Lysimachia foenum-graecum (LF) has been used for home remedy of common cold and headache in China. Foenumoside B from LF has been reported for anti-obesity effects. We used foenumoside B as a marker for content evaluation of different parts of LF. Ethanol extract of LF was used for isolation of foenumoside B and purified further by column chromatography. The structure was identified as foenumoside B by interpretation of spectroscopic analysis, including ¹ H-, ¹³ C-NMR and FT-ICR-MS. High-performance liquid chromatography (HPLC) method was used to compare the quantitative level of foenumoside B in different parts of LF. Foenumoside B contents in the leaf, stem, and aerial part showed significant differences. Contents of foenumoside B was detected highly in the leaf extracts. The results would be useful for efficient extraction of foenumoside B in LF. 실험재료 −본 실험에 사용한 영릉향은 Bioland에서 분양(중국 광서지방) 받아 중국과학원 곤명식물연구소 손한동 교수로부터 감정 후 사용하였다. 영릉향 표본(NDM10107)은 한국콜마 생명과학연구소 천연물연구팀 표본실에 보관 중이다. 시약 및 기기 −시료의 추출에 사용한 유기용매는 대정화금주식회사에서 생산한 특급 시약을 사용하였으며 기기분석을 위한 HPLC 용매는 J.T Baker사의 특별시약을 사용하였다. 그 외는 모두 특급 시약을 사용하였다. HPLC 분석기기는 Shimadzu Cp. (Japan)의 system controller (CBM-20A), solvent delivery system (LC-20AD), UV-Vis detector (SPD-20A), auto sample injector (SIL-20A), degasser (DGU-20A _5R )를 사용하였으며 HPLC column은 YMC사의 C18 Triart YMC-Pack ODS-AQ (4.6×150 mm, 3 μm)을 사용하였다. Semi-preparative HPLC 분석기기는 Shimadzu Cp. (Japan)의 system controller (CBM-20A), solvent delivery system (LC-20AP), auto sampler (SIL-10AP), UV-Vis detector (SPD-20A), fraction collector (FRC-10A)를 사용하였으며 column은 Agilent사의 Eclipse PrepHT, Zorbax, XDB C18 (21.2×250 mm, 7 μm)을 사용하였다. MS 스펙트럼은 한국기초과학지원연구원의 15T FT-ICR 기기로 ESI negative mode로 측정하였으며 NMR 스펙트럼은 Bruker사 500 MHz NMR spectrometer를 이용하여 측정하였다. 성분 분리 −영릉향 지상부 2 kg에 16 L의 95% 에탄올을 넣어 상온에서 40시간 동안 1차 추출 한 다음 여과하고 잔사에 8 L의 95% 에탄올을 가하여 상온에서 4시간 동안 2차 추출한 다음 여과하였다. 여액을 감압농축 하여 136.79 g(6.8%)의 에탄올추출물을 수득하였다. 이 중 135 g을 증류수 2 L에 현탁 한 뒤 단계적으로 용매 분획하여 n -Hexane 분획(32.81 g, 24.3%), CHCl ₃ 분획(8.02 g, 6.2%), EtOAc 분획(7.48 g, 5.8%), saturated BuOH(s-BuOH) 분획(42.49 g, 32.7%)을 수득하였다. s-BuOH 분획물을 Diaion HP-20 resin (350 g, 60 mm×500 mm, in 70%→100% MeOH)에 충진 한 다음 column chromatography를 수행하여 4개의 소분획물(HP1-HP4)을 수득하였다. HP3 분획물을 semi-preparative HPLC를 수행하여 HP3-1(ACN:H ₂ O=40:60)을 분리한 다음 ACN:H ₂ O=35:65 조건으로 순수 정제하여 화합물 1 을 수득하였고 분리 과정은 Scheme 1에 나타내었다. 화합물 1 은 ¹ H-NMR, ¹³ C-NMR spectrum 및 FT-ICRMS을 측정하여 문헌과 비교하여 foenumoside B임을 확인한 후 이를 함량분석 실험에 사용하였다. 8) ¹ H-NMR, 13CNMR spectral data의 assignment의 결과를 Table I 에 나타내었다. Foenumoside B − White powder, ICR-MS(ESI negative); m/z=1215.6166 (calcd. for C ₆₀ H ₉₅ O ₂₅ ), ¹ H-NMR (Pyridine d ₅ , 500 MHz) and ¹³ C-NMR (Pyridine d ₅ , 125 MHz) see Table I . 표준액과 검액의 제조 − Foenumoside B 10 mg을 정확히 달아 메탄올에 녹여 standard stock solution을 제조하였으며 이를 1, 5, 10, 50, 100 μg/mL 농도가 되게 희석하여 working standard solution을 제조하였다. 영릉향을 지상부, 잎, 줄기로 나누어 잘게 분쇄한 다음 각각 5 g씩 달아 메탄올 40 mL를 넣고 상온에서 24시간 추출한 다음 filter paper를 이용하여 여과하였다. 여과액을 감압농축하여 그 무게를 잰 후 메탄올을 넣어 정확히 100 mL로 한 다음 0.45 μm syringe filter로 여과한 여액을 검액으로 사용하였다. HPLC 분석조건 −표준액 및 검액을 0.45 μm syringe filter를 이용하여 여과한 후 HPLC에 사용하였다. HPLC 이동상은 A용액으로 water, B용액으로 acetonitrile을 사용하였으며 분석에 대한 조건은 Table II 와 같다. HPLC로 분석하여 얻은 표준액과 검액의 chromatogram의 면적을 구하여 표준품의 회귀직선 방정식으로부터 foenumoside B의 함량을 계산하였고 3회 반복 측정된 검액에 함유된 foenumoside B의 함량(%)을 산출하였다. 영릉향은 주로 중국에서 전통의약품으로 사용되어왔다. 영릉향의 주요 활성성분으로 triterpenoid saponins 계열 화합물들이 분리 보고되었으나 이들의 영릉향 내에서의 함량분석에 대한 연구는 보고된 바 없다. 그 중 foenumoside B는 급성 염증의 화학매개체 중요물질로써 천식이나 류마티스관절염 같은 자가알레르기병을 유발할 수 있는 아라키돈산 대사효소 및 지방세포분화 저해 활성을 가지고 있어 항염증 및 항비만 효능이 있는 것으로 보고된 바 있다. 4 , 8) 본 연구에서는 이와 같은 활성을 지닌 foenumoside B의 영릉향으로부터 추출효율을 높일 수 있는 방법 및 학술적인 자료를 구축하고자 영릉향으로부터 foenumoside B를 분리, 정제한 다음 이를 이용하여 영릉향 내 부위별 함량분석을 수행하였다. 영릉향 지상부를 95% 에탄올로 추출하고 이를 계통 분획하여 n -hexane, CHCl ₃ , EtOAc, 및 s-BuOH 분획물을 수득한 다음 이 중 saponins 계열이 주로 함유되어있다고 알려진 s-BuOH 분획물 층으로부터 open column chromatography 및 semi-preparative HPLC 를 사용하여 화합물 1 을 분리하였으며 1D 및 2D NMR data와 MS 측정을 통한 구조식과 분자량을 문헌과 8) 비교하여 영릉향의 활성물질중의 하나인 foenumoside B로 최종 구조 동정 하였다( Fig. 1 ). 화합물 1 의 ¹ H-NMR 및 ¹³ C-NMR spectral data의 assignment 결과를 Table I 에 나타내었다. 또한 foenumoside B 의 부위별 함량을 측정하기 위하여 Table II 의 조건으로 분석을 수행하였다. 분석 결과 foenumoside B의 피크 유지시간은 28.88 min로 검출되었으며( Fig. 2 ) 1, 5, 10, 50, 100 μg/mL 의 5가지 농도범위에서 측정하여 얻어진 foenumoside B의 검량선 상관계수는 0.9999로 1.0에 근접한 매우 양호한 직선성을 갖는 것으로 확인할 수 있었다( Table III ). 영릉향의 잎, 줄기, 지상부 에탄올 추출물을 가지고 HPLC를 이용하여 분석한 결과 모든 부위에서 foenumoside B가 검출되었으며 식물 건조 중량당 foenumoside B 함량을 평가하였을 때 잎 부위가 2.32±0.26% 로 가장 높은 함량을 나타내었으며 그 다음으로 지상부(1.58±0.09%), 줄기(0.32±0.07%)순으로 나타났다( Table IV ). 영릉향의 95% 에탄올 추출물 중 s-BuOH 분획층에서 화합물 1종을 분리하였으며, NMR과 MS spectral data로 부터 구조를 확인한 결과 foenumoside B인 것으로 구조 동정하였다. Foenumoside B의 영릉향의 부위별 함량을 분석 해본 결과 잎 > 지상부 > 줄기 순서로 검출되었다. 이상의 결과는 영릉향의 기능성 활성성분인 foenumoside B 추출 및 분리에 대한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 생각되며 함량이 높은 지상부, 잎과 함께 이를 이용한 다양한 기능성 소재 및 의약품으로서의 개발 가능성을 확인하였다.