D. , Killion J. J. (1988) Effect of melittin on pituitary adrenal responsiveness to stress. Acta. Endorinol. 119 339 - 344
Rudenko S. V. , Nipot E. E. (1996) Modulation of melittin-induced hemolysis of erythrecytes. Biokhimiia. 61 2116 - 2124
Han S. M. , Lee K. G. , Yeo. J. H , Kweon H. Y , Woo S. O. , Lee I. K. , Lee M. L. , Lee M. Y. , Baek H. H. , Bae K. H. (2005) Studies on the antimicrobial effect of collected bee venom using electric shock method (I). Korean J. Apiculture 20 53 - 58
Ryou J. H. , Lim T. W. , Park J. K. , Kim N. I. (2001) The effect of nerve growth factor on cell proliferation and expression of its receptors in cultured human keratinocytes. Korean Journal of Dermatology 39 161 - 167
Nathan C. F. (1987) Secretory products of macrophages. J. Clin. Invest. 79 319 - 326    DOI : 10.1172/JCI112815
Salvemini D. , Korbut R. , Anggard E. , Vane J. (1990) Imminediate release of a nitric oxide-like factor from bonine aortic endothelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 6007 - 6015    DOI : 10.1073/pnas.87.7.2593
Lin J. H. , Rogers P. A. M. (1980) Acupuncture effects on the body's defense systems. A veterinary Review. Vet. Bulle. 50 633 - 640
Djeu J. Y. , Blanchard D. L. , Richards A. L. , Fridman H. (1988) Tumor mecrosis factor induction by Candida albicans from human antural killer cells and monocytes. J. Immunol. 141 4047 - 4057
Bordon Y. (2010) Cytokines: Cytokines reach out. Nat. Rev. Immunol. 10 382 -    DOI : 10.1038/nri2791
Tracey K. J. , Wei H. , Manogue K. R. , Fong Y. , Hesse D. G. , Nguyen H. T. (1988) Cachecin/tumor necrosis factor induces cachexia, anemia and inflammation. J. Exp. Med. 167 1211 - 1227    DOI : 10.1084/jem.167.3.1211
Beutler B. , Cerami A. (1989) The biology of cachectin/TNF-α a promary mediator of the host response. Annu. Rev. Immunol. 7 625 - 655    DOI : 10.1146/annurev.iy.07.040189.003205
Han S. M. , Lee K. G. , Yeo. J. H , Kim W. T. , Park K. K. (2009) Antimicrobial property of honeybee (Apis mellifera L.) venom against Propionibacterium acnes and aerobic skin flora. Kor. J. Pharmacign. 40 173 - 177