최근 들어 여주의 혈당개선의 약리학적 효능이 보고됨에 따라 기능성 채소로 각광받고 있다. 주로 여주 과실만이 식용으로 쓰이지만 여주씨 또한 다양한 가공과정을 거칠 경우(건여주 혹은 건조분말, 환, 엑기스 등) 필연적으로 함께 섭취되기도 한다. 본 연구에서는 과실이외의 특히, 연구결과가 미비한 여주씨에 대해 생리활성물질의 구명 및 혈당개선의 효과에 대한 연구를 수행하였다. 다양한 추출물 및 단일 활성성분의 혈당개선
in vitro
검증법인 α-glucosidase에 대한 저해효과를 측정하였고, 활성을 나타내는 추출물 또는 활성성분과의 상관관계를 구명하였다. 구체적으로는 95% 에탄올 추출물 및 비극성 용매 등에 다량 추출되는 생리활성물질인 α-eleostearic acid는 우수한 저해효과를 나타내었다(IC
50
=43.4 μg/mL). 또한 효소저해제의 함량을 HPLC를 통한 정량분석을 수행함으로써 여주씨에 함유된 기능성성분의 혈당개선 식의약 소재로의 응용가능성을 연구하였다.
서 론
여주(
Momordica charantia
L.)는 Bitter Melon 또는 Bitter gourd로 알려진 덩굴성 한해살이 박과식물로, 예로부터 일반적인 과실이 아니라 귀중한 약재로도 활용되어 왔다(
Giron ., 1991
;
Zong ., 1995
;
Virdi ., 2003
). 우리나라에서는 미숙 과실의 쓴맛 때문에 쓴오이라고도 하며 덩굴성 작물로 심어 주로 관상용으로 이용해 왔으나, 기능성 성분이 높은 박과채소로의 관심이 높아지면서 함양, 정읍, 철원, 제주도 등 전국 각지에서 여주를 재배 가공 판매하여 부가가치를 높이는 농가가 많아지고 있다.
여주에서 다양한 생리활성을 나타내는 성분들이 보고되고 있는데, 구성성분으로는 essential oil, flavonoid, phenolic acid, triterpene 및 alkaloid 등이 알려져 있다(
Liu ., 2009
;
Singh ., 2012
;
Kenny ., 2013
;
Kim ., 2013
). 특히 여주의 과실에 함유되어 있는 triterpene glycoside인 charantin이라는 성분은 췌장의
ß
세포에 작용하여 인슐린의 분비를 촉진함으로써 혈당을 낮춰 주는 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(
Parkash ., 2002
;
Rathi ., 2002
;
Schmourlo ., 2005
). 또한 alkaloid계 vicine이라는 성분과 polypeptide-p라는 식물 인슐린(vegetable insulin) 역시 혈당강하에 효과가 있는 것으로 널리 알려져 있지만(
Khanna ., 1981
) 여주 과실 이외의 다른부위 특히, 씨(종자)의 주요 생리활성물질 및 혈당개선의 효과에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.
최근 경제성장과 생활수준의 향상으로 한국인의 식생활이 서구화로 변모됨에 따라 비만인구의 증가로 인한 당뇨환자가 급격히 증가하면서 사회적 문제로 대두되고 있다. α-glucosidase는 소장에 존재하는 당분해효소로서 그 저해제는 탄수화물의 포도당으로의 소화를 지연시킴으로써, 결국 식후의 혈당치를 감소시키는 역할을 한다(
Maki ., 2007
). 현재까지 약용작물로부터 α-glucosidase 저해제의 분리 및 구조동정에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며(
Hu ., 2013
), 저해제로는 deoxynojirimycin (DNJ)가 α-glucosidase 저해활성을 나타내고 있고, 그 외에도 acarbose 및 voglibose 등의 합성저해제도 시판되고 있다(
Creutzfeldt, 1999
;
Asano, 2003
). 하지만 장기적으로 복용할 경우 복부팽만감, 구토 등 부작용이 나타날 수 있으므로 약용식물로부터 α-glucosidase의 활성을 억제시킬 수 있는 기능성 소재를 검증하는 것은 매우 중요하다.
따라서 본 연구는 국내에서 재배된 여주에 들어있는 여주씨 추출물의 α-glucosidase 저해효과를 측정하고 함유된 기능성물질과의 상관관계를 알아보고자 하였다. 또한 효소저해제의 함량을 HPLC를 통한 정량분석을 수행함으로써 여주씨에 함유된 기능성성분의 혈당개선 식의약 소재로의 응용가능성을 연구하였다.
재료 및 방법
- 시약 및 기기
실험에 사용한 α-glucosidase (EC 3.2.1.20, from Baker’s Yeast)와 기질(
p
-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside)은 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 실험에 이용한 모든 시약은 특급시약을 사용하였다. 물질 분리를 위해 Column chromatography (CC)용 silica gel 및 octadecyl silica gel (ODS)은 Merck (Darmstadt, Germany)을, Sephadex LH-20 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)을 사용하였고, 분석을 위해 nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum은 Bruker AM500 instrument (Billerica, MA, USA)으로 측정하였고, electronic ionization mass spectrometer (EI/MS) spectrum은 JEOL JMS 505-WA (JEOL, Tokyo, Japan)로 측정하였다. 정성 및 정량분석을 위해 2998 photodiode array detector (PDA)가 장착된 Alliance e2695 HPLC system (Waters Co., Milford, MA, USA) 및 Micromass ZQ MS (Waters Co., Milford, MA, USA)를 사용하였다.
- 추출 및 분리
본 실험에 사용한 여주씨는 함양영농조합법인에서 2014년 9월에 제공받은 여주과실을 수세하여 과육과 완숙된 씨를 분리한 다음 여주씨를 동결건조 한 후 최종 분쇄하여 사용하였다. 본 추출에 앞서 증류수, 30%, 50%, 70% 에탄올 및 95% 에탄올 등으로 추출을 실시하여 α-glucosidase 저해활성을 비교한 결과 가장 높은 억제효과를 가진 95% 에탄올 추출물을 생리활성물질의 분리를 위한 추출 용매로 결정하였다. 분리를 위해 여주씨 분말 200 g을 95% 에탄올에 1일간 침적시키고 추출된 여액을 감압, 농축하여 건조된 추출물 10 g을 얻었다. 얻어진 95% 에탄올 추출물을 헥산(2 L×2)/물(1 L)로 분배 추출 후 물층에 대하여 역상 크로마토그래피 및 재결정법을 이용하여 고순도의 vicine (1)을 분리 하였으며, 상기의 방법으로 분리된 화합물은 HPLC-ESI/MS,
1
H and
13
C NMR 등의 기기분석을 통한 정성분석으로 화학적 구조를 밝혔다. 이 후 헥산층에 대하여 silica gel CC를 실시하여(헥산-에틸아세테이트=20:1→1:1) 7개의 분획물(A-G)을 얻었다. 그 중 TLC에 전개시켜 UV흡수가 약하게 있고, 10% 황산을 분무, 건조 한 후 발색한 결과 갈색으로 발색된 분획물 C에 대해 sephadex LH-20의 CC를 통한 선택적인 정제 과정을 거쳐 지표수준의 고순도 eleostearic acid (2)를 분리하여 HPLC-ESI/MS 및 GC-EI/MS를 통해 표준물질과 비교하여 정성분석 하였다(
Fig. 1
).
Chemical structures of vicine (1) and α-eleostearic acid (2) from the seeds of Momordica charantia.
Vicine (1): White powder; ESI-MS
m/z
: 305 [M+H]
+
;
1
H NMR (500 MHz, DMSO)
δ
6.35 (3-NH
2
), 6.00 (5-NH
2
), 5.03 (H-1´), 3.63 (H-2´, 5´), 3.16 (H-6´), 3.06 (H-3´, 4´);
13
C NMR (125 MHz, DMSO)
δ
159.65 (C-1), 158.87 (C-5), 152.45 (C-3), 113.93 (C-6), 108.43 (C-1´), 77.94 (C-5´), 76.50 (C-2´), 73.49 (C-3´), 70.17 (C-4´), 61.60 (C-6´).
α-Eleostearic acid (2): Colorless oil; ESI-MS
m/z
: 279 [M+H]
+
; HR-EIMS
m/z
: 278.2250 (calc. 278.2246, err 1.5 ppm);
1
H NMR (500 MHz, MeOD)
δ
6.40 (H-11,
J
=13.5 Hz), 6.17 (H-12,
J
=13.5 Hz), 6.10 (H-13,
J
=14.2 Hz), 5.99 (H-10,
J
=10.9 Hz), 5.71 (H-14,
J
=14.1 Hz), 5.39 (H-9,
J
=10.9 Hz), 2.29 (H-2,
J
=7.4 Hz), 2.19 (H-8,
J
=6.8 Hz), 2.12 (H-15,
J
=6.8 Hz), 1.61 (H-3), 1.35 (H-4, 5, 6, 7, 16, 17), 0.93 (H-18,
J
=6.9 Hz);
13
C NMR (125 MHz, MeOD)
δ
179.35 (C-1), 134.39 (C-14), 132.73 (C-11), 130.97 (C-9), 130.66 (C-13), 128.68 (C-10), 125.70 (C-12), 33.58 (C-2), 32.15 (C-15), 31.35 (C-16), 29.35-28.72 (C-4, 5, 6, 7), 27.25 (C-8), 24.70 (C-3), 21.90 (C-17), 12.87 (C-18).
- HPLC-ESI/MS에 의한 정량/정성분석
분석시료 조제를 위한 추출은 건조분말시료 1 g을 cornical tube에 칭량하여 30 mL의 에탄올(30%, 50% 70%, 95%) 및 증류수를 추출용매로 하여 50℃에서 1시간동안 초음파추출(sonication) 하였다. 추출된 각 시료를 원심분리(3000 rpm, 15 min)를 한 후 상층액을 취하여 0.2 μm PTFE syringe filter로 여과하여 이를 HPLC-MS 분석시료로 사용하였다. 분석 컬럼은 Phenomenex hydro-RP C18, 80A (250×4.60 mm, 4 micron, Phenomenex, Torrance, CA, USA)를 사용하였고 시료 주입량은 10 μL, 검출파장은 270 nm에서 측정하였다. 이동상으로는 A용매(0.5% formic acid in water)와 B용매(0.5% formic acid in acetonitrile)를 사용하였고, 유속은 0.8 mL/min로 하였다. 이동상의 농도구배조건은 B용매를 10분까지 4%로 일정하게 유지하였고, 32분까지 90%로 일정하게 증가시킨 후 37분까지 컬럼 세척(B, 100%)과 40분까지 B용매 0%로 급격하게 감소시켰다. 정량분석을 위한 표준용액의 제조는 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 mg/mL로 각각 조제하여 검량선을 작성한 후 계산된 함량으로 나타내었다. 여주씨의 생리활성물질의 정성분석을 위한 MS의 분석조건은 cone voltage 30 V, source temperature 120℃, desovation temperature 350℃, 고순도 N
2
가스 L/h이었으며, 분자량 측정범위는
m/z
100-1000으로 설정하였다.
- α-Glucosidase 저해활성 측정
α-glucosidase 저해활성은 합성기질인 1 mM
p
-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (
p
NPG)를 phosphate buffer (pH 6.8)에 첨가한 후 시료를 넣고 그 혼합액에 효소액 첨가 후 37℃에서 15분간 반응시키고 0.1 M NaOH를 첨가하여 반응을 종결시켜 기질인
p
NPG로부터 유리되어 나오는 반응 생성물인
p
-nitrophenol을 405 nm에서 측정하여 α-glucosidase 활성의 억제 정도를 측정하였다(
Yuk ., 2011
). 샘플 무첨가구는 negative control로 사용하였으며, 기질 무첨가구는 blank로 사용하였다. 계산식은 다음과 같다.
Inhibition rate (%)=[1-(Abs
sample
-Abs
blank
)/Abs
control
]×100, Abs
sample, blank, and control
: Absorbance of the sample, blank, and control
- 통계처리
실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 SPSS (statistical package for social sciences, Version 10.0, Chicago, USA)를 이용하여 모든 값은 mean±SD 값으로 나타내었고, 각 농도의 평균치의 통계적 유의성을
p
<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test에 의해 검정하였다.
결과 및 고찰
- 생리활성물질의 분리 및 동정
여주씨 분말 500 g을 에탄올로 침지하여 얻어진 추출물에 대하여 용매의 극성에 따라 클로로포름(chloroform)과 물층으로 분획하고 각각 농축하여 2개의 분획물을 얻었다. 각각의 분획물에 대해 순상, 역상 및 sephadex LH-20 CC를 반복실시하여 2종의 화합물을 분리하였다.
화합물 1은 백색의 분말형태로서 ESI/MS에서
m/z
305[M+H]
+
의 분자이온 peak가 관측되어 분자량을 304로 결정하였다. 특히 쪼개짐 이온(fragment ion)인
m/z
143을 갖고 있어 6탄당 한분자가 결합된 배당체 화합물임을 추측하였다.
13
C-NMR spectrum에서 10개의 carbon이 관측되었고, 화학적 이동의
δ
159.65 (C-1)에서 1개의 hydroxylated aromatic carbon 시그날이,
δ
158.87 (C-5),
δ
152.45 (C-3)에서 2개의 아미노기가 치환된 carbon 시그날이 관찰되었다.
δ
108.43 (C-1´)에서 1개의 아노머 탄소 시그날이 관찰되어 한분자의 당이 결합되어 있음을 알 수 있었고 전형적인 단당(glucose)의 carbon 시그날인
δ
77.94 (C-5´),
δ
76.50 (C-2´),
δ
73.49 (C-3´),
δ
70.17 (C-4´)를 확인하였으며, 1개의 methylene carbon
δ
61.60 (C-6´)이 관측되었다. 이러한 결과를 토대로 화합물 1은 문헌치와 비교하여 알칼로이드(alkaloid)계 화합물인 vicine으로 동정하였다(
Delfini ., 1990
).
화합물 2는 무색의 오일(oil) 형태의 클로로포름에 잘 용해되는 지용성의 물질로 ESI/MS에서
m/z
279 [M+H]
+
의 분자이온 peak가 관찰되어 분자량을 278로 결정하였다.
1
H-NMR spectrum에서
δ
6.40 (H-11), 6.17 (H-12), 6.10 (H-13), 5.99 (H-10), 5.71 (H-14), 5.39 (H-9)의 시그날로부터 olefinic methine proton 6개가 존재함을 확인하였고,
δ
2.29 (H-2), 2.19 (H-8), 2.12 (H-15), 1.61 (H-3)의 시그날로부터 ally 위치의 methylene이 관측되었다. 또한
δ
1.35 (H-4, 5, 6, 7, 16, 17)에서 다수의 methylene proton 시그날과
δ
0.93 (H-18)에서 triplet의 말단 methyl proton 시그날이 관측되었다.
13
C-NMR spectrum에서 18개의 carbon이 관측되었고
δ
179.35 (C-1)에서 carbonyl carbon과
δ
134.39 (C-14), 132.73 (C-11), 130.97 (C-9), 130.66 (C-13), 128.68 (C-10), 125.70 (C-12)에서 6개의 olefinic carbon, 33.58~21.90 사이에서 methylene 시그날과,
δ
12.87에서 terminal methyl 시그날이 확인되었다. 보다 정확한 지용성(휘발성) 성분의 동정을 위해 GC-EI/MS 분석에서 [M]
+
=278의 신뢰도 높은 모분자량의 이온값을 얻었으며, 고분해능질량분석기(HR-EIMS)를 통한 278.2250 (calc. 278.2246, err 1.5 ppm)의 소수점 4째 자리까지의 정확한 질량값을 관찰함으로써 불포화지방산인 탄소수:이중결합비(18:3)을 갖는 필수지방산임을 알 수 있었다. 또한 구조동정을 위한 표준물질과의 검출시간, 최대파장 흡수밴드(λ
max
=270.5 nm)의 비교를 통해 다가불포화지방산의 일종인 α-eleostearic acid (α-ESA)로 동정하였다(
Kai ., 2014
).
- HPLC에 의한 정량분석
여주씨에서 주요성분을 정량하기 위한 HPLC 분석조건을 검토한 결과에서
Fig. 2
에서와 같이 Phenomenex hydro-RP C
18
(250×4.60 mm, 4 μm, 80Å)의 입도(paticle size)가 작은 역상(C18)컬럼을 사용하였을 때 vicine, α-ESA 등 주요 생리활성성분의 분리능이 양호하였다. 본 연구에서는 여주씨의 에탄올 추출농도별에 대한 주요성분의 함량을 분석하기 위해 상기의 두 성분을 지표성분으로 최종 설정하여 표준정량곡선을 작성하였다. 최적의 HPLC 분석조건하에서 얻어진 표준정량곡선에서는 vicine (1), α-ESA (2) 성분이 10, 50, 100, 500, 1000 μg/mL 농도 범위에서 회귀식이 각각
y
=28869x+23910,
y
=14983x+6838.4이고, 상관계수(r
2
) 값이 각각 0.9998, 0.9999로서 피크면적(y)과 성분들의 농도(
x
) 사이에 고도의 직선성을 확인할 수 있었다.
Positive ion mass spectrum acquired by HPLC-ESI/MS analysis of vicine (A) and α-eleostearic acid (B).
에탄올의 농도를 달리하여 여주씨의 추출물을 제조한 후 각 추출물의 지표성분 함량을 분석한 결과는
Table 1
과 같았다. 추출수율이 가장 높았던 70% 에탄올 추출물 중 vicine, α-ESA 함량은 각각 3.34±0.3, 21.7±2.1 mg/g이었다. vicine (1)의 경우 물, 30%, 50%, 70%, 95% 에탄올 추출물까지 각각 7.10±0.4, 4.60±0.3, 3.98±0.4, 3.34±0.4, 0.52±0.1의 함량을 나타내었으며, 극성도가 증가할수록 다량 추출되었고 95% 에탄올 추출물에서는 그 함량이 현저히 줄어들었다. 반면 α-eleostearic acid (2)의 경우 에탄올 농도별 추출물은 각각 ND(검출안됨), 0.59±0.1, 10.9±0.9, 21.7±2.1, 23.5±1.7의 함량을 나타내었고 특히, 50% 에탄올 이상의 지용성물질의 추출조건에서 그 함량이 지속적으로 증가하였다. 이러한 경향은 vicine 성분의 추출은 95% 에탄올보다는 극성이 훨씬 높은 물 추출 혹은 70% 에탄올 이하의 폴라(polar)한 조건에서 추출하는 것이 성분 용출에 더 용이함을 시사하고 있으며, 동일한 추출 조건에서 α-eleostearic acid는 95% 에탄올 추출물의 함량이 23.5±1.7으로 가장 높은 것으로 보아 50% 에탄올 이상의 non-polar한 조건에서 추출하는 것이 성분 용출에 더 용이함을 확인할 수 있었다(
Fig. 3
). 이상의 결과를 토대로 추출수율과 지표성분의 함량을 고려할 때, α-glucosidase에 저해활성을 나타내는 여주씨 분말 시료에 대한 최적의 추출조건은 α-eleostearic acid 성분이 다량 추출되는 조건인 95% 에탄올의 조건인 것으로 판단된다.
The contents of vicine (1) andα-eleostearic acid (2) in various extracts from the seeds ofMomordica charantia
a) Extract contents at 270 nm are given as mg/g dry weight b) All values are means±SD (n=3) c) ND=not detected
HPLC-PDA profiles (at 270 nm) of vicine (1) and α-eleostearic acid (2) in seeds extracts from the five different polarity solvents.
- α-Glucosidase 저해활성 측정
에탄올 농도별에 따른 다양한 여주씨 추출물 및 주요성분의 α-glucosidase 저해활성은
Table 2
에 나타내었다.
p
NPG를 기질로 사용한
in vitro
yeast α-glucosidase 저해활성결과, 물 추출물 및 30% 에탄올 추출물에서는 1000 μg/mL의 측정농도에서 저해율이 10% 미만으로 나타났고, 50%, 70%, 95% 에탄올 추출물의 저해율은 각각 62%, 72%, 80% 이상으로 높게 나타났다. 가장 저해활성이 높은 95% 에탄올 추출물은 농도 의존적으로 목표 효소를 저해하였으며, 단계별로 희석한 검체들의 효소 저해율을 근간으로 산출된 50% 효소활성 저해농도(IC
50
)는 88.7 μg/mL로 나타났다. 따라서 여주씨 추출물에 함유된 α-glucosidase 효소활성 저해성분들은 주로 non-polar한 추출물에 분포하는 것으로 예측되어 분리한 단일성분들의 저해활성을 검증하였다.
Inhibitory effects of the seed extract ofMomordica charantiausing different solvents and vicine (1) andα-eleostearic acid (2) onα-glucosidase inhibitory activities
a) All compounds were examined in a set of experiments repeated three times; IC50 values of compounds represent the concentration that caused 50% enzyme activity loss b) Sample concentration was 1000 μg/mL
Vicine(1)은 극성도가 매우 높은 물질로서 α-glucosidase에 대해 1000 μg/mL의 측정농도에서 저해율이 13% 이하로 목표효소에 대한 저해효과를 나타내지 못했다. 반면 α-eleostearic acid (2)는 활성이 기대되는 non-polar한 물질로서 동일한 측정농도에서 저해율 90% 이상의 강력한 저해 효과를 나타내었다. 또한 농도 의존적으로 α-glucosidase를 저해하였으며, IC
50
값은 43.4 μg/mL으로 α-glucosidase의 치료제 및 대조약물로 사용되는 DNJ (IC
50
=124 μg/mL)보다 약 3배 가까이 우수한 저해효과를 확인하였다. 따라서 여주씨 추출물에서 저해효과가 가장 우수한 95% 에탄올 추출물 및 그 속에 다량 함유된 생리활성물질인 α-eleostearic acid는 α-glucosidase 저해 효과에 중요하게 기여하고 있음을 나타내며, 식후의 혈당 상승을 억제시켜 줄 수 있는 잠재력이 있음을 확인하였다.
Acknowledgements
This study was funded by a Research Program for Agricultural Science & Technology Development (PJ01000304) and Postdoctoral Fellowship Program of Rural Development Administration, Korea.
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