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Cancer Prevention Effect of Epigallocatechin-3-gallate through Regulate in C-terminal Src Kinase (CSK) Signaling Pathway
Cancer Prevention Effect of Epigallocatechin-3-gallate through Regulate in C-terminal Src Kinase (CSK) Signaling Pathway
Korean Journal of Pharmacognosy. 2014. Jun, 45(2): 127-134
Copyright © 2014, The Korean Society of Pharmacognosy
  • Received : May 14, 2014
  • Accepted : June 12, 2014
  • Published : June 30, 2014
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대용, 김
부영, 최
bychoi@seowon.ac.kr

Abstract
A great interest is emerging about green tea as a tool against human cancer proliferation or inflammation, as pointed out by recent reports describing the inhibitory action of epigallocatechin gallate (EGCG) on angiogenesis, urokinase, metalloproteinases, and induction of inducible nitric oxide synthase. We proposed that EGCG may regulate a multi target signaling having wider spectra of action than those actions of single enzymes. CSK (c-terminal Src kinase) protein is a non-receptor tyrosine kinase involved in the cross-talk and mediation of many signaling pathways that promote cell proliferation, adhesion, invasion, migration, and tumorigenesis. Based on the knowledge that CSK activation is important for cancer proliferation we hypothesized that CSK could be a target of EGCG. Here we showed that EGCG effectively suppressed the growth of CSK MEF cell when compare with CSK knockout MEF cell growth. These results indicate that EGCG could be used as a chemoprevention to modulate CSK signal pathway in inflammatory processes and tumor formation.
Keywords
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재료 및 방법
시약 및 시료 −모든 배지는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)의 권장 배지를 사용하였고, fetal bovine serum(FBS) 시약은 Gemini Bio-Products(Calabasas, CA, USA)로 부터 구입하였다.
CNBr-Sepharose 4B, glutathione-Sepharose 4B, [γ- 32 P]ATP는 Amersham Biosciences에서 구입하여 사용하였다.
[ 3 H]EGCG(13Ci/mmolin ethanol containing 8 mg/ml ascorbic acid)는 Dr. Yukihiko Hara(Food Research Laboratory, Mitsui Norin Co. Ltd., Fujieda, Shizuoka, Japan)로 부터 제공받아 사용하였다. 재조합 CSK와 poly-(Glu4-Tyr) peptide는 Upstate Biotechnology, Inc.(Charlottesville, VA)로 부터 구입하였다. ATP immobilized agarose 4B는 Fluka(St. Louis)에서 구입하여 사용하였다. EGCG, EC, ECG, EGC는 Dr. Chi-Tang Ho(Rutgers University, Piscataway, NJ)로부터 제공받아 사용하였다.
세포배양 − Jurkat(clone E6-1) human T cell leukemia 세포와 CSK+/+와 CSK-/- MEF 세포는 Dr. Zigang Dong(Cellular & molecular biology, Hormel institute, Austin, MN, USA)로 부터 제공받아 사용하였다. Jurkat와 CSK knockout MEF 세포는 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
결합력 및 Kd측정 − GST-CSK의 결합력을 측정하기 위하여 GST fusion 단백질을 glutathione-Sepharose 4B beads와 한 시간 동안 상온에서 반응시켜 immobilization 하였다. 결합력 측정은 4℃에서 reaction buffer가 포함된 500-μl reaction mixture와 1 μg의 GST-CSK-Sepharose 4B 또는 GST-Sepharose 4B와 0.5 μCi의 [ 3 H]EGCG를 반응시켰다. 농도 의존적 분석을 위해서 EGCG 농도를 3 pM에서 50 μM까지 사용하였다. Kd 측정은 Prizm 4.0 program(Graphpad Inc., San Diego, CA)을 사용하여 nonlinear regression 분석을 이용하였다.
EGCG-Sepharose 4B와 L-[35S] Methionine-labeled CSK단백질 Pulldown Assays − Full-length CSK유전자(pcDNA4/HIS/Max-CSK)를 TNT Quick Coupled Transcription/Translation System(Promega) 이용하여 L-[ 35 S] methionine과 함께 in vitro translation 시켜서 라벨을 만들었다. 35 S-label CSK 단백질을 reaction buffer(50 mM Tris, pH 7.5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, 0.01% Nonidet P-40, 2 μg/ml bovine serum albumin, 0.02 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1×proteinase inhibitor)에서 EGCG-Sepharose 4B beads와 반응시켰다. Bead는 완충용액(50 mM Tris, pH 7.5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, 0.01% Nonidet P-40, 0.02 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)으로 5번 세척한 후 bead와 결합한 단백질을 autoradiography 또는 immunoblotting으로 분석하였다.
Kinase Assay − CSK kinase assay는 30℃에서 2시간 동안 25 μl reaction mixture(50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MnCl2, 1 mM EGTA, 2 mM dithiothreitol, 0.01% Brij), 0.2 μg의 재조합 CSK, 1 μg의 kinase substrate(poly(Glu4-Tyr) peptide, biotin conjugate) Upstate Biotechnology, Inc.(Charlottesville, VA)와 1 μg의 unactive LCK 단백질 (millipore, MA,USA) 그리고 EGCG(0.5-20 μM), 100 μM ATP, 1 μCi의 [γ- 32 P]ATP를 반응시켰다. ECG, EGC, EC는 10 μM로 처리하였다. 반응 종결 후 scintillation counter를 이용하여 결과를 분석하였다. LCK 단백질의 인산화를 확인하기위해 anti-phospho-LCK(Tyr505) 항체(millipore, MA, USA)를 이용하였다.
세포 성장 측정 −세포(6×10 5 )를 96-well plate에 24시간 동안 배양한 후 각각의 EGCG 농도(0, 0.5, 1, 5, 10, or 20 μM)에서 72시간 동안 배양하였다. EGCG의 세포 성장억제 효과를 측정하기 위하여 the Cell-Titer 96 AQueous One Solution cell proliferation assay kit(MTS)(Promega, Madison, WI)를 이용하였다. 시약을 각 well에 첨가하여 흡광도를 492 nm 파장에서 96-well plate reader(Labsystem Multiskan MS, Labsystem, Finland)로 결과를 측정하였다. CSK+/+와 CSK-/-세포에서의 20 μM EGCG 처리후 성장률을 3주간 관찰하였다. 본 실험은 focus-forming 방법에 의해 수행하였으며 약 3주후 세포 콜로니를 methaol에 고정 후 0.4% crystal violet으로 염색 후 관찰 하였다
결 과
EGCG와 CSK 결합 능력 − CSK는 Src-family kinase의 활성을 촉진하며 다양한 암세포에서 활성화 되었다. 14) Kinase screening 실험을 통하여 EGCG 5 μM에 의해서 CSK가 억제됨을 확인하였다. 그래서 우리는 EGCG와 CSK가 서로 상호작용을 할 것으로 예상하고 실험을 진행하였다. 우선 EGCG와 CSK의 결합 능력을(binding affinity; K d ) GST pull-down assay와 3 H-labeled EGCG를 이용하여 확인하였다. EGCG와 CSK의 결합 K d 값은 0.05±0.04으로 측정되었다( Fig. 2 A). 그 다음으로 EGCG와 CSK의 결합을 EGCGSepharose 4B affinity chromatography 실험을 통하여 확인하였다. 그 결과 EGCG와 CSK는 complex를 이루는 것이 확인되었다( Fig. 2 B).
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in vitro interaction of CSK with 3H-EGCG. A. specific binding assay for CSK and EGCG. The Kd (dissociation kinetic)value of the EGCG-CSK interaction (Kd=0.05 μM) was obtained by using a GST-CSK affinity-binding assay as described under “Experimental Procedures.” B, in vitro identification of the EGCG-binding site of CSK. The full-length CSK were translated with L-[35S]methionine using TNT and subjected to the EGCG-Sepharose 4B pulldown assay. C, modeling of EGCG binding with the CSK catalytic pocket protein.
또한 EGCG와 CSK 사이의 결합에 대한 구조적 관계를 좀 더 확실하게 파악하고자 우리는 CSK의 x-ray co-crystal 구조를 활용하여 EGCG의 결합 부위를 확인하였다( Fig. 2 C).
CSK Kinase 활성에 대한 EGCG의 효과 −다음으로 우리는 EGCG가 CSK의 인산화 또는 kinase 활성을 억제 할 수 있는지 확인하였다. Kinase 활성은 활성 CSK와 기질인poly(Glu 4 -Tyr)펩타이드를 이용한 in vitro kinase assay를 통하여 측정하였다. 그 결과, EGCG는 농도의존적으로 CSK kinase 활성을 억제하였으며, 4 μM의 농도에서 50% 활성억제(IC 50 )를 보였다( Fig. 3 A).
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Effect of EGCG or analogue on CSK kinase activity and phosphorylation of LCK. A-B, EGCG inhibits CSK kinase activity in vitro. Kinase activity of CSK was assayed under the conditions described under “Experimental Procedures.” C, posphorylation of LCK on regulate CSK by treatment EGCG(20 μM). (+): Positive control-recombiant CSK, and kinase substrate (poly(Glu4-Tyr) peptide, biotin conjugate. Data are represented as means±S.D. of triplicate samples from three independent experiments.
다른 폴리페놀들(ECG, EGC, EC)과 EGCG의 CSK kinase 활성을 비교 실험하였다. EGCG는 다른 폴리페놀들에 비해 가장 강력하게 kinase 활성을 억제하였다( Fig. 3 B).
그 다음으로 CSK의 기질로 알려진 lymphocyte-specific protein tyrosine kinase(LCK)를 이용하여 EGCG가 CSK의 활성에 미치는 영향을 확인하였다. EGCG를 농도 별로 처리하였을 때 LCK의 인산화가 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다( Fig. 3 C).
세포 성장에 대한 EGCG의 효과 −최근 연구에 의하면 EGCG는 암세포 증식을 억제하므로 암 예방의 효과가 있음을 보고하였다. 15) 본 실험에서도 EGCG의 세포 증식에 관한 효과를 살펴보고자 하였다. 세포증식 조절에서 CSK와의 관계를 증명하기 위하여 CSK+/+와 CSK-/- MEF 세포를 제작하였다. 두 세포에서 세포 성장에 미치는 EGCG의 영향을 조사하기 위해 MTS assay와 anchorage independent cell growth assay(Soft agar assay)를 실시한 결과 CSK knockout된 MEF 세포(CSK-/-)에서는 EGCG 처리와는 관계없이 세포 증식이 이루어졌으며, CSK+/+ MEF 세포에서는 EGCG 처리 농도 의존적으로 증식이 억제 되었다( Fig. 4 A,B). EGCG는 CSK pathway를 통하여 세포 증식을 조절함을 알 수 있다.
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EGCG inhibition of Cell growth and focus formation mediated by CSK knockout MEF cell lines. A-B, CSK knockout MEF cell growth was assessed by Cell-Titer 96 AQueous One Solution cell proliferation assay (MTS) and focus forming assay in the presence of increasing amounts of EGCG.
고 찰
본 실험의 결과로 EGCG가 CSK의 kinase 활성을 조절할 수 있음을 확인하였다. 아직까지 암에서 CSK의 명확한 기능이 밝혀져 있지 않은 상태에서 이런 EGCG의 조절은 암의 메커니즘에서 CSK의 역할을 설명할 수 있는 증거를 제시할 수 있다.
현재까지 진행된 CSK에 대한 연구를 살펴보면, embryonic carcinoma cell line인 P19에서 CSK의 발현이 높은 것이 확인되었다. 이 세포주에서 CSK는 세포 부착 분자에 의해 매개되는 cell-to-cell interaction에서 중요한 역할을 하는 Src family kinase들을 조절함으로써 neural differentiation에 관여한다고 알려져 있다. 16) 다른 연구 그룹에서는 2개의 정상 대장 세포주와 18개의 대장암 세포주에서 CSK의 발현 정도를 확인하였다. 그 결과, 대장암 세포주에서 정상 세포주보다 CSK의 발현이 현저히 증가되어 있는 것을 확인하였다. 17) 유방암에 관한 CSK의 연구를 살펴보면, 정상 breast 조직과 breast tumor에서 CSK의 kinase 활성을 조사하였다. CSK는 정상 breast 조직과 breast carcinomas, 유방암 세포주에서 높은 발현과 kinase 활성을 나타내었다. 18)
EGCG의 암 억제 기전에 대해서는 많은 연구가 이루어져 있다. 암 환자에서 암 전이는 주된 사망 원인이다. 전이의 복잡한 여러 단계의 과정을 거치며 암세포의 기저막 침윤은 초기의 중요한 단계이다. EGCG의 항암작용이 암세포 기저막 침윤에 중요한 urokinase plasminogen activator(uPA), matrix metalloproteinase(MMP), 활성산소 등의 억제를 통해 작용됨이 보고 되었다.
암세포의 침윤에서 중요한 hydrolase인 uPA는 기저막과 세포 외 기질의 분해를 촉진한다. uPA는 유방, 난소, 전립선, 위장관계 암 등 대부분의 침윤성 암에서 과발현되고 전이에 필수적인 역할을 하며, 예후를 예측하는데 중요한 지표가 된다. 동물모델실험에서 uPA 억제는 종양의 크기를 줄이거나 암 생성을 억제하였다. EGCG가 인간 섬유육종 세포주(human fibrosarcoma cell line)인 HT-1080 세포를 이용한 실험에서 uPA의 발현을 억제한다는 보고가 있다. 19) 이 연구에서 EGCG는 uPA의 promoter 활성을 억제하고 uPA의 mRNA의 안정화에 영향을 주었다. 다른 보고에서는 인간 구강암 세포주(human oral cancer cell line)인 OC2 세포를 이용하여 실험한 결과, OC2 세포의 이동과 침윤활동이 EGCG에 의해서 억제되었고, 그 과정에서 MMP-2/9, uPA의 발현이 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다 20) 하인두암 세포(hypopharyngeal carcinoma cell)에서는 HGF(hepatocyte growth factor)에 의해서 유도되는 종양의 성장, 이동, 침윤과정에서 발현이 증가되는 MMP-9과 uPA가 EGCG에 의해서 억제되는 것을 확인하였다.