Advanced
Discrimination of Alismatis Rhizoma According to Geographical Origins using Near Infrared Spectroscopy
Discrimination of Alismatis Rhizoma According to Geographical Origins using Near Infrared Spectroscopy
Korean Journal of Pharmacognosy. 2013. Dec, 44(4): 344-349
Copyright © 2013, The Korean Society of Pharmacognosy
  • Received : November 27, 2013
  • Accepted : December 17, 2013
  • Published : December 31, 2013
Download
PDF
e-PUB
PubReader
PPT
Export by style
Article
Author
Metrics
Cited by
TagCloud
About the Authors
동영 이
승현 김
효진 김
상현 성
shsung@snu.ac.kr

Abstract
Near infrared spectroscopy (NIRS) combined with multivariate analysis was used to discriminate the geographical origin of Alisma orientale from Korea (n=94) and China (n=72). Two-thirds of samples were selected randomly for the training set, and one-third of samples for the test set. Second derivative was used for the pretreatment of NIR spectra. Partial least square discriminant analysis (PLS-DA) models correctly discriminated 100% of the Korean and Chinese A. orientale samples. These results demonstrate the potential use of NIR spectroscopy combined with multivariate analysis as a rapid and accurate method to discriminate A. orientale according to their geographical origin.
Keywords
재료 및 방법
식물재료 −본 실험에 사용한 택사는 총 166종으로 국산 94종, 중국산 72종을 사용하였다. 국산은 중앙대학교 황완균 교수님, 중국산은 대전대학교 서영배 교수님께서 수집해 주셨다. 표품은 서울대학교 약초원에 보관하였다. 국산 택사의 경우 전남 순천시에서 41종, 전남 신안군에서 18종, 전남 여수시에서 35종을 수집하였으며 중국산 72종은 모두 사천성 지방에서 수집하였다.
시약 및 기기 −택사 분말의 근적외선분광분석은 MPA NIR system(Bruker optics, Germany)을 이용하여 측정하였다. 측정프로그램은 OPUS 7.0(Bruker optics, Germany)을 사용하였다. 다변량 분석법에는 SIMCA 13(Umetrics, Sweden)을 사용하였다.
시료 전처리 −채집한 택사는 통풍이 잘되는 그늘에서 건조하였다. 건조한 택사를 분쇄기로 30초간 분쇄한 뒤 분쇄물의 입자 크기를 최대한 일정하게 하기 위해 100호체(150 μm)에 통과시켰다. 체를 통과한 분쇄물을 근적외선분광분석용 vial에 약 1 g 정도(높이 2 cm 가량) 담고 50℃의 온도에서 12시간 건조시켜 수분에 의한 영향을 최소화 한후 이를 측정용 시료로 사용하였다.
근적외선 분광분석 −시료가 담긴 vial을 MPA NIR system을 이용하여 각 시료당 3회 측정한 후 그 평균치를 사용하였다. 측정 모드는 reflectance 모드를 사용하였고, 측정범위는 10000 cm -1 ~4000 cm -1 였다. 1회 측정에 32회 스캔, resolution은 8 cm -1 , scan velocity는 10 kHz였다.
데이터 전처리 방법 −근적외선분광법을 통해 얻은 스펙트럼은 시료의 화학적 성질 뿐 아니라 입자의 크기, 밀도와 같은 물리적 성질에 의해서도 영향을 받게 되는데, 이러한 물리적 영향을 감소시키고 보다 나은 산지판별 모델을 개발하기 위해서는 스펙트럼을 적절히 수학적으로 전처리 하는 것이 필요하다. 17) 일반적으로 많이 사용되는 미분법, MSC(multiplicative scattering correction)법, SNV(standard normal variate)법 등의 여러 전처리 방법 중 본 연구에서는 2차 미분법을 적용하여 스펙트럼을 전처리 하였다. 미분법은 스펙트럼을 미분하여 흡수대의 변화를 강조하는 기법으로 스펙트럼의 변화를 증폭시키고 바탕선의 이동과 같은 측정상의 문제를 제거할 수 있다. 하지만 전처리 과정에서 노이즈가 증폭될 수 있는데 노이즈의 발생을 줄이기 위해 Savitzky-Golay법을 함께 사용하였다. 18)
다변량 분석법 −근적외선분광법의 측정 결과를 다변량 분석법에 적용하기 위하여, 스펙트럼을 파수(cm -1 )에 따른 피크의 강도로 수치화하여 다변량 분석에 사용하였다. 시료별 기기의 측정조건에 따른 편차를 줄이기 위해서Pareto 방법을 이용하여 각 데이터를 표준화(scaling)하였다. 19) 산지판별 모델을 수립하기 위해 전체 시료 166종 중 2/3인 111종을 학습집합으로, 나머지 1/3인 55종을 검증집합으로 무작위적으로 선정하여 PLS-DA법을 시행하였다. 판별 모델의 검증은 검증집합을 판별 모델에 대입하여 나오는 산지 판별율(올바르게 판별된 시료 수/검증집합의 시료 수)을 이용하기로 하였다. 산지 판별은 PLS-DA분석 시 기준값을 국산 1, 중국산 0으로 놓았을 때 각 산지별로 결과값이 기준값 대비 ±0.35 이내인 경우에 유의성이 있는 것으로 보고 국산 또는 중국산으로 판명하였다.
결과 및 고찰
근적외선 스펙트럼 −국산과 중국산 택사의 평균 근적외선 분광 스펙트럼( Fig. 1 )을 살펴보면, 기본적으로 바탕선의 차이 등에 따른 스펙트럼의 변화는 관찰되었으나 전체적인 스펙트럼의 양상은 국산과 중국산이 유사함을 확인할 수 있었다. 스펙트럼에서 발견되는 피크를 분석해 보면, 8381, 5731 cm -1 에서 –CH 3 와 –CH 2 에서의 C-H 결합의 일차 배음에 의한 피크가 발견되는데, 이는 택사에 존재하는 alisol류의 triterpene에 의한 것이라 추측된다. 이 밖에도 6857, 6391 cm -1 에서 아미드의 N-H 결합의 일차 배음과 4782 cm -1 에서 starch의 O-H결합에 의한 피크가 발견되었다. 20) 물질의 입자의 크기 및 밀도와 같은 물리적 영향에 의해 생기는 바탕선의 변화를 제거하고 보다 나은 판별모델을 만들기 위해 2차 미분법으로 전처리하여( Fig. 2 )와 같은 결과를 얻을 수 있었다. 특히 5000 cm -1 부근에서 산지간의 뚜렷한 차이를 관찰 할 수 있었다.
PPT Slide
Lager Image
Average NIR spectra of Korean and Chinese A. orientale obtained from raw data.
PPT Slide
Lager Image
Average NIR spectra with second derivative pretreatment.
주성분 분석 −학습집합으로 구분된 시료의 raw data를 이용하여 주성분 분석을 시행하였다( Fig. 3 ). 전체 데이터에서 PC1(Principal component, 주성분)에 의해 93.3%가, PC2에 의해 5.63%가 설명되었다. 대부분의 시료들은 PC1을 기준으로 양의 영역에는 국산이, 음의 영역에는 중국산 택사가 분포하고 있었으나, 국산 택사 한 종(K13)이 중국산의 영역에 존재하고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 이 결과에서 Hotelling’s T 2 검정의 기준으로 국산 1종과 중국산 3종(K36, C32, C34, C56)을 outlier로 판단하여 이후의 다변량 분석에서 제외하기로 하였다. Fig. 4 에는 outlier로 판명된 4종의 시료를 제외한 나머지 시료에 대해 2차 미분법으로 전처리하여 주성분 분석을 시행한 결과를 나타내었다. 전체 데이터에서 PC1에 의해 47.1%가, PC2에 의해 15.3%가 설명 되었다. PC1과 PC2에 의해 K13을 포함하여 모든 시료들이 겹침 없이 잘 구분 되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 택사의 주성분 분석에 있어 2차 미분법이 효과적인 전처리 방법임을 확인할 수 있었다.
부분최소자승판별분석 − 2차 미분으로 전처리한 학습집합의 데이터를 토대로 부분최소자승판별분석을 시행한 결과, 학습집합의 경우 국산 62종, 중국산 45종이 모두 올바르게 판별되었다. 이는 부분최소자승판별분석의 2D score plot에서도 확인할 수 있다( Fig. 5 ). 이렇게 학습집합을 통해 수립된 판별 모델을 토대로, 검증집합의 데이터를 이용하여 국산을 1, 중국산을 0으로 기준값을 정하고 산지 판별을 시도하였다. 각 기준값에서 ±0.35이내인 시료를 각각의 산지로 판별하기로 하였는데, 국산 31종과 중국산 24종 모두 기준값에서 ± 0.35이내의 값을 나타내며 모두 올바르게 판별 되었음을 확인할 수 있었다( Fig. 6 ).
PPT Slide
Lager Image
Two dimensional score plot of PCA from raw data.
PPT Slide
Lager Image
Two dimensional score plot of PCA from 2nd derivative data.
PPT Slide
Lager Image
Two dimensional score plot of PLS-DA from 2nd derivative data.
PPT Slide
Lager Image
The validation test of PLS-DA model of A. orientale from Korea (n=31) and China (n=24).
결 론
택사의 산지 판별에 근적외선분광법과 다변량 분석을 도입하여 보다 빠르고 과학적인 산지판별을 하고자 실험을 수행하였다. 4000 cm -1 ~10000 cm -1 의 범위에서 택사 분말 166종의 스펙트럼을 측정하였으며, 이 중 2/3을 학습집합으로, 1/3을 검증집합으로 무작위적으로 나누었다. 학습집합에 대해 주성분 분석을 토대로 outlier를 제거하고, 2차 미분법을 이용하여 전처리 한 후 부분최소자승판별분석법을 통해 판별모델을 수립하였다. 그리고 수립된 판별모델에 대해 검증집합의 시료들을 대입하여 판별모델을 검증한 결과 학습집합과 검증집합 모두 국산과 중국산 판별율이 100%로 나타남으로써 수립한 판별 모델이 매우 유효하다는 것을 확인할 수 있었다. 근적외선 분광법은 분석시간이 짧고, 시료의 전처리 및 조작이 매우 간단하다는 장점을 가지고 있으므로 기존의 다른 분석 기기를 이용한 분석법과 비교하였을 때, 산지 판별 분석에 있어 근적외선 분광법이 가지는 경쟁력이 매우 높음을 시사한다. 이번 연구에서 적용한 근적외선분광법을 이용한 산지 감별법은 향후 택사 이외의 다른 생약에서도 효과적으로 이용될 수 있을 것이라 기대되며, 또한 객관적이고 경제성 있는 산지 판별 시스템을 구축하는 데에 중요한 근거를 제공 할 것이라 사료된다.
Acknowledgements
시료 채집에 큰 도움을 주신 중앙대학교 황완균, 대전대학교 서영배 교수님께 감사를 전합니다. 본 연구는 산업통상자원부 바이오의료기기산업융합원천기술개발사업으로 지원된 결과입니다(GLST-OSP 10039303).
References
허 준 (1994) 여강출판사 서울 2727 -
안 덕균 (2003) 교학사 서울 415 -
Matsuda H. , Kageura T. , Toguchida I. , Murakami T. , Kishi A. , Yoshikawa M. (1999) Effects of sesquiterpenes and triterpenes from the rhizome of Alisma orientale on nitric oxide production in lipopolysaccharide-activated macrophages : Absolute stereostructures of alismaketones-B 23-acetate and −C 23-acetate. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9 3081 - 3086    DOI : 10.1016/S0960-894X(99)00536-3
Nakajima Y. , Satoh Y. , Katsumata M. , Tsujiyama K. , Ida Y. , Junzo S. (1994) Terpenoids of Alisma orientale rhizome and the crude drug alismatis rhizome. Phytochemistry 36 119 - 127    DOI : 10.1016/S0031-9422(00)97024-9
Zhao M. , Xu L. J. , Che C. T. (2008) Alisolide, alisols O and P from the rhizome of Alisma orientale. Phytochemistry 69 527 - 532    DOI : 10.1016/j.phytochem.2007.06.014
Makino B. , Kobayashi M. , Kimura K. , Ishimatsu M. , Sakakibara I. , Higuchi M. , Kubo M. , Sasaki H. , Okada M. (2002) Local variation in the content of angiotentin II and arginine vasopressin receptor antagonistic terpenoids in the rhizomes of Alisma orientale. Planta Med 68 226 - 231    DOI : 10.1055/s-2002-23129
Lee J. H. , Kwon O. S. , Jin H. G. , Woo E. R. , Kim Y. S. , Kim H. P. (2012) The rhizomes of Alisma orientale and alisol derivatives inhibit allergic response and experimental atopic dermatitis. Biol. Pharm. Bull. 35 1581 - 1587
Han C. W. , Kwun M. J. , Kim K. H. , Choi J. Y. , Oh S. R. , Ahn K. S. , Lee J. H. , Joo M. (2013) Ethanol extract of Alismatis rhizoma reduces acute lung inflammation by suppressing NF-κB and activating Nrf2. J. Ethnophamacol. 146 402 - 410    DOI : 10.1016/j.jep.2013.01.010
Hendricks A. J. (1957) A revision of the genus Alisma (Dill.) L. Am. Midl. Nat. 58 470 - 493    DOI : 10.2307/2422629
Kang J. , Choi M. Y. , Kang S. , Kwon H. N. , Wen H. , Lee C. H. , Park M. , Wiklund S. , Kim H. J. , Kwon S. W. , Park S. (2008) Application of a 1H nuclear magnetic resonance (NMR) metabolomics approach combined with orthogonal projections to latent structure-discriminant analysis as an efficient tool for discriminating between Korean and Chinese herbal medicines. J. Agric. Food Chem. 56 11589 - 11595    DOI : 10.1021/jf802088a
Gong F. , Wang B. T. , Chau F. T. , Liang Y. Z. (2005) Data processing for chromatographic fingerprint of herbal medicine with chemometric approaches. Anal. Lett. 38 2475 - 2492    DOI : 10.1080/00032710500318338
우 영아 , 조 창희 , 김 효진 , 조 정환 , 조 경규 , 정 승성 , 김 수정 , 김 중환 (1998) 약학회지 42 359 - 363
McGoverin C. M. , Weeranantanaphan J. , Downey G. , Manley M. (2010) the application of near infrared spectroscopy to the measurement of bioactive compounds in food commodities. J. Near Infrared Spec. 18 87 - 111    DOI : 10.1255/jnirs.874
Luo X. F. , Yu X. , Wu X. M. , Cheng H. B. , Qu H. B. (2008) Rapid determination of Paeoniae Radix using near infrared spectroscopy. Microchem. J. 90 8 - 12    DOI : 10.1016/j.microc.2008.02.005
Wang L. , Lee F. S. C. , Wang X. R. (2007) Near-infrared spectroscopy for classification of licorice (Glycyrrhizia uralensis Fisch) and prediction of the glycyrrhizic acid (GA) content. LWT-Food Sci. Technol. 40 83 - 88    DOI : 10.1016/j.lwt.2005.08.011
Lee D. Y. , Kim S. H. , Kim Y. C. , Kim H. J. , Sung S. H. (2011) Discrimination of Scrophulariae Radix according to geographical origin and determination of active constituents by near infrared spectroscopy (NIRS). Microchem. J. 99 213 - 217    DOI : 10.1016/j.microc.2011.05.008
Rinnan A. , Berg F. , Engelsen S. B. (2009) Review of the most common pre-processing techniques for near-infrared spectra. Trends Anal. Chem. 28 1201 - 1222    DOI : 10.1016/j.trac.2009.07.007
Gorry P. A. (1990) General least-sqaures smoothing and differentiation by the convolution (Savitzky-Golay) method. Anal. Chem. 62 570 - 573    DOI : 10.1021/ac00205a007
van den Berg R. A. , Hoefsloot H. C. , Westerhuis J. A. , Smilde A. K. , van der Werf M. J. (2006) Centering, scaling and transformations: improving the biological information content of metabolomics data. BMC genomics 7 142 - 156    DOI : 10.1186/1471-2164-7-142
정 회일 , 김 효진 (2000) 분석과학 13 138 - 151