The anti-melanogenic substance was isolated from the root of Angelica gigas Nakai by silica gel column chromatography, preparative HPLC and TLC. As a result of the structure analysis by mass, ¹ H-NMR, and ¹³ C-NMR spectrometry, the compound was identified as demethylsuberosin. Demethylsuberosin reduced melanin contents of B16F1 melanoma cells in a dose-dependent manner and decreased to about 74% at a concentration 5 μg/ml. Demethylsuberosin inhibited the expression in microphthalmia associated transcription factor (MITF), tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1), and tyrosinase related protein-2 (TRP-2) in melanocytes. These results suggest that the whitening activity of demethylsuberosin may be due to the inhibition of the melanin synthesis by down-regulation of MITF, tyrosinase, TRP-1 and TRP-2 expression. Thus, our results provide evidence that demethylsuberosin might be useful as a potential skin-whitening agent. 실험 재료 −본 실험에서 사용한 참당귀( Angelica gigas NaKai)는 한국 경북에서 재배한 생약을 옴니허브에서 구입하여, 형태학적 평가를 통하여 동정하였다. 참당귀 표본(KOR070)은 한국콜마 소재연구소 BIO소재개발팀 표본실에 보관하였다. 시약 및 기기 −참당귀로부터 유효성분의 분리와 정제를 위해 silica gel column chromatography(silica gel 60, Merck, 230~400 mesh)를 실시하였다. TLC 분석에는 Silica gel 60 F254(precoated, Merck)를 사용하고 이때 detection reagent로는 10% H ₂ SO ₄ 용액을 사용하였다. 참당귀로부터 분리한 화합물들의 구조 동정을 위한 NMR 측정에는 JEOL ECA-500을 사용하였으며, CDCl ₃ 를 용매로 사용하였고, 내부 표준물질로 사용한 tetramethylsilane(TMS)를 기준으로 δ(ppm)으로 나타내었다. Neutral red는 Sigma(USA), Dulbeco's modified Eagle's medium(DMEM)은 Thermo scientific(USA), fetal bovine serum(FBS)과 Antibiotic-Antimyotic(100X)은 Gibco(USA) 제품을 사용하였다. Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, β -actin 항체는 Santacruze Biotechnology(USA)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 기기는 microplate reader(Bio-rad, USA)와 Chemi-Doc(ATTO, Japan)을 사용하였다. 추출 및 분리 −참당귀 뿌리 500 g을 잘게 분쇄한 후에 2 L의 MeOH을 가하여 항온조에서 3시간 동안 2회에 걸쳐 환류 냉각하여 추출하고, 여과 및 감압 농축하여 참당귀추출물 150 g을 수득하였다. 참당귀추출물은 증류수에 용해시키고 동량의 Et ₂ O를 가하여 3회에 걸쳐 용매 분배한 후 Et ₂ O 층 45 g을 얻었다. Et ₂ O 분획물 30 g을 silica gel column chromatography(이동상; n -hexane:EtOAc=20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 2.5:1, 0:1, v/v)를 실시하여 10개의 subfraction(Fr. 1-10)으로 나누었다. Fr. 7을 medium pressure liquid chromatography(이동상; n -hexane:EtOAc=8:1, 7:1, 6:1, v/v) 및 prep. TLC(CHCl ₃ : n -hexane:EtOAc=5:5:2)를 반복 실시하여 화합물 1 (170 mg)을 순수하게 분리하였다. 화합물 1 − Light yellow gum, ¹ H-NMR(CDCl ₃ , 500 MHz) δ: 1.74 (3H, s, Me-4'), 1.77 (3H, s, Me-5'), 3.36 (2H, d, J = 7.2 Hz, H-1'), 5.29 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-2'), 6.21 (1H, d, J = 9.5 Hz, H-3), 6.89 (1H, s, H-8), 7.17 (1H, s, H-5), 7.61 (1H, d, J = 9.5 Hz, H-4); ¹³ C-NMR (CDCl ₃ , 125 MHz) δ: 17.9 (C-5), 25.8 (C-4), 28.7 (C-1), 103.3 (C-8), 112.4 (C-10), 112.6 (C-3), 120.9 (C-2), 125.3 (C-6), 128.4 (C-5), 135.4 (C-3), 143.9 (C-4), 154.2 (C-9), 158.3 (C-2), 162.0 (C-7). 세포주의 배양 − ATCC에서 구매한 mouse melanoma (B16F1) 세포를 10% fetal bovine serum(FBS), 5% antibiotic-antimyotic을 첨가한 Dulbeco's modified Eagle's medium(DMEM)으로 배양기에서 37℃, 5% CO ₂ 조건으로 배양하였다. 세포독성 측정 −본 실험에서 mouse melanoma 세포에 대한 시료의 유효농도를 결정하기 위해 세포독성측정(NRU assay)을 진행하였다. B16F1 세포를 10% fetal bovine serum(FBS), 5% antibiotic-antimyotic을 첨가한 Dulbeco's modified Eagle's medium(DMEM)으로 배양기에서 37℃, 5% CO ₂ 조건으로 배양한다. 배양된 mouse melanoma 세포를 96 well plate에 각각 5×10 ⁴ cell/wells로 접종하고 24 hr 배양한다. 동일 배지로 교체한 후 시료를 농도별로 희석하여 처리한 후 72 hr 동안 CO ₂ incubator에서 배양한다. 5 mg/ml neutral red 용액과 10% fetal bovine serum(FBS), 5% antibiotic-antimyotic을 첨가한 DMEM을 혼합하여 세포에 200 μl씩 처리한 후 2 hr 배양한다. 1% CaCl ₂ & 1% formaldehyde 용액 넣은 후 1 min 교반하고, 1% Acetic acid & 50% EtOH 용액 넣은 후 15 min 교반한 후 microplate reader(Bio-rad, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 정량 − B16F1 세포를 10% fetal bovine serum (FBS), 5% antibiotic-antimyotic을 첨가한 DMEM으로 배양기에서 37℃, 5% CO ₂ 조건으로 배양한 후 6 well plate에 5×10 ⁴ cell/wells로 접종하고 세포가 바닥에 80% 이상 자랄 때까지 배양한다. 200 nM α -melanocyte stimulating hormone ( α -MSH)이 있는 배지조건에 시료를 농도별로 처리한 후 72 hr 배양하였다. 양성대조군으로는 알부틴을 사용하였다. 배양된 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 trypsination 하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 1,000 rpm으로 5 min 원심분리 한 다음 상등액을 제거하여 pellet을 얻었다. 이 pellet은 70℃에서 1 hr 동안 건조한 후 10% DMSO가 함유한 1M NaOH 용액 400 μl 넣어 멜라닌을 용해시킨 후, microplate reader(Bio-rad, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase, TRP-1, TRP-2와 MITF의 단백질 발현 저해 효과 −시료를 72 hr 동안 처리한 B16F1 melanoma 세포를 PRO-PREP protein extraction solution(Intron biotechnology, Korea)으로 용해하고 원심분리하였다. 여기서 얻은 상층액을 8% SDS-PAGE를 이용해 전기영동하고 PVDF membrane으로 이전시켰다. 5% skim milk가 함유된 tris 완춘용액으로 1 hr blocking한 후, tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF, β -actin 1차, 2차 항체와 각각 반응시켰다. 반응 후 Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate (Millipore, USA)를 이용하여 1~3 min 반응시킨 후 Chemi-Doc(ATTO, Japan)으로 확인하였다. 통계 처리 −본 실험의 통계처리는 Minitab 17을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 각 실험군의 간의 결과는 2-표본 t 검정을 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다. 실험군 간의 차이는 95% 수준(p<0.05)에서 유의성 있는 것으로 하였다. 분리한 Demethylsuberosin 화합물의 구조결정 − 화합물 1 은 옅은 노란색 gum의 형태로 분리되었으며, ELSD를 이용한 HPLC 분석 결과, 순도는 95% 이상으로 확인되었다. ¹ H-NMR 스펙트럼의 δ 6.21, 7.61 (each 1H, d, J = 9.5Hz, H-3, H-4)에서 전형적인 7-hydroxy-6-substituted coumarin의 존재를 확인할 수 있었으며, δ 6.89 (H-8)와 7.17 (H-5)에서 두 개의 amomatic proton이 있음을 알 수 있었다. 또한, 5.29 (1H, t, J = 7.2 Hz), 3.36 (2H, d, J = 7.2 Hz) 및 1.77, 1.74 (6H, s. gem-(CH ₃ ) ₂ )의 피크에서 3-methylbut-2-enyl 기가 존재함을 확인할 수 있었다. 이는 ¹³ C-NMR 스펙트럼의 하나의 methylene carbon (δ 28.7), 두 개의 olefinic carbon (δ 120.9, 135.4) 및 두 개의 methyl carbon (δ 17.9, 25.8)에서도 확인할 수 있었다. 위의 결과를 바탕으로 화합물 1 은 coumarin 계열의 화합물인 demethylsuberosin로 추정되었으며, 보고된 문헌의 분광학적 data와 비교하여 demethylsuberosin로 최종 확인, 동정하였다( Fig. 1 ). 12) 세포독성결과 −화합물 1 의 세포 독성측정과 실험에 사용 될 농도 범위 결정을 위해 NRU assay를 시행하였다. B16F1 melanoma 세포에 대한 세포독성을 측정한 결과, 5 μg/ml 이하의 농도에서 세포생존율이 80% 이상으로 나타났다( Fig. 2 ). 멜라닌 생성 억제 효과 −화합물 1 이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 B16F1 melanoma 세포를 이용하여 멜라닌 합성 억제 효과를 측정하였다. 화합물 1 을 2.5, 5, 10 μg/ml 농도로 처리한 세포를 수집하여 멜라닌 양을 측정한 결과 농도 의존적으로 멜라닌 합성이 저해됨을 확인하였다( Fig. 3 ). 최고 농도인 5 μg/ml의 농도에서 약 74% 멜라닌 합성이 저해되었고, 양성대조군으로 사용한 arbutin은 500 μg/ml 농도에서 약 33%로 억제되었다. Tyrosinase, TRP-1, TRP-2와 MITF의 단백질 발현 저해 효과 −화합물 1 의 멜라닌 합성 억제 효과가 tyrosinase, TRP-1, TRP-2와 같은 멜라닌 합성효소의 발현억제와 멜라닌 형성에 중요한 transcription factor인 MITF의 발현에 관련된 효과인지 알아보기 위해 western blotting을 수행하였다. 그 결과 화합물 1 은 tyrosinase, TRP-1 그리고 TRP-2의 발현을 억제하는 것으로 나타났으며, transcription factor인 MITF의 발현도 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다( Fig. 4 ). Melanin 생합성 신호전달 체계에는 매우 다양한 신호전달물질이 관여하고 있고 melanin은 몇 가지 세포내 신호전달 기전을 통하여 합성되는데, 그 중 cAMP/PKA 경로가 melanin 합성의 주요 경로로서 UV에 피부가 노출되었을 때 melanin세포의 cAMP가 증가되고 하류 신호전달 물질인 PKA를 활성화 시키며, CREB을 거쳐 MITF의 발현을 증가시킨다. MITF는 melanin 합성 과정에서 중요한 전사 조절인자로 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 전사를 촉진한다. 따라서 실험 결과 화합물 1 은 MITF 발현 억제를 통하여 tyrosinase, TRP-1, 그리고 TRP-2의 단백질 발현이 감소되고, 더 나아가 멜라닌 생성 억제로 이어지는 것이라 판단된다. 참당귀에서 분리된 coumarin계 화합물은 HPLC, 1D/2DNMR 등의 분광학적 방법으로 demethylsuberosin( 1 )으로 동정하였으며, 이 화합물이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 B16F1 melanoma 세포를 이용하여 세포내 멜라닌생성 저해효과, tyrosinase와 관련단백질 및 유전자에 미치는 영향을 연구하였다. 화합물 1 의 B16F1 melanoma 세포를 이용한 멜라닌 생성은 5 μg/ml 농도에서 74% 감소하였고, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 및 MITF의 발현도 농도의존적으로 억제하였다. 참당귀 추출물 및 demethylsuberosin은 멜라닌 생합성에 관여하는 단백질과 유전자의 발현조절경로를 통하여 멜라닌 생합성 저해 효과를 나타내는 것으로 보이며 향후 미백제로 응용 할 수 있을 것으로 생각된다.