We evaluated the benign prostatic hyperplasia (BPH) with Yacon pill, the preparation composed of Smallanthus sonchifolius , Torilis japonica and Acorus gramineus . A total of 45 rats were divided into five groups. One group was used as a control and the other groups received subcutaneous injections of testosterone for 4 weeks to induce BPH. Yacon pill extract (200 or 400 mg/kg) was administered daily for 4 weeks to two groups by oral gavage concurrently with testosterone. The rats euthanized, the prostate and body weights were recorded, and tissues were subjected to hormone assay. In addition, we investigated proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression in the prostate using immunoblotting. Rats with BPH showed significantly increased prostate weights, increased dihydrotestosterone (DHT) levels in the serum and increased PCNA expression in the prostate; however, Yacon pill extracts treated rats showed significant reduction of prostate weights, DHT levels and PCNA expression compared with the BPH group. Conclusively, Yacon pill showed the possibility as ameliorable agents of BPH symptoms. 실험에 사용한 야콘환(Yacon pill)의 처방 구성은 Table I 과 같다. 구성 약재 중 야콘은 2012년 옥천의 온당야콘에서 재배한 것을 구입하여 사용하였으며, 사상자 및 석창포는 2012년 경신제약 및 서강무역에서 각각 수입한 제품을 서울의 푸른약업사로부터 구입하여 사용하였으며, 제품표본은 충북대학교 약학대학 약제학연구실에 보관하고 있다. 표준액의 조제 −야콘환 구성성분인 chlorogenic acid 표준물질은 50% 메탄올에 녹여 4.0~20.0 μg/ml로, asarone 표준물질은 70% 메탄올에 녹여 0.4~2.0 μg/ml로, torilin 표준물질은 100% 메탄올에 녹여 0.02~5.00 μg/ml로 한 것을 표준액으로 사용하였다. 검액의 조제 −아래의 동물실험에서 사용한 방법과 같은 방법으로 제조한 동결건조한 야콘환추출물 약 0.5 g을 정확히 취하여 50% 메탄올을 넣어 20 ml로 맞춘 후 10분간 초음파 추출하여 chlorogenic acid 검액으로 하였으며, 추출물 약 1 g을 정확히 취하여 70% 메탄올을 넣어 20 ml로 맞춘 후 10분간 초음파 추출하여 asarone 검액으로 하였고, 추출물 0.5 g을 70% 에탄올로 1시간 환류추출 한 후 증발건고 후 100% 메탄올에 녹여 10 ml로 하여 torilin 검액으로 하였다. 각 표준액 및 검액은 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 분석에 사용하였다. HPLC에 의한 야콘환 중 야콘, 석창포, 사상자 지표 성분의 정량 −야콘의 지표 성분은 chlorogenic acid(Aldrich, USA), 석창포의 지표성분은 asarone(Aldrich, USA)을 구입하여 사용하였으며, 사상자의 지표성분은 KT&G 중앙연구원에서 추출 및 분리한 torilin을 분양받아 사용하였다. 14) HPLC는 Waters사(Milford, MA, USA)의 Alliance 2695 Separations Module, 2998 Photodiode Array Detector를 사용하였으며, 컬럼은 C ₁₈ column(Shiseido, 5 μm, 250×4.6 mm)을 사용하였다. 각 성분의 분석조건으로 chlorogenic acid는 용매를 CH ₃ CN과 0.2% 인산수용액 혼합액(11.5:88.5 v/v)을 pH 3.0으로 조정한 후 사용하였으며, 유속은 1.0 ml/min, 시료 주입량은 10 μl, 파장은 UV 327 nm이었다. 15 , 16) Asarone은 70% methanol을 사용하였으며, 유속은 1.0 ml/min, 시료 주입량은 20 μl, 파장은 UV 260 nm이었다. 17 - 19) Torilin은 65% methanol을 사용하였으며, 유속은 1.0 ml/min, 시료 주입량은 20 μl, 파장은 UV 230 nm이었다. 14) 시약 −본 실험에 사용한 테스토스테론은 Jenasterone®(Jenahexal pharma GmbH, Germany)을 사용하였으며, 양성대조약으로 finasteride(한올제약, Korea)를 사용하였다. 실험동물 −실험동물은 평균 체중이 350∼360 g인 12주령의 수컷 S.D. rat을 샘타코(경기도)에서 구입하여 5일간의 순화기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 사육실 및 실험실의 환경은 온도 23±2℃, 상대습도 55±10%, 조명주기 12시간(07:00-19:00), 조도 150-300 lux로 조절하였다. 식이는 rat용 고형사료를, 물은 정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 연구에서의 모든 동물실험은 충북대학교 실험동물센터 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 하(CBNUA-702-14-01)에 동센터의 표준작업순서(Standard Operation Procedures, SOP) 및 1989년 미국독성학회(Society of Toxicology, SOT)에서 채택한 “Guide Principles in the Use of Animals in Toxicology”에 따라 수행되었다. 야콘환 추출물의 제조 −야콘환의 구성 약재인 야콘, 사상자 및 석창포 2:1:1 혼합물 100 g에 증류수 1 L를 가하여 열탕 추출기에서 3시간 추출하여 얻은 추출액을 여과한 후 이를 회전식감압증류기(EYELA, Japan)로 농축하고, 동결건조기(EYELA FD-5N, Japan)를 사용하여 건조하였다. 이를 실험동물에 투여할 때 필요한 농도로 희석하여 사용하였다. 전립선비대 실험동물 모델의 제작 −본 연구의 실험군은 정상대조군(normal control group), 전립선비대 유발군(Benign Prostate Hypertrophy, BPH group), 양성대조군인 finasteride 투여군(positive control group) 및 야콘환추출물 투여군(200 mg/kg, 400 mg/kg) 등 5군으로 나누어 진행하였고, 각 군당 9마리씩을 배정하였다. 숫컷 흰쥐에 전립선비대의 유발방법은 Shin 등 20) 의 방법을 사용하였다. 즉, 처음 30일 동안 정상군은 기제로 사용한 올리브오일을 피하주사 하였으며, BPH 유발군, 양성대조군 및 야콘환추출물 투여군(200 mg/kg, 400 mg/kg) 모두에게 테스토스테론(3 mg/kg)을 피하주사 하여 전립선비대를 유발하였다. 이후 다시 30일 간 BPH 유발군, 양성대조군 및 야콘환추출물 투여군 (200 mg/kg, 400 mg/kg) 모두에게 테스토스테론(3 mg/kg)을 피하주사 하여 유발된 전립선비대가 지속적으로 유지되도록 하였다. 테스토스테론 피하주사(정상대조군은 올리브오일만 주사함)와 함께 정상대조군 및 BPH 유발군은 정제수를 경구투여 하였으며, 양성대조군에는 finasteride를 10 mg/kg 용량으로 경구투여 하였고, 야콘환 추출물 투여군은 야콘환추출물을 각각 200 mg/kg 및 400 mg/kg 용량으로 경구투여 하였다. 혈액 채취 및 전립선 중량 측정 −마지막 투여 후 20~24시간 절식 시킨 동물을 에테르 마취하에, 복대정맥에서 채혈하여 얻은 혈액을 혈청분리용 원심분리관(SST-tube, BD vaccutainer, USA)에 넣어 실온에 30분간 방치하여 응고시킨 다음, 원심분리(3,000 rpm×15 min)해서 혈청을 채취하였다. 전립선은 채혈 후 수술로 절제하여 그 중량을 측정하였다. ELISA에 의한 혈액 중 DHT 농도의 측정 −혈액 중 DHT 농도는 상기에서 채취한 혈액 중 일부를 취하여 ELISA(enzyme-linked immunoassay) kit(ALPCO Diagnostics, Salem, NH, USA)를 이용하여 사용자 지시에 따라 측정하였다. ELISA reader(Bio-Rad Laboratories, Inc.)의 흡광도는 450 nm에서 측정하였다. 흰쥐 전립선 조직에 대한 Western Blot −상기에서 채취한 전립선을 액체질소에 넣어 급속냉동 후 -70℃의 냉동고에 보관하였던 전립선 조직을 녹여 homogenizer로 잘게 분쇄한 후 protease inhibitor(1mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptine 및 1 μg/ml aprotinin)를 함유한 RIPA 완충액(20 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% sodium deoxycholate, 1% Nonidet P-40 및 1% SDS)에 현탁 시키고, 용해액을 취하여 western blot을 하였다. 즉, 일정량의 단백질을 SDS-gel loading buffer와 혼합하여 SDSacrylamide gel에서 electrophoresis를 하였다. 단백질을 PVDF membrane으로 이동 시키고 5% skim-milk를 함유한 Tris-buffered saline으로 blocking한 후 membrane에 anti-PCNA 또는 GAPDH와 반응시킨 후 enhanced chemiluminescence 시약으로 반응시켜 각각의 band를 동정하였다. 야콘환 추출물의 흰쥐 혈액의 생화학적 변화에 미치는 영향 −일반 혈액의 생화학적 분석은 생화학자동분석기(Hitachi 747, Hitachi Medical Co., Japan)를 이용하여 측정하였다. 모든 실험결과들은 평균±표준편차로 나타내었고 통계처리는 SigmaStat을 이용하여 one-way ANOVA test를 실시하여 하였으며, *, p <0.05를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다. 검량선 − HPLC를 이용하여 3종 성분의 농도에 따른 피크면적을 이용하여 검량선을 작성한 결과 상관계수( r ² ) 값이 0.999 이상으로 양호한 직선성을 나타내었다. 또한 검출한계와 정량한계는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법에 따라 측정하였는데 chlorogenic acid은 0.19 μg/ml, 0.64 μg/ml이었으며, asarone은 0.01 μg/ml, 0.03 μg/ml이었고, torilin은 0.136 μg/ml, 0.453 μg/ml로 각각 나타났다( Table II ). 야콘환 추출물 중 야콘, 석창포, 사상자 지표 성분의 정량 −야콘, 석창포, 사상자의 구성성분 중의 하나인 chlorogenic acid, asarone 및 torilin의 크로마토그램을 Fig. 1 에 각각 나타내었다. 또한 야콘환 추출물 중 chlorogenic acid의 함량은 118.28 μg/g이었으며, 석창포 및 사상자 중 asarone 및 torilin의 함량은 각각 13.73 μg/g, 47.74 μg/g이었다. 따라서 상기와 같은 이들 지표성분의 분석방법 확립 및 함량 분석결과는 향후 야콘환 제제의 품질관리 기준으로 이용할 수 있을 것으로 생각된다. Table III 은 30일 간 흰쥐에 testosterone 3 mg/kg을 피하주사 하여 전립선비대를 유발한 후, 양성대조군으로 finasteride 10 mg/kg, 야콘환추출물 200 mg/kg 또는 400 mg/kg을 30일 간 투여한 후 체중 및 전립선무게를 측정하여 정상군 및 전립선비대 유발 양성대조군과의 전립선무게를 비교한 것이다. 전립선비대를 유발하기 위해 testosterone을 투여한 흰쥐는 투여 2주후부터 정상대조군에 비해 몸무게가 감소하기 시작하였으며, 최종 몸무게는 약 20% 정도 감소하는 것으로 나타났다. 반면에 전립선 무게는 양성대조군의 경우 정상군에 비해 2배 이상 증가하는 것으로 나타났다. 한편 양성대조약인 finasteride 투여군의 경우 전립선 무게가 양성대조군에 비해 31.43% 유의성 있게 감소한 것으로 나타났으며, 야콘환 투여의 경우 200 mg/kg 및 400 mg/kg 투여의 경우 모두 28.57% 유의성 있게 감소한 것으로 나타났다. 저해율은 다음식에 따라 산출 하였다. % of inhibition = BPH group − treated group/BPH group − normal group × 100 야콘환 추출물의 혈중 DHT 농도에 미치는 영향 − BPH군의 혈액내 DHT 농도는 정상대조군보다 현저하게 높은 것으로 나타나 전립선비대가 양호하게 이루어진 것으로 나타났다. 양성대조약으로 사용한 finasteride로 처치한 군의 DHT 치는 BPH군에 비해 유의성 있게 더 낮은 것으로 나타났다. 또한, 야콘환을 투여한 군의 혈액내 DHT 농도는 200 mg/kg 및 400 mg/kg 투여군 모두에서 BPH군에 비해 유의성 있게 더 낮은 것으로 나타났다( Fig. 2 ). 흰쥐 전립선 조직에 대한 Western Blot −흰쥐의 전립선조직에 대한 Western blot 결과 대조군은 정상군에 비해 PCNA가 현저히 증가된 결과를 나타내었으며, 양성대조군인 finasteride 또는 야콘환투여군은 PCNA가 현저히 감소된 결과를 나타내었다. 이는 ELISA를 이용하여 전립선비대를 유발하는 물질로 알려진 혈액 중 DHT 농도측정 실험에서 finasteride 또는 야콘환 추출물 투여가 DHT 생성을 억제하는 효과를 나타낸 결과와 일치하는 것으로 나타났다( Fig. 3 ). 야콘환 추출물의 흰쥐의 간 및 신장대사에 미치는 영향 − 흰쥐에 Testosterone 3 mg/kg을 s.c로 투여하여 전립선비대를 유발했을 때 BPH 유발군의 경우 TG가 약간 감소하는 것으로 나타났는 데, 이것은 기제로 올리브오일을 사용하여 정상대조군의 TG가 올라갔기 때문으로 생각된다( Table IV ). 실제 무투여군의 경우 TG는 정상대조군에 비해 더 낮은 21.25±9.55로 나타났으며(데이터 나타내지 않음), 테스토스테론으로 전립선비대를 유발한 모든 군에서 TG는 정상대조군에 비해 감소한 것으로 나타났다. 이와같은 결과는 테스토스테론이 지방대사를 촉진한 결과로 생각된다. 21) 한편 야콘환 400 mg/kg 투여의 경우 기제만을 투여한 정상대조군 및 BPH 유발군과 비교 시 AST 및 CRE이 감소한 것으로 나타나 야콘환은 간 및 신장대사를 촉진하는 것으로 생각된다. 본 연구결과를 요약하면 인위적으로 전립선비대를 유발한 흰쥐에 야콘, 사상자, 석창포로 구성된 야콘환추출물을 투여 했을 때 혈중 DHT( Fig. 2 )와 전립선 무게가 감소된 결과( Table III )를 나타내었다. 따라서 야콘환은 시판 전립선비대 치료제로 사용되고 있는 finasteride의 단점인 정액감소, 성욕감퇴 및 성기능 억제 등의 부작용이 경감된 전립선비대 개선제로의 개발 가능성을 나타내었다.