The roots of Paeonia lactiflora (PL) has been traditionally used as analgesic, spasmolytic and tonic in Korea, China, and Japan. As part of a search for herbal medicine to treat diabetes and obesity, we confirmed hypoglycemic effect of PL through high fat diet-induced obese and diabetic mice experiments in vivo . Treatment of ethanolic extract from PL led to a significant decrease in glucose level, which is comparable to that of an antidiabetic drug metformin. In addition, PL selectively stimulates the transcriptional activities of both peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)α and γ, and inhibits enzymatic activity of protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B), which are predicted to be therapeutic target in treatment of type2 diabetes and obesity. Especially, the n -hexane fraction (Hx) from PL ethanol extract showed more potent activities on PPARα and than others and exihibited moderate inhibitory activity against PTP1B. 생약 및 생약 시료의 조제 −실험에 사용한 작약은 삼홍건재약업사에서 구입하여 사용하였으며, 증거표본(MNUYG-011)은 목포대학교 약학대학 표본실에 보관 중이다. 작약(300 g)은 ethyl alcohol(EtOH)(3 L)로 3시간 동안 초음파추출기를 이용하여 추출하였고, 여과한 후 회전농축기로 감압, 농축시켰다. 작약의 EtOH 추출물(78 g)을 증류수(1 L)로 현탁한 후 n -hexane, methylene chloride, ethyl acetate를 이용하여 순차적으로 용매 추출하고 농축시켜, 작약 ethyl alcohol 추출물(EtOH) 외에, n -hexane 분획물(Hx), methylene chloride 분획물(MC), ethyl acetate 분획물(EA), 물 분획물(DW) 등 4종의 시료를 추가 제조하였다. 시약 −WY14643, troglitazone과 9- cis retinoic acid는 Sigma-Aldrich Co.(St Louis, MO, U.S.A.)에서 구입하였으며, GW501516은 Santa Cruz Inc.(Santa Cruz, CA, U.S.A.)에서 구입하여 사용하였다. Recombinant human PTP1B는 BIOMOL Research Laboratories, Inc.(Plymouth Meeting, U.S.A.)에서 구입하였고, 기질인 para -nitrophenyl phosphate( p -NPP)는 New England Biolabs, Inc.(Beverly, MA, U.S.A.)에서 구입하여 사용하였다. 동물실험 −모든 동물실험은 한국과학기술연구원의 실험동물윤리위원회에서 승인된 가이드라인에 따라 수행되었다. 7주령의 웅성(雄性) 마우스(C57BL/6) 32마리를 Shizuoka Laboratory Animal Center(Hamamatsu, Shizuoka, Japan)사에서 구입하여 1주일동안 12시간 조명주기와, 항온(23±2℃), 항습(55±5%)하에 적응시켰다. 그룹 당 8마리씩 4그룹으로 분리한 후, 정상식이군(Con군: 10% kcal fat, 38057, Purina Inc., Seongnam, Korea)과 3군의 고지방식이군(60% kcal fat, D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ)으로 나누어 8주간 실험을 진행했다. 고지방식이군 중 한 군은 약물투여 없이 고지방식이만을 섭취시켰고(HFD군), 나머지 두군은 각각 500 mg/kg metformin(MET군)을, 다른 한 군은 100 mg/kg 작약 EtOH 추출물(PL군)을 1일 1회 8주 동안 경구투여 하였다. 실험기간 동안 몸무게, 사료섭취량, 물섭취량을 매일 측정하였다. 몸무게 증가는 실험기간 동안 증가한 평균몸무게로 나타내었으며, 식이효율(food efficiency ratio; FER)은 몸무게 증가량을 식이섭취량으로 나눈 값으로 나타내었다. 실험이 종료된 후 혈당은 안와정맥총에서 채혈하여 Accu-Chek(Roche Diagnostics) 혈당기로 측정되었다. PPAR 및 RXR 리포터 활성 검색 − CV-1 세포를 24-well plates에 6×10 ⁴ cells/well의 농도로 분주하고 18시간 동안 37℃, 5% CO ₂ 조건하에 배양하였다. TransFast ^TM Transient transfection kit(Promega, USA)을 이용하여 pcDNAhPPARα, pcDNA-hPPARδ, pcDNA-hPPARγ, 또는 pcDNAhRXRα expression plasmid와 PPRE-Luc reporter plasmid, pRL-SV40 plasmid(Promega, U.S.A.)를 transfection시켰다. Transfection 다음날 특정 농도의 추출물 및 분획물들과 positive control인 WY14643(PPARα; 10 μM), GW501516 (PPARδ; 1 μM), troglitazone(PPARγ; 10 μM), 또는 9- cis retinoic acid(RXRα; 10 μM)을 처리하고 24시간 배양하였다. 배양한 세포를 PBS로 세척한 후 lysis buffer(Promega, USA)를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포용해액을 대상으로 Dual-Glo ^® assay kit(Promega, USA)을 이용하여 Luciferase assay를 수행하였다. 측정은 luminometer(Promega, USA)로 firefly와 renilla luciferase의 활성을 측정하여 각 추출물 및 분획물의 PPAR 및 RXR에 대한 활성 능력을 비교하였다. 11) PTP1B 활성 검색 − p -NPP를 기질로 이용하여 탈인산화 정도를 측정하여 PTP1B에 대한 저해활성을 검색하였다. 7) 50 mM citrate buffer(pH 6.0), 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA 그리고 1 mM DTT이 포함되어진 완충용액에 20 mM p -NPP, PTP1B(0.05 μg) 그리고 생약추출물을 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 10 N NaOH 10 μL를 첨가하여 반응을 종결하고 생성물 p -nitrophenol을 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 통계처리 −자료는 동물실험의 경우 평균±표준오차, 세포실험의 경우 평균±표준편차로 나타내었다. 두 그룹간 통계적 유의성 검사는 Student’s t -test를 사용하였으며, P<0.05인 경우 통계적으로 유의하다고 평가하였다. 기존에 보고된 작약( P. lactiflora )의 항당뇨 효능 및 PPAR, PTP1B 관련 활성성분을 살펴보면, tannin 성분인 1,2,3,4,6-penta- O -galloyl-D-glucopyranose의 PTP1B 억제 효능이 보고되었으며, 12) 작약 초임계 추출물의 PPARα 활성이 보고되었다. 13) 또한 작약은 phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK)의 유전자 발현을 억제함으로써 혈당강하 효과를 나타낸다고 보고되어 있으며, 7) 작약 ethyl acetate 추출물에서 분리된 monoterpene glycoside계 paeoniflorin과 8-debenzoylpaeoniflorin을 streptozotocin(STZ)으로 유발한 당뇨모델 랫에 정맥투여시 혈당강하 효능을 나타낸다는 보고가 있다. 14) 그러나 당뇨환자의 대부분이 제2형 당뇨병이며, 서구화된 식생활과 활동량의 감소로 비만인구가 늘어나면서 당뇨유병률이 증가하는 추세를 고려한다면, 고지방식이로 유도된 당뇨/비만 동물모델을 이용한 효능평가와 관련 타겟의 활성평가 등이 추가로 이루어져야 한다고 여겨져 본 실험을 진행하였다. 본 연구팀이 수행한 이전 연구결과를 바탕으로 15) 작약의 혈당 강하 효능을 검증하기 위하여 고지방식이로 유발된 당뇨/비만 C57BL/6 마우스모델에 metformin을 양성대조군으로 하여 작약 EtOH 추출물을 경구투여 하였다. 8주 동안 마우스의 체중 변화를 측정한 결과, MET군은 뚜렷한 체중감소 효능을 보인데 반해, PL군은 약물투여 없이 고지방식이만을 섭취한 군(HFD군)과 비교하여 유의성 있는 변화를 보여주지 않았다( Fig. 1 A). 또한 PL군의 식이섭취량(food intake) 및 식이효율(FER) 역시 HFD군과 차이가 없어 전반적으로 크게 좋은 효능을 보이지는 않았다( Table I ). 마우스의 간 무게 측정결과는 HFD군(1.80±0.27 g)에 비해 PL군(1.42±0.15 g)이 낮게 나타났으나, MET군(1.06±0.06 g)에 비해 상당히 약한 효능을 보여주었다( Fig. 1 B). 그러나 8주 후 공복혈당을 측정한 결과, 작약 추출물 PL군의 혈당치가 196±14.55 mg/dl로 HFD군(249±30.30 mg/dl)에 비해 뚜렷한 감소를 나타내었고, 이는 대조약물 투여군인 MET군(191.43±7.30 mg/dl)에 필적함을 보여주었다( Fig. 1 C). 이 결과를 종합해 보면 작약 추출물은 고지방식이로 유발되는 당뇨에서 혈당을 강하시키는 효능을 유의성 있게 나타내나, 비만과 관련해서는 효능을 보이지 않는 것으로 보인다. 중국의 한 그룹에서 비알코올성 지방간 모델에서 작약의 총 당추출물이 인슐린저항성을 개선하고, 지질프로파일을 개선함을 보고하였는데, 이는 본 작약추출물도 비슷한 기전으로 작용하여 인슐린 저항성을 개선하여 혈당을 강하시키는 효능을 나타내었을 것으로 추정할 수 있다. 16) 이러한 동물실험 결과를 바탕으로 본 연구팀은 작약의 혈당 강하 효능이 발현되는 기작과 유효 성분이 포함된 분획을 추적하고자 작약의 EtOH 추출물에 대한 용매 분획물을 제조하고 PPARs와 RXRα 유전자가 transfection된 세포에 처리하여 luciferase assay를 통해 PPARs 및 RXR에 대한 활성 능력을 측정하였으며, 각 시료에 대한 PTP1B 효소 억제 효능 역시 검증하였다( Fig. 2 ). 활성 검색 결과, 작약의 EtOH 추출물에서 유래한 유기용매 분획물 Hx, MC 및 EA 시료가 모(母) 추출물인 EtOH 시료에 비하여 전반적으로 효능이 강하게 나타났다. 각 추출물을 동일 농도(100 μg/mL)에서 비교한 결과, PPARα에 대한 활성( Fig. 2 A)은 Hx 분획물이 EtOH 시료 투여군과 비교하여 3배 이상 높은 활성을 보여주었고, MC층도 2배로 강한 효능을 보였다. PPARγ의 활성은 대조약물인 triglitazone(TRO)에 비하여 약하지만 모든 유기용매 분획물에서 전반적으로 좋은 활성을 보였다. 그러나 PPARδ( Fig. 2 B)과 RXRα( Fig. 2 D)에서는 효능을 거의 나타나지 않았다. 따라서 PPAR의 경우는 α와 γ에서 효능제(agonist)의 역할을 할 가능성이 높을 것으로 추정되며, 이는 혈당 강하 효능의 결과로 이어졌으리라 사료된다. PPARα는 미토콘드리아와 퍼옥시좀에서 지방산 산화를 조절하는 기능을 가지고 있으며 아주 우수한 이상지질혈증 조절의 타겟으로 생각되고 있다. 17) 즉 HFD에 의해 간에 지방이 과도하게 축적되는 현상을 PPARα 활성화인 작약이 유의성이 있지는 않지만 억제함으로써 과도한 지질에 의해 발생이 가속화될 수 있는 제2형 당뇨를 어느 정도는 개선할 수 있는 것으로 추정된다. 다른 당뇨 치유 목표기작 중 하나인 PTP1B 활성을 검색한 결과 EA 분획물(IC ₅₀ 10 μg/mL)이 높은 활성을 보였으며 다음으로 Hx 분획물(IC ₅₀ 24.6 μg/mL)과 MC 분획물(IC ₅₀ 48.7 μg/mL)이 좋은 효능을 보였으며( Table II ), 이 결과 또한 혈당강하 효능에 일조를 했으리라 여겨진다. 즉 PTP1B는 인슐린수용체 타이로신잔기의 인산화를 조절함으로써 인슐린에 대한 감수성을 조절하여 혈당을 강하시키는 기전으로 작용했을 것으로 사료된다. 18) 상기 결과를 종합할 때, 제2형 당뇨와 관련된 작약의 혈당강하 효능은 단순히 하나의 표적에 작용하는 효능이라기 보다는 PPARα와 γ 그리고 PTP1B 등이 복합적으로 효능을 발휘하게 하는 것으로 사료되어진다. 특히 작약의 유기용매 분획물 중, Hx 시료는 해당 표적에서 가장 좋은 효능을 보여주고 있어 현재 성분 분리 연구를 진행 중에 있다. 고지방식이 유발 당뇨/비만모델 마우스 동물실험을 통해 확인한 결과, 작약 추출물은 유의성 있는 혈당 강하 효능을 보여주었다. 이러한 항당뇨 효능에 관여하는 타겟과 그 효능 분획을 밝히기 위하여 검색한 결과, 작약의 Hx 분획물이 가장 좋은 PPARα과 PPARγ 효능을 보였으며, PTP1B 억제 효능 또한 우수하였다. 이로써 작약의 혈당 강하 효능은 PPARα, PPARγ, PTP1B 등이 복합적으로 작용하는 것으로 여겨지며 작약의 분획물 중 Hx 분획물이 전반적으로 가장 효능이 우수하여 유효성분 연구를 진행 중에 있다. 또한 유효성분 분리 후에는 인슐린 민감도와 관련된 단백질의 발현 및 인산화를 측정하여 인슐린 신호전달 관련 시그널 중 어느 부분에 작약의 효능성분이 작용하여서 혈당강하효능을 나타내는지에 대한 기전연구를 수행할 예정이다.